Summary
在这个协议中，我们提出在建立强直性肌营养不良1成肌细胞模型，包括优化C2C12细胞维持，基因转染/转导，和肌细胞分化的步骤。
Abstract
强直性肌营养不良1（DM1）是肌营养不良的一种常见形式。尽管一些动物模型已经建立了DM1，因为它们提供用于研究细胞和分子事件的有效的细胞替代成肌细胞模型仍然是重要的。虽然C2C12成肌细胞已被广泛用于研究肌形成，抗性基因转染或病毒转导，阻碍研究在C2C12细胞中。在这里，我们描述了一种优化的协议，包括日常维护，转染和转导过程的基因引入C2C12细胞和肌细胞分化的诱导。总的来说，这些程序使最佳的转染/转导效率，以及一致的分化的结果。在建立DM1成肌细胞模型将受益强直性肌营养不良的研究，以及其它肌肉疾病中描述的协议。
Introduction
强直性肌营养不良（DM）是一种常染色体显性疾病，影响多个系统，最显着的心脏和骨骼肌1。有此疾病，DM1和DM2的两个亚型。 DM1是比较常见的，并且具有更严重的表现比DM2 2。遗传突变底层DM1是位于3'非翻译区域的DM蛋白激酶基因（DMPK）3（UTR）的CUG三联体重复序列的扩张。在未受影响的个体的CUG重复次数变化从5到37相反，它增加了50多个，有时多达数千DM1患者4。其结果是，RNA结合蛋白，如的muscleblind样1（MBNL1），CUGBP和ELAV样家族1（Celf1），是misregulated。由于对扩大CUG重复封存，MBNL1失去其调节可变剪接5的能力。 Celf1，在另一方面，上调6,7。 Celf1的过度表达与肌肉相关的损失和虚弱，这是不归因于MBNL1功能丧失。动物模型模拟DM1相关改变，包括DMPK 3'-UTR CUG扩张，MBNL1的损失，和Celf1的过表达，已经确立。然而，在成肌细胞建模DM1提供了一个有效的替代，特别是对于解剖DM1相关的细胞和分子事件。
C2C12成肌细胞系最初从受伤的C3H小鼠肌肉中分离，并广泛用于研究肌分化8,9。 C2C12细胞快速增殖中的胎牛血清（FBS）的含介质和容易当FBS的耗尽经历分化。然而，使用这种成肌细胞分化模型提出了两个挑战：C2C12细胞往往是基因转染/病毒转导性;并在细胞处理和分化过程的细微变化可导致肌管形成显着的变化。
我们的实验室经常使用C2C12细胞作为交流ELL模型，并开发了有效地提供质粒转染，逆转录病毒转导和慢病毒转基因导入C2C12细胞系10协议。在视频中，我们展示了用于转染/转导C2C12细胞并保持在建立DM1成肌细胞分化模型的一致性进行了优化程序。
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Protocol
1. C2C12细胞培养
- 维持在生长培养基中100毫米板C2C12小鼠成肌细胞（Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM））补充有20％胎牛血清，100U / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，和2mM L-谷氨酰胺。允许C2C12传代细胞变成约50 - 60％汇合。
- 弃去生长培养基和洗涤C2C12细胞用3ml室温磷酸盐缓冲盐水（PBS）。除去PBS中并加入500微升的0.25％胰蛋白酶-EDTA分离细胞。放置板在37℃，5％CO 2培养箱3 - 5分钟。
- 通过加入3ml生长培养基中和胰蛋白酶。吸管6 - 8倍以悬浮细胞。 1毫升悬浮的细胞的增加了100毫米的钢板，并在37℃，5％的CO 2下孵育。
2. C2C12细胞转染/转导和选择
- C2C12质粒转
- 24小时在转染前，对晚7.0×10 5个的C2C12细胞成每个转染的六孔板的一个孔中。
注意：这导致50 - 由转染时60％汇合。 - 允许转染试剂来在使用前室温。
- 添加质粒DNA（GFP-CUG5或GFP-CUG200）2微克到200微升简要预热无血清培养基中并涡旋。添加6微升转染试剂的培养基，并使用涡旋立即混合30秒。孵育混合物，在室温下30分钟。
- C2C12细胞的媒体改变到2.5毫升的无血清生长培养基。转染混合物加入到细胞培养后。返回板，以5％的CO 2，37℃培养箱中。
- 保持在转染混合物/无血清生长培养基将细胞4小时或最多过夜。更换介质回到生长培养基第二天或当细胞毒性是明显的。
注意：细胞毒性由CE的显微镜检查评估LLS。观察细胞形态和细胞分离的变化。只要没有明显的细胞毒性，在无血清生长培养基孵育过夜增强转染。 - 选择的细胞在转染后48小时，加入1.2 - 1.6毫克/毫升的G418为约10天，直到对照培养（不含质粒转）没有活细胞。改变媒体每两天用补充有G418的生长培养基。
- 维持在生长培养基中和5％的CO 2的G418抗性细胞在37℃，随后的实验。
- 24小时在转染前，对晚7.0×10 5个的C2C12细胞成每个转染的六孔板的一个孔中。
- 逆转录病毒制剂和C2C12逆转录病毒转导
- 通过用10％胎牛血清，100U / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，和2mM L-谷氨酰胺补充的DMEM高糖制备HEK 293培养基中。
- 约24小时前转，板4.0×10 6嗜性为主HEK 293包装细胞100毫米板（转染80％融合）Containing细胞培养基。
- 允许转染试剂来在使用前室温。
- 在1ml无血清生长培养基中混合15微克质粒DNA（的pMSCV-迪普罗或的pMSCV-Celf1Flag-迪普罗）。涡简要介绍。添加从步骤2.2.2 30微升转染试剂到DNA /无血清生长培养基管，并用涡流充分混合。在室温下孵育该混合物30分钟。
- 转染混合物滴加加入到基于293亲嗜性的HEK包装细胞。轻轻地摇晃板，并返回他们回到5％的CO 2，37℃培养箱。 24小时后，介质改变至10ml预热的新鲜生长培养基。
- 收获上清液（含逆转录病毒）使用移液管在转染后48小时，将上清液转移到50毫升离心管中。 10毫升新媒体热烈添加到平板，并返回到孵化器。保持上清液在4℃下。
注意：介质缓慢加入到t他阱的侧面，以便不破坏细胞单层。 - 收获了第二批60上清液小时转染后，并与2.2.5上清池吧。离心机在500 xg离心，4℃7分钟以去除细胞碎片。
- 将上清转移到新的50ml离心管中。使用逆转录病毒通过进到步骤2.2.9或等分试样并将上清液储存在-20℃以供将来使用转导C2C12细胞在这一点上。
- 解冻从2.2.7逆转录病毒在室温下，如果在冻结的股票这里使用。
注意：避免多次冻融。 - 板在转导瞄准30的同一天C2C12细胞 - 汇合的40％。
- 弃去生长培养基和洗涤C2C12细胞用3ml室温PBS中。除去PBS，加入500μl0.25％胰蛋白酶-EDTA，并在37℃，5％CO 2培养箱3孵育板- 5分钟。
- 通过加入3ml生长MED中和胰蛋白酶IUM。吸管6 - 8倍以悬浮细胞。算使用血球细胞和8.0×10 5个 C2C12细胞添加到60毫米板。
- 将0.5ml的逆转录病毒感染细胞的一次60毫米的钢板在3毫升生长培养基。返回板的孵化器。
- 感染后48小时 - 3辅以抗生素的选择（3微克/毫升嘌呤霉素1）毫升的新鲜介质替换。每天更换抗生素3毫升培养基〜5日，直至未转C2C12控制文化死了。
- 通过用10％胎牛血清，100U / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，和2mM L-谷氨酰胺补充的DMEM高糖制备HEK 293培养基中。
- 慢病毒编制和C2C12慢病毒转导
注：在生物安全水平执行所有的慢病毒有关的程序2柜，并按照生物安全准则。含有病毒废液必须在处置之前消毒。- 板4.0×10 6个 293T细胞在100mm的板（〜在转染的当天80％汇合）用HEK 293细胞培养基（DMEM高葡萄糖，补充有10％胎牛血清，100U / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，和2mM L-谷氨酰胺）转染前24小时。
- 暖转染试剂至室温。混合慢病毒包装载体（4微克pMD2.G和6微克psPAX2）连同8微克慢病毒转移载体（Celf1的shRNA或加扰对照shRNA）的1ml无血清细胞培养基。涡简要介绍。
- 添加36微升预热转染试剂与DNA / DMEM中管和通过涡旋混合均匀。在室温下孵育该混合物30分钟。
- 从培养箱中取出293T细胞和转染混合物加入到板中。轻轻旋转盘，然后返回到5％的CO 2，37℃培养箱。 24小时后，更换用10ml新鲜培养基中的转染混合物。
- 收集含上清液慢病毒48小时转染后，并将其转移到50毫升离心管中。加入10 mL新媒体热烈的板块，并将其返回孵化器。储存在4℃的上清液。
- 收集第二批上清液60小时转染后，用上清从2.3.5相结合。在500 XG，4℃进行7分钟后短暂离心。
- 将上清转移到新的50ml离心管中。如果使用新鲜的病毒，请继续步骤2.3.9。以供将来使用，含病毒的商店上清液在10毫升等份-20℃。
- 在室温下在使用前从2.3.7解冻病毒，如果使用一个冷冻的储存。
注意：避免多次冻融。 - 作为转导的同一天在2.2.9中描述板的C2C12-CUG200细胞（2.1节中获得）。
注：瞄准30 - 汇合的40％。 - 将0.5ml病毒感染C2C12-CUG200的60毫米板与板返回孵化器。
- 转导后72小时 - 用补充有选择抗生素（3微克/毫升嘌呤霉素1）的新鲜培养基替换培养基。文化传媒每天刷新的选择抗生素〜5日，直到所有未转染C2C12-CUG200控制文化死了。
- 使用免疫印迹核实GFP-CUG200转染细胞Celf1击倒。
3. C2C12细胞分化
- 板2×10 6个细胞在6孔板的一个孔在2.5ml生长培养基中24小时分化的开始之前。
注意：铺板密度可以被调整，使得在24小时达到满汇合。- 冲洗融合细胞用PBS和加入2.5倍毫升低血清分化培养基（Dulbecco改进的补充有2％马血清的Eagle培养基，100U / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和1μM胰岛素） 。更换培养基每两天。
注意：保持股票胰岛素冻结，并在各媒体更改添加到媒体。
- 冲洗融合细胞用PBS和加入2.5倍毫升低血清分化培养基（Dulbecco改进的补充有2％马血清的Eagle培养基，100U / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和1μM胰岛素） 。更换培养基每两天。
- 在C2C12分化，收集全样本titative RT-PCR（见第4节）在下列时间点：Day0，1，2，4，和6工艺在第6天免疫染色文化 - 8（见第5节）。
4. RNA分离和定量RT-PCR
- 使用制造商的方案进行RNA分离。分离后，悬浮在30微升不含RNA酶的水RNA沉淀和吸管上下几次。
注：样品可以进行到定量RT-PCR，也可以储存在-80℃。 - 使用RT qPCR试 剂盒定量RT-PCR 10和遵循制造商的指示。根据表1制备的反应混合物中。
| 零件 | 体积（微升） | 终浓度 |
| 2X反应缓冲液 | 10 | 1X |
| 正向引物 | 0.5 | 200纳米 |
| 反向引物 | 0.5 | 200纳米 |
| 探测 | 0.5 | 200纳米 |
| 逆转录酶和RNA酶抑制剂 | 0.1 | 0.25单位/毫升 |
| 模板 | 1 | 100纳克总RNA |
| 核糖核酸酶自由水 | 7.4 | NA |
| 总混音 | 20 |
表1.定量RT-PCR主混合物制备
- 运行使用温度曲线表2中的20微升RT-qPCR实验。
| 逆转录步骤 | 30分钟，48℃ |
| DNA聚合物酶的激活/逆转录酶失活 | 10分钟，95℃ |
| 40个循环 | 15秒，95℃ |
| 1分钟，60℃下 |
表2.定量RT-PCR热分布
5.免疫染色
- 固定单层培养在2.5ml新鲜制备的4％低聚甲醛/ PBS在室温下10分钟。
- 透化的样品在2.5ml 0.1％的Triton X-100 / PBS在室温下30分钟。
- 转移样品的潮湿室中。在2.5ml在37℃下进行30分钟封闭缓冲液（0.1％的非离子表面活性剂/ PBS，10％正常山羊血清）块中的样本。
- 丢弃封闭缓冲液，并应用800微升初级抗体抗肌球蛋白重链在封闭缓冲液（1：100）稀释。孵育在室温下的潮湿室中过夜。
- 洗板3恬ES用2.5ml洗涤缓冲液，第2天（0.1％聚山梨醇酯20 / PBS）（各10分钟）。
- 除去洗涤缓冲液，并应用800微升二抗（山羊抗小鼠IgG，1：500在PBS中稀释）。孵育在湿润室中于室温下1小时。
- 洗两次（每次10分钟）用2.5ml洗涤缓冲液。
- 用800微升的DAPI（1微克/毫升，在蒸馏去离子水2 O稀释）5分钟孵育。
- 用2.5ml洗涤缓冲液再次洗涤10分钟。
- 改变洗涤缓冲液2.5毫升的PBS，并使用荧光显微镜来拍摄图像。
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Representative Results
C2C12细胞与GFP-CUG5或GFP-CUG200染。耐药性选择后，稳定集合建立，其可以通过GFP表达（ 图1A）被可视化。在分化的成肌细胞肌管形成通过肌球蛋白重链的免疫染色10（ 图1B）进行检测。肌管形成的定量表明，融合指数从35.4±4.1％下降到2.6±1.1％和肌管领域，从35.6±2.2％的GFP CUG200（ 图1C）下降至2.7±0.8％由异常CUG扩张。的熔融指数和肌管领域经由核的由核的总数和总图像区域由肌管，分别覆盖的百分比除以肌管（≥2核）的总数进行计数。实时RT-PCR检测10被进行分析表达为一些肌肉不同的iation相关的基因，包括的MyoD，MyoG基因，MEF2C和Celf1。相比CUG5文化，CUG200在分化的开始增殖的成肌细胞增加Celf1 mRNA的表达。一致与以前的报告，Celf1上调与CUG-扩张肌营养不良1（ 图1D）有关。此外，Western印迹10一致显示Celf1蛋白水平升高（ 图1E），并CUG200分化（ 图1D）中抑制的MyoD，MyoG基因和MEF2C的表达。这些结果表明，该CUG膨胀导致肌管缺陷和受损成肌细胞分化。
研究Celf1在成肌细胞分化的作用，pMSCV- Celf1Flag逆转录病毒载体构建转导C2C12细胞。10嘌呤霉素-抗性克隆合并用于分化的研究。 Western blot检测结果表明，旗-TAgged Celf1只是在的pMSCV-Celf1Flag转导培养本和Celf1蛋白的表达上调（ 图2A）。相比于对照培养物（ 图2B），这表明Celf1的过表达严重损害成肌细胞分化时在Celf1过度表达细胞肌管的形成是罕见的。
要确定是否Celf1击倒在抢救CUG膨胀细胞分化不足，Celf1 shRNA的是由慢病毒载体运送到GFP-CUG200细胞。双抗性克隆（G418和嘌呤霉素）被选定并汇集了分化的研究。内源性Celf1蛋白的水平在Celf1的shRNA（ 图 3A）的存在显着降低。后分化6天，Celf1的shRNA对提高肌管形成的影响是明显的（ 图3B）。融合指数和肌管是如分别为16.1±3.0％和15.2±1.2％，相比4.6±0.8％，而在对照培养物（ 图3C）5.1±1.3％。同时，实时RT-PCR结果表明，MyoD的，MyoG基因和MEF2C的表达Celf1 shRNA的细胞（ 图3D）支承Celf1击倒救出肌细胞分化缺陷被显著增加。
图1：CUG-膨胀抑制心肌细胞分化的C2C12细胞。 （A）C2C12细胞中表达，选择后GFP-CUG5或GFP-CUG200无处不在。比例尺是100微米。这个数字已经从我们以前的纸10修改。（B）肌管形成于GFP-CUG5细胞，但在少GFP-CUG200细胞。肌管由肌球蛋白重链（MF-20）免疫染色可视化。比例尺是100微米。（C）的 （D）Celf1的实时RT-PCR分析，转录成肌细胞分化过程中的因素的MyoD，MyoG基因，和MEF2C的表达。 mRNA水平后的GAPDH标准化作图。误差棒代表标准偏差。进行学生T检验，以测试比较对照。 N> 3，* P <0.05。（E）GFP-CUG200转增加Celf1蛋白的表达。 ß-actin的显示为装载控制。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.表达Celf1削弱成肌细胞分化的。外源性Celf1Flag expre（一）证明裂变在C2C12细胞免疫印迹。（B）肌管形成在Celf1Flag过度表达的C2C12细胞受损。肌管是由MF-20染色可视化。比例尺是100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. Celf1部分解救CUG -膨胀-诱导成肌细胞分化虚寒击倒。 （A）采用Western blot Celf1击倒的证明。（B）Celf1 shRNA的诱导肌小管在GFP-CUG200成肌细胞的形成。肌管是由MF-20染色可视化。比例尺是100微米。（℃）Celf1的shRNA救出细胞增加了熔融指数和肌管领域。误差棒代表标准偏差。（D）Celf1的实时RT-PCR分析，转录分化过程中MyoD的因素，MyoG基因和MEF2C的表达。 mRNA水平归到GAPDH的后作图。误差棒代表标准偏差。进行学生T检验，以测试比较的控制。 N> 3，* P <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
C2C12细胞系已被用作一个模型来研究肌形成11-14。这些细胞保留了成纤维细胞样外观，在含有20％胎牛血清媒体快速增殖和在含有2％马血清15媒体容易区分。快速生长和分化是在成肌细胞模型有利的特性。在这里，我们演示了如何使用质粒，逆转录病毒和慢病毒载体引进的cDNA，3'-UTR，和shRNA进入C2C12细胞。转染/转导和分化维护一致性的关键点如下。
在每日细胞维持细胞密度是至关重要的。这些细胞需要低于50进行培养 - 70％汇合。由于短倍增时间，放置过夜时，高汇合（> 70％）C2C12文化自发区别。而自发分化的细胞的分数可以是小的，存在的分化的细胞，将有助于在随后的分化实验不一致。具有低传代次数。此外，刚解冻的C2C12细胞是优选的。对于分化，细胞在预先确定的号码，这样他们在24小时后达到完全融合电镀。胰岛素是小的等分试样冷冻保存且每个分化培养基改变时被添加。这些措施提高分化的结果。
无血清培养基中增强C2C12细胞转染。该细胞可以在转染混合物/无血清培养基中保温过夜。在我们的实验室，我们实现了高达20％的转染率，伴随着细胞毒性轻微迹象。用于选择C2C12细胞的药物浓度较高，为1.2〜1.6毫克/毫升的G418或1至3微克/ ml嘌呤霉素，以及选择的持续时间比大多数其他细胞系更长。由于高药物浓度下，潜在的毒性和延长潜伏期，批与批在分化潜能的变化可能出现。关键的是要调整基于细胞形态的选择方案（浓度和持续时间）和治疗实验组和对照组在一起。
我们已经成功地推出了GFP-CUG200成再现DM1 3'-UTR CUG扩展C2C12细胞。引入Celf1到C2C12细胞和Celf1的shRNA到GFP-CUG200 C2C12细胞已经允许通过Celf1上调和定位Celf1帮助DM1成肌细胞分化，分别探索触发细胞和分子事件的评价。总之，这里提出的成肌细胞C2C12受益模型强直性肌营养不良以及一般的肌肉细胞生物学和肌分化的调查。该模型的限制是，在细胞系中的结果可能不完全延伸到生物体。在当前的模型研究结果经常被提前到动物隔离新鲜的成肌细胞，并研究他们的不同点化。最终，我们证实在成肌细胞的生物研究结果。
本研究的独特优势是在C2C12细胞，这使得能够模拟在DM1顺序遗传/病态事件的多层基因操作。此前，DMPK CUG扩张的RNA毒性作用记录在成肌细胞11-14，而Celf1的病理作用在小鼠模型16,17分别研究。这些建模连续遗传/病理事件在技术上具有挑战性和时间，如果在动物模型中进行消费。如在本研究表明，联合使用荧光灯和耐药标记允许在强直性肌营养不良额外分子事件建模。本研究建立的模型是在解剖中DM1发病的详细机制有用的。他们也将是筛选针对DM1发病的不同步骤的药物价值。这些战略和本程序研究可能在成肌细胞建立其他肌肉疾病模型线索。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
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