Summary
בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.
Abstract
Myotonic ניוון 1 (DM1) היא צורה נפוצה של ניוון שרירים. למרות במודלים של בעלי חיים כמה הוקמו DM1, מודלי תא myoblast הם עדיין חשובים משום שהם מציעים אלטרנטיבה הסלולר ביותר ללימוד אירועים תאיים ומולקולריים. למרות תאים myoblast C2C12 כבר בשימוש נרחב ללמוד myogenesis, עמידות transfection הגן, או התמרה ויראלית, מעכבת מחקר בתאי C2C12. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה הכולל תחזוקה יומית, נהלי transfection התמר להציג גנים לתוך myoblasts C2C12 ואת האינדוקציה של בידול myocyte. ביחד, נהלים אלה לאפשר יעילות transfection / תמרה הטובות ביותר, כמו גם תוצאות בידול עקביות. הפרוטוקול המתואר בהקמת מודלי תא myoblast DM1 ירוויח לחקר ניוון myotonic, כמו גם מחלות שרירים אחרות.
Introduction
ניוון Myotonic (DM) הוא מחלה דומיננטית אוטוזומלית המשפיעה מערכות מרובות, בעיקר שרירי לב שלד 1. ישנם שני תת סוגים של המחלה הזאת, DM1 ו DM2. DM1 נפוץ יותר ויש לו ביטוי חמור יותר DM2 2. המוטציה הגנטית הבסיסית DM1 היא רחבה של חזרות שלישיית CUG הממוקמות באזור המתורגם '3 (UTR) של גן החלבון קינאז DM (DMPK) 3. מספר חוזרי CUG אצל אנשים לא מעושה משתנה בין 5 ל 37. לעומת זאת, היא מגדילה ליותר מ -50, ולפעמים עד אלף בחולי DM1 4. כתוצאה מכך, חלבונים קושרי RNA, כגון muscleblind דמוי 1 (MBNL1), CUGBP, ו Elav-כמו משפחה 1 (Celf1), הם misregulated. בשל התפיסה על חזרות CUG המורחבות, MBNL1 מאבד את יכולתו לווסת שחבור חלופי 5. Celf1, ומצד שני, הוא למעלה מוסדר 6,7. התבטאות יתר של Celf1 קשורה לאובדן שרירחולשה, אשר אינן מיוחסות אובדן תפקוד MBNL1. במודלים של בעלי חיים לדמות שינויים הקשורים DM1, ובכלל זה, הרחבת DMPK 3'-UTR CUG, אובדן MBNL1, ואת יתר של Celf1, הוקמו. עם זאת, דוגמנות DM1 ב myoblasts מציעה אלטרנטיבה יעילה, במיוחד עבור לנתח הקשורות DM1 אירועים תאיים ומולקולריים.
C2C12 שורת תאי myoblast בודד לראשונה מ שריר עכבר C3H נפצע בשימוש נרחב ללמוד 8,9 בידול myogenic. תאי C2C12 להתרבות במהירות בסרום שור עובר (FBS) המכיל תקשורת לעבור התמיינות בקלות כאשר FBS ייגמר. עם זאת, באמצעות מודל בידול myoblast זה מציג שני אתגרים: תאי C2C12 הם בדרך כלל עמידים בפני transfection גן / תמרה ויראלית; ו שינויים קלים טיפול תא הליך בידול יכולים להוביל לשינויים חדים בהשקעות myotube.
המעבדה שלנו באופן שגרתי משתמש myoblasts C2C12 כמו acell מודל פתח פרוטוקולים להעברת גנים ביעילות על ידי transfection פלסמיד, תמרת retroviral, תמרת lentiviral לתוך תא C2C12 קו 10. בסרטון, אנחנו מדגימים את הנהלים אופטימיזציה עבור transfecting / transducing C2C12 תאים ושמירה על עקביות בידול בהקמת מודלים myoblast DM1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאי C2C12
- לשמור myoblasts העכבר C2C12 בצלחת 100 מ"מ במדיום הגידול (המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)) בתוספת 20% בסרום שור עוברית, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -2 מ"מ L- גלוטמין. אפשר תאי passaged C2C12 להיות כ 50 - 60% ומחוברות.
- מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ"ל בטמפרטורת החדר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). הסר את PBS ולהוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA כדי לנתק את התאים. מניחים את צלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 3 - 5 דקות.
- לנטרל את טריפסין על ידי הוספת מדיום הגידול 3 מ"ל. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. הוסף 1 מ"ל של תאים מושעה לצלחת 100 מ"מ חדש לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
2. Transfection Cell C2C12 / התמרה בחירה
- transfection פלסמיד C2C12
- 24 שעות לפני transfection, עמ '7.0 מאוחר x 10 5 C2C12 תאים לתוך אחד טוב של צלחת שש היטב עבור כל transfection.
הערה: זה מוביל 50 - 60% מפגש ידי בזמן transfection. - אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- הוסף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (GFP-CUG5 או GFP-CUG200) לתוך 200 μl מחומם מראש בינוני חופשי בסרום ו מערבולת בקצרה. הוסף מגיב transfection 6 μl למדיום ומערבבים מיד למשך 30 שניות בעזרת מערבולת. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- שנה את התקשורת של תאי C2C12 2.5 מ"ל מדיה סרום ללא צמיחה. מוסיפים את תערובת transfection לתאים לאחר דגירה. החזר את הצלחות על 5% CO 2, 37 ° C חממה.
- שמור את התאים ב תערובת transfection / מדיה סרום ללא צמיחה עבור 4 שעות או עד הלילה. שינוי תקשורת חזרה תקשורת הצמיחה למחרת או כאשר cytotoxicity ניכר.
הערה: Cytotoxicity נבחנת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של ceLLS. בוחן את שינויי מורפולוגיה תאי ניתוק תא. כל עוד אין cytotoxicity גלויה, דגירה לילה במדיה סרום ללא צמיחה משפרת transfection. - בחר את התאים 48 שעות לאחר transfection ידי הוספת 1.2 - G418 1.6 מ"ג / מ"ל עבור ~ 10 ימים עד שהתרבות מלאה (טרנספקציה ללא פלסמידים) אין תאים חיים. שנה את התקשורת כל יומיים עם התקשורת צמיחה בתוספת G418.
- לשמור על התאים G418 עמידים במדיום הגידול ו 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך הניסויים הבאים.
- 24 שעות לפני transfection, עמ '7.0 מאוחר x 10 5 C2C12 תאים לתוך אחד טוב של צלחת שש היטב עבור כל transfection.
- הכנת רטרו-וירוס תמרת retroviral C2C12
- הכן בינוני תרבות HEK 293 על ידי השלמת גלוקוז DMEM גבוהה עם 10% בסרום שור עוברית, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -2 מ"מ L- גלוטמין.
- כ 24 שעות לפני transfection, צלחת 4.0 x 10 6 ecotropic HEK תאי אריזת 293 מבוססים בבית (מפגש 80% ב transfection) 100 מ"מ צלחת גתרבית תאים בינוני ontaining.
- אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- מערבבים 15 מיקרוגרם DNA פלסמיד (pMSCV-Puro או pMSCV-Celf1Flag-Puro) ב 1 בינוני מ"ל סרום ללא צמיחה. בקצרה וורטקס. הוסף 30 מגיבים transfection μl משלבים 2.2.2 לתוך צינור מדיום גידול DNA / סרום ללא, ומערבבים בעזרת מערבולת היטב. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הוסף dropwise תערובת transfection אל HEK ecotropic מבוסס 293 תאי האריזה. מערבולת בעדינות את הצלחות ולהחזיר אותם בחזרה 5% CO 2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, לשנות את התקשורת עד 10 מיליליטר מחומם מראש מדיום גידול טרי.
- קציר supernatant (המכיל רטרו-וירוס) 48 שעות לאחר transfection בעזרת פיפטה ולהעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הוסף 10 מיליליטר של תקשורת החמה החדשה לצלחת ולהחזיר אותו אל האינקובטור. שמור את supernatant על 4 מעלות צלזיוס.
הערה: התקשורת מתווספת בעדינות כדי לאהוא בצד של הבאר כדי לא לשבש את monolayer התא. - קציר את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection וברכה זה עם supernatant מ 2.2.5. צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר.
- מעבירים את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חדש. השתמש רטרו-וירוס כדי transduce תאים C2C12 בשלב זה על ידי שתמשיך לשלב 2.2.9 או aliquot ולאחסן את supernatant ב -20 ° C לשימוש עתידי.
- ההפשרה רטרו-וירוס מ 2.2.7 בטמפרטורת החדר, אם מניה קפוא משמש כאן.
הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. - פלייט תאי C2C12 באותו היום של התמרה המכוונת במשך 30 - 40% של מפגש.
- מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ"ל בטמפרטורת החדר PBS. הסר את PBS, להוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA, דגירה צלחת 2 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO עבור 3 - 5 דקות.
- לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל med צמיחהium. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהוסיף 8.0 x 10 5 C2C12 תאים לצלחת 60 מ"מ.
- הוסף 0.5 מ"ל רטרו-וירוס להדביק צלחת אחת 60 מ"מ של תאים בתקשורת צמיחה 3 מ"ל. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור.
- החלף עם 3 מ"ל התקשורת טריים בתוספת אנטיביוטיקה הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מ"ל) 48 שעות לאחר ההדבקה. החלף 3 מ"ל בינוני עם אנטיביוטיקה כל יום במשך ~ 5 ימים עד שהתרבות מלאה C2C12 untransduced גוועת.
- הכן בינוני תרבות HEK 293 על ידי השלמת גלוקוז DMEM גבוהה עם 10% בסרום שור עוברית, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -2 מ"מ L- גלוטמין.
- הכנת Lentivirus ו התמר lentiviral C2C12
הערה: בצע את כל ההליכים הקשורים lentivirus ב בטיחות ביולוגית רמה 2 ארון ולפעול בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגיות. פסולת נוזלית בעלת הנגיף יש לחטא לפני סילוק.- פלייט 4.0 x 10 6 293T תאים בצלחת 100 מ"מ (~ 80 מפגש% ביום של transfection) עם תרבית תאים בינוניים HEK 293 (גלוקוז DMEM גבוהה, בתוספת 10% עובריתבסרום שור, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -2 מ"מ L- גלוטמין) 24 שעות לפני transfection.
- מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר. מערבבים את וקטורים אריזה lentiviral (4 מיקרוגרם pMD2.G ו -6 מיקרוגרם psPAX2) יחד עם וקטור העברת 8 מיקרוגרם lentiviral (Celf1 shRNA או מקושקשות shRNA שליטה) ב 1 בינוני מ"ל תרבית תאים חופשית בסרום. בקצרה וורטקס.
- להוסיף 36 μl מגיב transfection מחומם מראש ל הצינור DNA / DMEM ומערבבים היטב על ידי מערבולת. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הסרת תאי 293T מן החממה ולהוסיף לתערובת transfection לצלחת. מערבולת בעדינות את הצלחת ולהחזיר אותו בחזרה 5% CO 2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, להחליף את תערובת transfection עם המדיום תרבות טרי 10 מ"ל.
- אסוף את lentivirus supernatant המכיל 48 שעות לאחר transfection ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הוסף 10 מדיה חמה חדשה מיליליטר לצלחת ולהחזירוחממה. אחסן את supernatant על 4 מעלות צלזיוס.
- אסוף את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection, ולשלב אותו עם supernatant מ 2.3.5. בקצרה צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
- מעבירים את supernatant לתוך צינור 50 מ"ל צנטריפוגות טריים. אם אתה משתמש וירוס טרי, המשך לשלב 2.3.9. לשימוש עתידי, חנות וירוס המכילים supernatant ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של 10 מ"ל.
- להפשיר מהווירוס 2.3.7 בטמפרטורת החדר לפני השימוש, אם מניה קפוא משמש.
הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. - פלייט תאי C2C12-CUG200 (המתקבלים בסעיף 2.1) כמתואר 2.2.9 באותו היום של תמרה.
הערה: כוון 30 - 40% של מפגש. - הוסף 0.5 מ"ל וירוס להדביק צלחת 60 מ"מ של C2C12-CUG200 ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור.
- החלף את מדיום התרבות עם תקשורת טריה בתוספת אנטיביוטיקת הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מיליליטר) 72 שעות לאחר תמרה.רענן היומיום תקשורת והתרבות עם אנטיביוטיקת הבחירה ~ 5 ימים עד שכל התרבות מלאת C2C12-CUG200 untransduced גוועת.
- השתמש כתם מערבי לאמת מציאת Celf1 בתאי transfected GFP-CUG200.
3. התמיינות תאים C2C12
- פלייט 2 x 10 6 תאים אחד טוב של צלחת 6-היטב 2.5 מיליליטר תקשורת צמיחת 24 שעות לפני תחילת הבידול.
הערה: צפיפות הציפוי עשויה להיות מותאמת כך מפגש מלא הוא הגיע ב -24 שעות.- יש לשטוף את התאים ומחוברות עם PBS ולהוסיף 2.5 מ"ל של מדיום בידול נמוכה בסרום (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 2% נסיוב סוס, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1 מיקרומטר אינסולין) . החלף את המדיום כל יומיים.
הערה: שמור אינסולין המניות קפוא ולהוסיף אותו בתקשורת בכל שינוי בינוני.
- יש לשטוף את התאים ומחוברות עם PBS ולהוסיף 2.5 מ"ל של מדיום בידול נמוכה בסרום (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 2% נסיוב סוס, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1 מיקרומטר אינסולין) . החלף את המדיום כל יומיים.
- במהלך התמיינות C2C12, לאסוף דגימות עבור קוואןtitative RT-PCR (ראה סעיף 4) בנקודות הזמן הבאות: יום 0, 1, 2, 4, ו -6 תהליך ההתרבות עבור immunostaining ביום 6 - 8 (ראה סעיף 5).
בידוד RNA 4. וכמותי RT-PCR
- השתמש פרוטוקול של היצרן עבור בידוד RNA. לאחר בידוד, resuspend גלולה רנ"א 30 מים μl RNase ללא ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים.
הערה: הדוגמות תהיינה רשאיות להמשיך כמוני RT-PCR או יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. - השתמש ערכת qPCR RT עבור כמותי RT-PCR 10 ובצע את ההוראות של היצרן. מכינים את תערובת התגובה על פי טבלה 1.
| רְכִיב | נפח (μl) | ריכוז סופי |
| מאגר התגובה 2x | 10 | 1x |
| פריימר קדימה | 0.5 | 200 ננומטר |
| פריימר הפוך | 0.5 | 200 ננומטר |
| בְּדִיקָה | 0.5 | 200 ננומטר |
| הפוך transcriptase & RNase אינהיביטור | 0.1 | 0.25 U / ml |
| תבנית | 1 | 100 RNA סך ng |
| מים חינם RNase | 7.4 | NA |
| מערבבים סה"כ | 20 |
טבלה 1. כמותי RT-PCR מיקס מאסטר הכנה
- הפעל תגובת 20 μl RT-qPCR באמצעות טבלה 2 פרופיל תרמית.
| צעד שעתוק הפוך | 30 דקות, 48 ° C |
| פולימר DNAאיון ASE הפעלה / הפוך transcriptase | 10 דקות, 95 ° C |
| 40 מחזורים | 15 שניות, 95 ° C |
| 1 דק ', 60 ° C |
טבלה 2. כמותי פרופיל תרמי RT-PCR
5. Immunostaining
- תקן את התרבות monolayer ב 2.5 מ"ל מוכן טרי 4% paraformaldehyde / PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- Permeabilize דגימות 2.5 מ"ל 0.1% Triton X-100 / PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- העברת דגימות בתא humidified. חסום את דגימות 2.5 מ"ל חסימת חיץ (0.1% nonionic פעילי שטח / PBS, 10% נסיוב עז רגיל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- בטל חסימת חיץ ולהחיל 800 μl נוגדן ראשוני נגד שרשרת שרירן כבד מדולל חסימת חיץ (1: 100). מדגירים לילה בתא humidified בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הצלחת 3 times (10 דקות כל אחד) עם חיץ 2.5 מ"ל לשטוף (0.1% polysorbate 20 / PBS) ביום 2.
- הסר את החיץ לשטוף ולהחיל 800 נוגדנים משני μl (IgG אנטי העכבר העז, 1: 500 בדילול מלא PBS). דגירה בתא humidified בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
- לשטוף פעמיים (10 דקות כל אחד) עם חיץ לשטוף 2.5 מ"ל.
- דגירה עם 800 μl DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל, בדילול מלא O H 2 deionized מזוקקים) במשך 5 דקות.
- לשטוף עם חיץ 2.5 מ"ל לשטוף שוב למשך 10 דקות.
- שנה את חיץ כביסה 2.5 מ"ל PBS ולהשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי ללכוד תמונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי C2C12 היו transfected עם GFP-CUG5 או GFP-CUG200. לאחר בחירת התרופה-התנגדות, ברכות יציבות הוקמו, אשר ניתן דמיינו ידי ביטוי של GFP (איור 1 א). היווצרות Myotube ב myoblasts הבדיל זוהה על ידי שרירן שרשרת כבדה immunostaining 10 (איור 1 ב). כימות של היווצרות myotube הראו כי מדדי היתוך היו ירד מ 35.4 ± 4.1% ל -2.6 ± 1.1% ובאזורים myotube היו ירד מ 35.6 ± 2.2% ל -2.7 ± 0.8% על ידי הרחבת CUG חריגה GFP-CUG200 (תרשים 1C). מדד פיוז'ן באזור myotube נספרו באמצעות המספר הכולל של הגרעינים myotubes (≥ 2 גרעינים) מחולק במספר הכולל של גרעינים ואחוז באזור התמונה הכוללת מכוסה myotubes, בהתאמה. בזמן אמת 10 RT-PCR נערכה לנתח ביטוי במשך מספר שרירים שוניםגנים iation הקשורים כולל Myod, MyoG, Mef2c ו Celf1. לעומת CUG5 תרבויות, CUG200 הגדילה את הביטוי של Celf1 mRNA ב מתרבים myoblasts בתחילת בידול. חופף עם דיווחים קודמים, upregulation Celf1 היה קשור-הרחבה CUG ב myogenic ניוון 1 (איור 1D). יתר על כן, 10 סופג המערבי הראו באופן עקבי רמת חלבון Celf1 היה גבוה (איור 1E), ו CUG200 עיכב את הביטוי של Myod, MyoG ו Mef2c במהלך התמיינות (איור 1D). תוצאות אלו מצביעות כי הרחבת CUG מובילה myotube פגמים והבחנת myoblast לקוי.
כדי ללמוד את התפקיד של Celf1 התמיינות myoblast, וקטור retroviral pMSCV- Celf1Flag נבנה transduce תאים C2C12. 10 puromycin עמידים שיבוטים היו נקווה ללימודי בידול. תוצאות כתם מערביות הראו כי הדגל-tagged Celf1 נכח רק בתרבויות transduced pMSCV-Celf1Flag ואת הביטוי של חלבון Celf1 היה upregulated (איור 2 א). היווצרות myotubes ב Celf1-overexpressing תאים נדירה בהשוואה לתרבויות הביקורת (איור 2 ב), אשר טוענת כי ביטוי היתר של Celf1 הוא פוגע קשה בידול myoblast.
כדי לקבוע אם מציאת Celf1 מצילה את חוסר הבידול בתאי CUG-רחבים, Celf1 shRNA נמסרה תאי GFP-CUG200 ידי וקטורי lentiviral. שיבוטים עמידים זוגיים (G418 ו puromycin) נבחרו ונקוו ללימודי בידול. רמת חלבון Celf1 אנדוגני הופחת במידה ניכרת בנוכחות Celf1 shRNA (איור 3 א). לאחר 6 ימים של בידול, השפעת Celf1 shRNA על הגדלת היווצרות myotube ניכרה (איור 3 ב). מדדי היתוך ו myotube הםכמו היו 16.1 ± 3.0% ו -15.2 ± 1.2%, בהתאמה, לעומת עלייה של 4.6 ± 0.8% ו -5.1 ± 1.3% בתרבויות שליטה (איור 3 ג). בינתיים, בזמן אמת RT-PCR התוצאות מראים כי ביטוי Myod, MyoG ו Mef2c הוגדל באופן משמעותי בתאים shRNA Celf1 (איור 3D) תמיכה הצילה מציאה Celf1 חסר בידול myocyte.
איור 1. הרחבת CUG מעכבת בידול Myocyte בתאי C2C12. (א) תאים C2C12 הביע GFP-CUG5 או GFP-CUG200 ubiquitously לאחר הבחירה. ברי סולם הם 100 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין הנייר הקודם שלנו 10. (ב) myotubes נוצרו בתאי GFP-CUG5 אבל פחות בתאי GFP-CUG200. Myotubes היו דמיינו ידי שרירן שרשרת כבדה immunostaining (MF-20). ברי סולם הם 100 מיקרומטר. (C) (ד) בזמן אמת RT-PCR ניתוח של Celf1, שעתוק גורמי Myod, MyoG, וביטוי Mef2c במהלך התמיינות myoblast. רמות ה- mRNA היו זממו לאחר מנורמל GAPDH. ברי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. מבחן T של התלמיד בוצע להשוות את הבדיקות לבקרות. n> 3, * P <0.05. (E) transfection GFP-CUG200 גדל ביטוי חלבון Celf1. SS-תקטין מוצג כמו טעינה מלאה. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. התבטאות יתר של Celf1 פוגעת myoblast בידול. (א) הוכחת expre Celf1Flag אקסוגנייםssion בתאים C2C12 ידי כתם המערבי. (ב) היווצרות Myotube נפגמה myoblasts C2C12 Celf1Flag-overexpressing. Myotubes היו דמיינו ידי immunostaining MF-20. ברי סולם הם 100 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מציאת איור 3. של אי ספיקת בידול Celf1 חלקית מציל CUG-הרחבה-induced myoblast. (א) הוכחת מציאה Celf1 ידי כתם המערבי. (ב) היווצרות Celf1 shRNA המושרה myotube ב myoblasts GFP-CUG200. Myotubes היו דמיינו ידי immunostaining MF-20. ברי סולם הם 100 מיקרומטר. (C) Celf1 תאים shRNA-הציל שרק העצימו באזורי אינדקס myotube היתוך. ברי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. (ד) בזמן אמת RT-PCR ניתוח של Celf1, שעתוק גורמי Myod, MyoG, וביטוי Mef2c במהלך התמיינות. רמת ה- mRNA היה להתוות לאחר נרמול לזה של GAPDH. ברי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. מבחן T של התלמיד בוצע להשוות את הבדיקות לשליטה. n> 3, * P <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שורת תאים C2C12 נוצל בעבר כמודל ללמוד myogenesis 11-14. תאים אלה לשמור על המראה כמו-פיברובלסטים, להתרבות במהירות מדיה המכילה 20% בסרום שור העובר ולבדל בקלות מדיה המכילה 2% נסיוב סוס 15. הצמיחה וההתבדלות מהר הם מאפייני יתרון מודל תא myogenesis. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש פלסמיד, retroviral, ו וקטורים lentiviral להציג cDNA, 3'-UTR, ו shRNA לתאים C2C12. הנקודות הקריטיות עבור transfection / התמרה ותחזוקה של עקביות הבידול מודגשות מתחת.
צפיפות התאים בתחזוקת תא יומית היא קריטית. תאים אלה צריכים להיות מתורבתים מתחת ל -50 - 70% מפגש. בשל זמן הכפלת אוכלוסייה הקצר, מפגש גבוה תרבות (> 70%) C2C12 מבדיל ספונטני כאשר עזבו הלילה. בעוד חלק קטן של תאים מובחנים באופן ספונטני עשוי להיות קטן, בנוכחותתאים מובחנים של יתרמו סתירות בניסויי בידול שלאחר מכן. בנוסף, טרי מופשרים תאי C2C12 שיש מספר מעבר נמוך עדיפים. לבידול, תאים מצופים על מספרים שנקבעו מראש, כך שהם מגיעים למפגש מלא לאחר 24 שעות. אינסולין נשמר בהקפאת aliquots הקטן והוא הוסיף בכל פעם מדיום הבידול משתנה. אמצעים אלה משפרים את תוצאות בידול.
בינוני בחינם סרום משפר transfection התא C2C12. התאים יכולים להיות מודגרות בתערובת transfection / תקשורת חופשית בסרום לילה. במעבדה שלנו, אנו משיגים עד שיעור transfection 20%, מלווה סימנים קלים של רעילות. ריכוז תרופה המשמשת כדי לבחור תא C2C12 גבוה, 1.2 ל 1.6 מ"ג / מ"ל G418 או 1 עד 3 מיקרוגרם / מ"ל puromycin, ואת משך הזמן של הבחירה היא יותר מאשר רוב שורות תאים אחרים. בשל רעילות אפשרית תחת ריכוז תרופה גבוה ותקופת הדגירה המורחבת, הרבה-אל-הרבהוריאציה פוטנציאל התמיינות שעלולות להתעורר. זה חיוני כדי להתאים את ערכת הבחירה (ריכוז ומשך) על סמך מראה תא לטפל קבוצות ניסוי ובקר יחד.
יש לנו הציג GFP-CUG200 בהצלחה לתאי C2C12 שמתרבים הרחבת CUG 3'-UTR ב DM1. היכרות Celf1 לתאי C2C12 ו Celf1 shRNA לתאי GFP-CUG200 C2C12 אפשרה ההערכה של אירועים תאיים ומולקולריים מופעלים על ידי Celf1 upregulation וחקירה של מיקוד Celf1 לעזור בידול myoblast DM1, בהתאמה. לסיכום, מודל myoblast C2C12 המוצג כאן הטבות החקירה של ניוון myotonic וכן ביולוגיה של תא שריר כללי והבחנת myogenic. המגבלה של מודל זה היא כי הממצאים בשורות תאי איננה רשאית להעניק לחלוטין אורגניזמים. ממצאי הדגמים הנוכחיים לעתים קרובות הם מתקדמים כדי לבודד myoblasts הטרי מחיות ולומדים differentia שלהםtion. בסופו של דבר אנו לאשש ממצאים myoblast באורגניזמים.
כוחו הייחודי של מחקר זה הוא מניפולצית הגן רבות קומות ב myoblasts C2C12, המאפשר דוגמנות האירועים הגנטיים / פתולוגי רציפי DM1. בעבר, השפעת רעילות RNA של הרחבת DMPK CUG תועדה myoblasts 11-14, בעוד התפקידים פתולוגית של Celf1 נחקרו בנפרד בעכברי מודל 16,17. דוגמנות אירועים פתולוגיים / גנטי רציפים אלה הוא מאתגר מבחינה טכנית וזמן רב אם ביצע במודלים של בעלי חיים. כפי שהוכח במחקר זה, השימוש בשילוב של סמנים עמידים פלורסנט תרופה מאפשר מידול של אירועים מולקולריים נוספים ניוון myotonic. המודלים הוקמו במחקר זה יהיו שימושיים לשלוף את מנגנוני מפורט בפתוגנזה DM1. הם גם יהיו בעל ערך בדיקות סקר לאיתור תרופות למקד שלבים שונים של בפתוגנזה DM1. האסטרטגיות והנהלים של זההמחקר עשוי לשפוך אור על הקמת מודלים מחלת שרירים אחרים myoblasts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
