Summary
In questo protocollo, vi presentiamo le procedure nella creazione di modelli miotonici mioblasti distrofia 1, tra cui ottimizzato manutenzione C2C12 cellule, geni trasfezione / trasduzione, e la differenziazione dei miociti.
Abstract
La distrofia miotonica 1 (DM1) è una comune forma di distrofia muscolare. Anche se diversi modelli animali sono stati stabiliti per DM1, modelli cellulari mioblasti sono ancora importanti perché offrono una valida alternativa cellulare per studiare gli eventi cellulari e molecolari. Anche se le cellule mioblasti C2C12 sono stati ampiamente utilizzati per studiare miogenesi, resistenza alla trasfezione del gene, o trasduzione virale, ostacola la ricerca nelle cellule C2C12. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato che include le procedure di manutenzione quotidiana, trasfezione e trasduzione per introdurre geni in mioblasti C2C12 e l'induzione della differenziazione dei miociti. Collettivamente, queste procedure consentono migliori efficienze di trasfezione / trasduzione, come pure risultati differenziazione coerenti. Il protocollo descritto nello stabilire modelli cellulari mioblasti DM1 beneficerebbero lo studio della distrofia miotonica, nonché altre malattie muscolari.
Introduction
La distrofia miotonica (DM) è una malattia autosomica dominante che colpisce di più sistemi, i muscoli più considerevolmente cardiaco e scheletrico 1. Ci sono due sottotipi di questa malattia, DM1 e DM2. DM1 è più comune e ha una manifestazione più grave di DM2 2. La mutazione genetica sottostante DM1 è una espansione della tripletta ripetizioni CUG situato nella regione 3 'non tradotta (UTR) del DM gene della proteina chinasi (DMPK) 3. Il numero CUG repeat in individui sani varia da 5 a 37. Al contrario, aumenta di più di 50, e, a volte fino a migliaia di pazienti DM1 4. Di conseguenza, RNA-binding proteins, come muscleblind-simile 1 (MBNL1), CUGBP, e Elav-come la famiglia 1 (Celf1), sono misregulated. A causa del sequestro sulle ripetizioni CUG espanse, MBNL1 perde la sua capacità di regolare splicing alternativo 5. Celf1, invece, viene up-regolata 6,7. Sovraespressione di Celf1 è associata a perdita di massa muscolaree la debolezza, che non sono attribuiti alla perdita di funzione MBNL1. Modelli animali che simulano le alterazioni DM1, comprese l'DMPK 3'-UTR espansione CUG, perdita di MBNL1, e sovraespressione di Celf1, sono state stabilite. Tuttavia, la modellazione DM1 nei mioblasti offre una valida alternativa, soprattutto per sezionare gli eventi cellulari e molecolari DM1-correlati.
Linea di cellule mioblasti C2C12 è stato isolato dal muscolo C3H topo feriti e ampiamente usato per studiare miogenico 8,9 differenziazione. C2C12 rapidamente proliferano in siero fetale bovino (FBS) -contenenti media e facilmente subiscono differenziazione quando FBS è esaurito. Tuttavia, utilizzando questo modello di differenziazione dei mioblasti presenta due sfide: C2C12 sono spesso resistenti al gene trasfezione / trasduzione virale; e lievi variazioni nella gestione delle cellule e differenziazione procedura può portare a notevoli cambiamenti in formazione myotube.
Il nostro laboratorio utilizza abitualmente mioblasti C2C12 come ACmodello ell e ha sviluppato protocolli in grado di fornire in modo efficace i geni di plasmide trasfezione, trasduzione retrovirale, e lentivirale trasduzione nella linea cellulare C2C12 10. Nel video, dimostriamo le procedure ottimizzate per transfecting / trasduzione C2C12 cellule e mantenere la coerenza di differenziazione nella creazione di modelli di mioblasti DM1.
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Protocol
1. C2C12 coltura cellulare
- Mantenere C2C12 mioblasti di topo in un piatto di 100 mm di mezzo di crescita (media di Dulbecco modificato Eagle (DMEM)) integrato con il 20% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, e 2 mm L-glutammina. Consentono alle cellule C2C12 diversi passaggi a diventare circa il 50 - 60% confluenti.
- Eliminare il mezzo di crescita e lavare le cellule C2C12 con soluzione fisiologica 3 ml di temperatura ambiente tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 500 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per staccare le cellule. Posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore 3 - 5 min.
- Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta di 3 ml di terreno di coltura. Pipettare 6 - 8 volte per sospendere le cellule. Aggiungere 1 ml di cellule sospese in un piatto di 100 mm e incubare a 37 ° C, 5% CO 2.
2. C2C12 cellule Trasfezione / trasduzione e Selezione
- C2C12 plasmide trasfezione
- 24 ore prima della trasfezione, pritardate 7,0 x 10 5 cellule C2C12 in un pozzetto di una piastra sei pozzetti per ogni trasfezione.
Nota: Questo porta a 50 - 60% di confluenza al momento della transfezione. - Lasciare che il reagente di trasfezione raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso.
- Aggiungere 2 mg di DNA plasmide (GFP-CUG5 o GFP-CUG200) in 200 ml di pre-riscaldato mezzo privo di siero e vortex brevemente. Aggiungere 6 ml di reagente di trasfezione al mezzo e miscelare immediatamente per 30 secondi usando un vortice. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Cambiare il supporto di cellule C2C12 a 2,5 ml terreni di coltura privo di siero. Aggiungere la miscela di trasfezione di cellule dopo incubazione. Riportare le piastre per un 5% di CO 2, 37 ° C incubatore.
- Mantenere le cellule in miscela di trasfezione / terreni di crescita senza siero per 4 ore o fino a notte. Cambiare i media indietro ai media di crescita il giorno successivo o quando citotossicità è evidente.
Nota: La citotossicità è valutata mediante ispezione microscopica del ceLLS. Osservare i cambiamenti nella morfologia cellulare e il distacco delle cellule. Fino a quando non vi è alcuna citotossicità palese, l'incubazione durante la notte in terreni di crescita privo di siero migliora trasfezione. - Selezionare le celle 48 ore dopo la trasfezione con l'aggiunta di 1,2-1,6 mg / ml G418 per ~ 10 giorni fino a quando la cultura del controllo (transfettate senza i plasmidi) non ha cellule vive. Modificare i media ogni due giorni con mezzi di crescita integrato con G418.
- Mantenere le cellule resistenti G418 in mezzo di crescita e 5% di CO 2 a 37 ° C per esperimenti successivi.
- 24 ore prima della trasfezione, pritardate 7,0 x 10 5 cellule C2C12 in un pozzetto di una piastra sei pozzetti per ogni trasfezione.
- preparazione Retrovirus e C2C12 retrovirale trasduzione
- Preparare HEK 293 terreno di coltura DMEM completandolo glucosio con il 10% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 2 mM L-glutammina.
- Circa 24 ore prima della trasfezione, piatto 4,0 x 10 cellule di packaging HEK 293 basati su 6 ecotropic in un 100 mm Piastra (80% di confluenza a trasfezione) cmezzo di coltura cellulare ontaining.
- Lasciare che il reagente di trasfezione raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso.
- Mescolare 15 mcg plasmide DNA (pMSCV-Puro o pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml di terreno di coltura privo di siero. brevemente Vortex. Aggiungere 30 ml di reagente di trasfezione dal punto 2.2.2 in / tubo di terreno di coltura privo di siero del DNA, e mescolare bene con vortex. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min.
- Aggiungere trasfezione miscela goccia a goccia per le cellule di confezionamento ecotropic HEK 293-based. Mescolare delicatamente i piatti e li tornare al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore. Dopo 24 ore, cambiare i mezzi di comunicazione per mezzo di crescita fresco 10 ml di pre-riscaldato.
- Raccogliere il surnatante (contenente retrovirus) 48 ore dopo la trasfezione con una pipetta e trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 10 ml di nuovi media caldi alla piastra e restituirlo al incubatrice. Mantenere il surnatante a 4 ° C.
Nota: Il supporto viene aggiunto delicatamente per tegli lato del pozzo in modo da non disturbare il monostrato cellulare. - Raccolto il secondo lotto di surnatante 60 ore dopo la trasfezione e piscina con il surnatante da 2.2.5. Centrifugare a 500 xg, a 4 ° C per 7 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
- Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 50 ml centrifuga. Utilizzare retrovirus di trasdurre cellule C2C12 a questo punto procedendo al punto 2.2.9 o aliquotare e conservare il surnatante a -20 ° C per un uso futuro.
- Scongelare il retrovirus da 2.2.7 a temperatura ambiente, se un titolo congelato è qui utilizzato.
Nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. - Piastra cellule C2C12 lo stesso giorno di trasduzione puntando 30 - 40% di confluenza.
- Eliminare il mezzo di crescita e lavare le cellule C2C12 con temperatura ambiente 3 ml di PBS. Rimuovere la PBS, aggiungere 500 microlitri 0,25% tripsina-EDTA e incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore 3 - 5 min.
- Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta di 3 ml med crescitaIUM. Pipettare 6 - 8 volte per sospendere le cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e aggiungere 8,0 x 10 5 cellule C2C12 ad una piastra 60 mm.
- Aggiungere 0,5 ml retrovirus di infettare un piatto 60 mm di cellule in 3 ml di mezzi di crescita. Riportare la piastra per l'incubatore.
- Sostituire con 3 supporti ml freschi integrato con selezione antibiotica (puromicina 1 - 3 mg / ml) 48 ore dopo l'infezione. Sostituire 3 ml di mezzo con antibiotici ogni giorno per ~ 5 giorni fino a quando la cultura del controllo C2C12 non trasdotte spegne.
- Preparare HEK 293 terreno di coltura DMEM completandolo glucosio con il 10% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 2 mM L-glutammina.
- preparazione lentivirus e C2C12 lentiviral trasduzione
Nota: eseguire tutte le procedure lentivirus legati a livello di biosicurezza 2 mobile e seguire le linee guida di sicurezza biologica. I rifiuti liquidi contenenti il virus devono essere disinfettati prima dello smaltimento.- Piatto 4,0 x 10 6 cellule 293T in un piatto 100 mm (~ 80% di confluenza al giorno di trasfezione) con HEK 293 terreno di coltura cellulare (DMEM alti livelli di glucosio, integrato con il 10% del fetosiero bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 2 mM L-glutammina) 24 ore prima della transfezione.
- Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Mescolare i vettori lentivirali di confezionamento (4 mg pMD2.G e 6 mcg psPAX2) insieme con 8 mg di trasferimento vettori lentivirali (Celf1 shRNA o strapazzate controllo shRNA) in 1 ml di siero mezzo di coltura cellulare gratuito. brevemente Vortex.
- Aggiungere 36 ml di pre-riscaldato reagente di trasfezione al tubo DNA / DMEM e mescolare bene dal vortice. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere le cellule 293T dal termostato e aggiungere la miscela di trasfezione alla piastra. Agitare delicatamente la piastra e tornare di nuovo al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore. Dopo 24 ore, sostituire la miscela di trasfezione con 10 ml di terreno di coltura fresco.
- Raccogliere il surnatante contenente lentivirus 48 ore dopo la trasfezione e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 10 ml nuovi media caldi alla piastra e restituirloper incubatrice. Conservare il surnatante a 4 ° C.
- Raccogliere il secondo lotto di surnatante 60 ore dopo la trasfezione e combinarlo con il surnatante da 2.3.5. brevemente Centrifugare a 500 xg, a 4 ° C per 7 minuti.
- Trasferire il surnatante in un tubo da 50 ml centrifuga fresca. Se si utilizza il virus fresco, procedere al punto 2.3.9. Per l'uso futuro, negozio di virus contenenti surnatante a -20 ° C in aliquote di 10 ml.
- Scongelare il virus da 2.3.7 a temperatura ambiente prima dell'uso, se si utilizza un magazzino congelato.
Nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. - cellule piastra C2C12-CUG200 (ottenuti nella sezione 2.1), come descritto nella 2.2.9 lo stesso giorno di trasduzione.
Nota: Obiettivo per 30 - 40% di confluenza. - Aggiungere 0,5 ml di virus di infettare una piastra 60 mm C2C12-CUG200 e riportare la piastra per l'incubatore.
- Sostituire il terreno di coltura con mezzi freschi integrati con l'antibiotico selezione (puromicina 1 - 3 mg / ml) 72 ore dopo la trasduzione.Aggiornare mezzi di coltura di tutti i giorni con l'antibiotico selezione di ~ 5 giorni fino a quando tutta la cultura di controllo C2C12-CUG200 non trasdotte spegne.
- Utilizzare Western Blot per verificare atterramento Celf1 in cellule trasfettate GFP-CUG200.
3. C2C12 cellule Differenziazione
- Piastra 2 x 10 6 cellule in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2,5 ml terreni di crescita 24 h prima apertura di differenziazione.
Nota: la densità di placcatura può essere regolata in modo che la piena confluenza viene raggiunto in 24 ore.- Lavare le cellule confluenti con PBS e aggiungere 2,5 ml di terreno di differenziamento basso siero (modificato mezzo di Eagle integrato con 2% di siero equino, 100 U / ml penicillina Dulbecco, 100 ug / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1 pM insulina) . Sostituire la media ogni due giorni.
Nota: Mantenere magazzino insulina congelati e aggiungerlo ai media ad ogni cambio medio.
- Lavare le cellule confluenti con PBS e aggiungere 2,5 ml di terreno di differenziamento basso siero (modificato mezzo di Eagle integrato con 2% di siero equino, 100 U / ml penicillina Dulbecco, 100 ug / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1 pM insulina) . Sostituire la media ogni due giorni.
- Durante la differenziazione C2C12, raccogliere campioni per quanquantita- RT-PCR (vedi sezione 4) presso i seguenti punti di tempo: Day0, 1, 2, 4 e 6. Processo per la cultura immunocolorazione al giorno 6-8 (vedi sezione 5).
4. RNA Isolamento e RT-PCR quantitativa
- Utilizzare il protocollo del produttore per l'isolamento di RNA. Dopo l'isolamento, risospendere il pellet di RNA in 30 acqua priva di RNasi ml e pipettare su e giù parecchie volte.
Nota: I campioni possono procedere alla RT-PCR quantitativa o possono essere conservati a -80 ° C. - Utilizzare un kit RT qPCR per RT-PCR quantitativa 10 e seguire le istruzioni del produttore. Preparare la miscela di reazione in base alla tabella 1.
| Componente | Volume (ml) | Concentrazione finale |
| tampone di reazione 2x | 10 | 1x |
| Primer forward | 0.5 | 200 nm |
| primer reverse | 0.5 | 200 nm |
| Sonda | 0.5 | 200 nm |
| Trascrittasi inversa e RNase Inhibitor | 0.1 | 0,25 U / ml |
| Modello | 1 | 100 ng RNA totale |
| acqua libera RNase | 7.4 | N / A |
| Mix totale | 20 |
Tabella 1. RT-PCR Master Mix Preparazione
- Eseguire un 20 microlitri reazione RT-qPCR con profilo termico Tabella 2.
| fase di trascrizione inversa | 30 min, 48 ° C |
| polimero DNAAttivazione ase / trascrittasi inversa inattivazione | 10 min, 95 ° C |
| 40 cicli | 15 sec, 95 ° C |
| 1 min, 60 ° C |
Tabella profilo termico 2. RT-PCR quantitativa
5. immunocolorazione
- Fissare la coltura monostrato in 2.5 ml preparato fresco 4% paraformaldeide / PBS a temperatura ambiente per 10 min.
- Permeabilize i campioni in 2.5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire i campioni ad una camera umidificata. Bloccare i campioni in 2,5 ml di tampone di bloccaggio (tensioattivo non ionico 0,1% / PBS, 10% siero di capra normale) per 30 minuti a 37 ° C.
- Scartare tampone bloccante e applicare 800 microlitri anticorpo primario contro catena pesante della miosina diluito in tampone di bloccaggio (1: 100). Incubare in una camera umidificata notte a temperatura ambiente.
- Lavare la piastra 3 times (10 min ciascuna) con 2,5 ml di tampone di lavaggio (0,1% polisorbato 20 / PBS) il giorno 2.
- Rimuovere il tampone di lavaggio e applicare 800 microlitri anticorpo secondario (goat anti-topo IgG, 1: 500 diluito in PBS). Incubare in una camera umidificata a temperatura ambiente per 1 ora.
- Lavare due volte (10 minuti ciascuno) con tampone di 2,5 ml di lavaggio.
- Incubare con 800 microlitri DAPI (1 ug / ml, diluito in acqua distillata deionizzata H 2 O) per 5 min.
- Lavare con 2,5 ml di tampone di lavaggio ancora per 10 min.
- Modificare il buffer di lavaggio a 2,5 ml di PBS e utilizzare un microscopio a fluorescenza per catturare le immagini.
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Representative Results
C2C12 sono state trasfettate con GFP-CUG5 o GFP-CUG200. Dopo la selezione farmaco-resistenza, sono stati stabiliti piscine stabili, che può essere visualizzato mediante espressione GFP (Figura 1A). Formazione myotube nei mioblasti differenziati è stato rilevato dal catena pesante della miosina immunocolorazione 10 (Figura 1B). La quantificazione di myotube formazione ha dimostrato che gli indici di fusione sono stati diminuiti da 35,4 ± 4,1% al 2,6 ± 1,1% e le aree myotube sono stati diminuiti da 35,6 ± 2,2% al 2,7 ± 0,8% dall'espansione CUG anormale GFP-CUG200 (Figura 1C). L'indice di fusione e l'area myotube state contate con il numero totale di nuclei in miotubi (≥ 2 nuclei) diviso per il numero totale di nuclei e la percentuale della superficie totale dell'immagine coperta da miotubi rispettivamente. Real-time RT-PCR 10 è stato condotto per analizzare l'espressione di un certo numero di diversi muscoligeni correlati iation tra cui MyoD, MyoG, MEF2C e Celf1. Rispetto al CUG5 culture, CUG200 aumentato l'espressione di mRNA in Celf1 proliferanti mioblasti all'inizio di differenziazione. Congruente con le precedenti relazioni, Celf1 upregulation è stata associata con CUG-espansione in miogenico distrofia 1 (Figura 1D). Inoltre, Western blotting 10 costantemente mostrato livelli di proteina Celf1 era elevato (Figura 1E), e CUG200 inibito l'espressione di MyoD, MyoG e MEF2C durante il differenziamento (Figura 1D). Questi risultati suggeriscono che il CUG espansione porta a myotube difetti e la differenziazione dei mioblasti compromessa.
Per studiare il ruolo di Celf1 nel differenziamento dei mioblasti, pMSCV- Celf1Flag vettore retrovirale è stato costruito per trasdurre cellule C2C12. Cloni 10 puromicina-resistenti sono stati raggruppati per gli studi di differenziazione. risultati Western Blot hanno mostrato che il Flag-tagged Celf1 era presente solo nelle culture pMSCV-Celf1Flag trasdotte e l'espressione della proteina è stata Celf1 upregulated (Figura 2A). La formazione di miotubi in Celf1-overexpressing cellule è raro rispetto alle colture di controllo (Figura 2b), il che suggerisce che la sovraespressione di Celf1 danneggia gravemente la differenziazione dei mioblasti.
Per determinare se Celf1 atterramento salva il deficit di differenziazione nelle cellule CUG-espansione, Celf1 shRNA è stato consegnato alle cellule GFP-CUG200 da vettori lentivirali. cloni resistenti doppie (G418 e puromicina) sono stati selezionati e raggruppati per gli studi di differenziazione. Il livello di proteine Celf1 endogena era marcatamente ridotto in presenza di Celf1 shRNA (Figura 3A). Dopo 6 giorni di differenziazione, l'effetto di Celf1 shRNA sull'aumento formazione myotube era evidente (Figura 3B). indici di fusione e myotube sonocome erano 16,1 ± 3,0% e 15,2 ± 1,2%, rispettivamente, rispetto al 4,6 ± 0,8% e 5,1 ± 1,3% in colture di controllo (Figura 3C). Nel frattempo, i risultati real-time RT-PCR suggeriscono che l'espressione di MyoD, MyoG e MEF2C era significativamente aumentata nelle cellule Celf1 shRNA (Figura 3D) che supportano atterramento in salvo carenza di differenziazione dei miociti Celf1.
Figura 1. CUG-espansione Inibisce miociti differenziazione in cellule C2C12. Cellule (A) C2C12 esprimono GFP-CUG5 o GFP-CUG200 ubiquitariamente dopo la selezione. Barre di scala sono 100 micron. Questo dato è stato modificato rispetto alla precedente carta 10. (B) miotubi sono formati nelle cellule GFP-CUG5 ma meno nelle cellule GFP-CUG200. Miotubi sono stati visualizzati da miosina catena pesante (MF-20) immunocolorazione. Barre di scala sono 100 micron. (C) (D) Real-time RT-PCR di Celf1, fattori di trascrizione MyoD, MyoG, e l'espressione MEF2C durante la differenziazione dei mioblasti. I livelli di mRNA sono stati tracciati dopo la GAPDH normalizzato. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard. test t di Student è stata eseguita per confrontare i test ai controlli. n> 3, * P <0.05. (E) GFP-CUG200 trasfezione aumentata espressione della proteina Celf1. ß-actina è mostrato come il controllo del carico. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. sovraespressione di Celf1 Impairs mioblasti differenziazione. (A) La prova di esogena espres Celf1Flagfissione in cellule C2C12 di Western Blot. formazione (B) myotube è stata compromessa in Celf1Flag-overexpressing mioblasti C2C12. Miotubi sono stati visualizzati da MF-20 immunocolorazione. Barre di scala sono 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Knockdown di Celf1 parzialmente Rescues CUG-Expansion-Induced mioblasti differenziazione carenza. (A) La prova di Celf1 atterramento da Western Blot. (B) Celf1 shRNA formazione myotube indotti nei mioblasti GFP-CUG200. Miotubi sono stati visualizzati da MF-20 immunocolorazione. Barre di scala sono 100 micron cellule. (C) Celf1 shRNA-rescued che avevano aumentato le aree di indice di fusione e myotube. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard. (D) Real-time RT-PCR di Celf1, fattori di trascrizione MyoD, MyoG, e l'espressione MEF2C durante la differenziazione. livello di mRNA fu tracciata dopo aver normalizzato a quella della GAPDH. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard. test t di Student è stata eseguita per confrontare i test di controllo. n> 3, * P <0.05. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Linea cellulare C2C12 è stata utilizzata come modello per lo studio miogenesi 11-14. Queste cellule mantengono uno sguardo fibroblasti-like, proliferano rapidamente in supporti contenenti il 20% di siero fetale bovino e prontamente si differenziano nel supporto contenente 2% di siero equino 15. La rapida crescita e la differenziazione sono caratteristiche vantaggiose in un modello cellulare miogenesi. Qui, dimostriamo l'uso di plasmide, retrovirale, e vettori lentivirali per introdurre cDNA, 3'-UTR, e shRNA in cellule C2C12. I punti critici per trasfezione / trasduzione e manutenzione di coerenza nella differenziazione sono evidenziati di seguito.
La densità cellulare in cellule manutenzione giornaliera è critica. Queste cellule devono essere coltivate sotto 50 - 70% di confluenza. A causa del breve tempo di raddoppiamento della popolazione, alta confluenza (> 70%) cultura C2C12 differenzia spontaneamente quando una notte. Mentre la frazione di cellule differenziate spontaneamente può essere piccolo, la presenzadi cellule differenziate contribuiranno a incongruenze esperimenti successivi differenziazione. C2C12 Inoltre, appena scongelati che hanno basso numero di passaggio sono preferiti. Per la differenziazione, le cellule sono placcati in pre-determinati numeri in modo che essi raggiungono la piena confluenza dopo 24 ore. L'insulina è conservato congelato in piccole aliquote e viene aggiunta ogni volta che il terreno di differenziamento è cambiato. Queste misure migliorare i risultati di differenziazione.
Siero terreno privo migliora transfezione delle cellule C2C12. Le cellule possono essere incubate in miscela di trasfezione / siero media liberi durante la notte. Nel nostro laboratorio, abbiamo raggiungere fino a tasso trasfezione 20%, accompagnata da lievi segni di citotossicità. La concentrazione di farmaco utilizzato per selezionare la cella C2C12 è maggiore, 1,2 a 1,6 mg / ml G418 o da 1 a 3 g / ml puromicina, e la durata della selezione è più lungo rispetto alla maggior parte altre linee cellulari. A causa della potenziale tossicità sotto alta concentrazione di droga e il periodo di incubazione prolungato, lotto a lottovariazione di potenziale di differenziazione può sorgere. E 'fondamentale per regolare il sistema di selezione (concentrazione e durata) sulla base di aspetto delle cellule e per trattare i gruppi di esperimento e di controllo insieme.
Abbiamo introdotto con successo GFP-CUG200 in cellule C2C12 che riproducono 3'-UTR espansione CUG in DM1. L'introduzione di Celf1 in cellule C2C12 e Celf1 shRNA in cellule GFP-CUG200 C2C12 ha permesso la valutazione di eventi cellulari e molecolari innescati da Celf1 up-regolazione e l'esplorazione di puntare Celf1 per aiutare la differenziazione dei mioblasti DM1, rispettivamente. In sintesi, il modello di mioblasti C2C12 presentato qui avvantaggia l'indagine della distrofia miotonica e biologia generale delle cellule muscolari e differenziamento miogenico. Il limite di questo modello è che i risultati in linee cellulari possono non completamente estendersi a organismi. I risultati dei modelli attuali sono spesso avanzate per isolare mioblasti fresche provenienti da animali e studiare le loro differenziazionezione. In definitiva noi dimostrare risultati mioblasti negli organismi.
La forza unica di questo studio è la manipolazione genetica multi-tier in mioblasti C2C12, che consente la modellazione sequenziale genetiche / eventi patologici in DM1. In precedenza, l'effetto di tossicità RNA di espansione DMPK CUG è stata documentata in mioblasti 11-14, mentre i ruoli patologici di Celf1 sono stati studiati separatamente in modelli murini 16,17. Modellazione questi eventi patologici / genetiche sequenziali è tecnicamente impegnativo e che richiede tempo se eseguita in modelli animali. Come dimostrato in questo studio, l'uso combinato di marcatori fluorescenti resistenti droga e permette la modellazione di eventi molecolari supplementari distrofia miotonica. I modelli stabiliti in questo studio potrebbero essere utili per sezionare i meccanismi dettagliati nel DM1 patogenesi. Sarebbero anche essere utile nello screening per i farmaci che hanno come target diverse fasi del DM1 patogenesi. Le strategie e le procedure di questostudio potrebbe far luce sulla creazione di altri modelli di malattia muscolare nei mioblasti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
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