Summary
I denne protokollen, presenterer vi de prosedyrer i å etablere myotonic dystrofi 1 myoblast modeller, inkludert optimalisert C2C12 celle vedlikehold, genet transfeksjon / transduksjon, og myocyte differensiering.
Abstract
Myotonic dystrofi 1 (DM1) er en vanlig form for muskeldystrofi. Selv om det er etablert flere dyremodeller for DM1, myoblast cellemodeller er fortsatt viktig, fordi de tilbyr en effektiv cellulær alternativ for å studere cellulære og molekylære hendelser. Selv om C2C12 myoblast celler har blitt mye brukt til å studere myogenese, motstand mot gen transfeksjon eller viral transduksjon, hindrer forskning i C2C12-celler. Her beskriver vi en optimalisert protokoll som inkluderer daglig vedlikehold, transfeksjon og transduksjon prosedyrer for å innføre gener i C2C12 myoblasts og induksjon av myocyte differensiering. Sammen er disse fremgangsmåtene gjør det mulig beste transfeksjon / overføringseffektivitet, så vel som differensierings konsistente resultater. Den protokoll beskrevet i etablering av DM1 myoblast cellemodeller som vil dra studiet av myotonisk dystrofi, så vel som andre muskelsykdommer.
Introduction
Myotonic dystrofi (DM) er en autosomal dominant sykdom som påvirker flere systemer, særlig hjerte- og skjelettmuskulatur 1. Det er to undertyper av denne sykdommen, DM1 og DM2. DM1 er mer vanlig, og har en mer alvorlig manifestasjon enn DM2 2. Den genetiske mutasjon underliggende DM1 er en utvidelse av CUG triplet gjentar som befinner seg i det 3'-ikke-translaterte region (UTR) av DM-protein kinase-genet (DMPK) 3. Den CUG gjenta tall i upåvirket individer varierer fra 5 til 37. I motsetning til dette øker til mer enn 50, og noen ganger opp til flere tusen i DM1 pasienter 4. Som et resultat av RNA-bindende proteiner, slik som muscleblind liknende 1 (MBNL1), CUGBP, og Elav lignende familie 1 (Celf1), er misregulated. På grunn av den håndtering på de ekspanderte CUG gjentas, mister MBNL1 dens evne til å regulere alternativ spleising 5. Celf1, på den annen side blir oppregulert 6,7. Overekspresjon av Celf1 er assosiert med muskel tapog svakhet, som ikke er knyttet til tap av MBNL1 funksjon. Dyremodeller simulerer DM1-relaterte endringer, inkludert DMPK 3'-UTR CUG utvidelse, tap av MBNL1, og overekspresjon av Celf1, har blitt etablert. Men modellering DM1 i myoblasts tilbyr et effektivt alternativ, spesielt for dissekere DM1-relaterte cellulære og molekylære hendelser.
C2C12 myoblast cellelinjen ble først isolert fra skadet C3H mus muskel og mye brukt til å studere myogenic differensiering 8,9. C2C12 celler raskt sprer i føtalt bovint serum (FBS) -inneholdende media og lett gjennomgå differensiering når FBS er oppbrukt. Likevel, ved hjelp av denne myoblast differensiering modellen presenterer to utfordringer: C2C12 cellene er ofte resistente mot genet transfeksjon / viral transduksjon; og små variasjoner i celledifferensiering håndtering og fremgangsmåte kan føre til markerte endringer i myotube formasjonen.
Vår lab bruker rutinemessig C2C12 myoblasts som acell modell og har utviklet protokoller som effektivt leverer gener ved plasmid transfeksjon, retroviral transduksjon, og lentiviral transduksjon inn C2C12 cellelinje 10. I videoen viser vi de optimaliserte prosedyrer for trans / transducing C2C12 celler og opprettholde differensiering konsistens i å etablere DM1 myoblast modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C2C12 Cell Culture
- Opprettholde C2C12 mus myoblaster i en 100 mm skål i vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM)) supplert med 20% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin. Tillat C2C12 passert cellene til å bli ca. 50 - 60% sammenflytende.
- Kast vekstmediet og vaskes C2C12-celler sammen med 3 ml romtemperatur fosfat-bufret saltvann (PBS). Fjern PBS og tilsett 500 mL 0,25% Trypsin-EDTA å løsne cellene. Sett platen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 3 - 5 min.
- Nøytralisere trypsin ved å tilsette 3 ml vekstmedium. Pipetter 6 - 8 ganger for å suspendere cellene. Tilsett 1 ml av suspen celle til en ny 100 mm plate og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.
2. C2C12 Cell Transfeksjon / transduksjon og utvelgelse
- C2C12 plasmid transfeksjon
- 24 timer før transfeksjon, psene 7.0 x 10 5 C2C12-celler i en brønn av en seks-brønns plate for hver transfeksjon.
Merk: Dette fører til 50 - 60% konfluens ved tidspunktet for transfeksjon. - Tillat transfeksjon reagens for å komme til romtemperatur før bruk.
- Tilsett 2 mikrogram av plasmid DNA (GFP-CUG5 eller GFP-CUG200) i 200 ul forvarmet serumfritt medium og vortex kort. Tilsett 6 mL transfeksjon reagens til mediet og umiddelbart blandes i 30 sekunder ved hjelp av en vortex. Inkuber blandingen i 30 minutter ved romtemperatur.
- Endre media av C2C12 celler til 2,5 ml serumfrie vekstmedier. Tilsett transfeksjon blandingen til cellene etter inkubering. Returnere platene til en 5% CO2, 37 ° C inkubator.
- Hold cellene i transfeksjon blanding / serumfrie vekstmedier for 4 timer eller opp til over natten. Bytt media tilbake til vekstmedier den neste dag eller når cytotoksisitet er åpenbar.
Merk: Cytotoksisitet bestemmes ved mikroskopisk undersøkelse av cells. Observer endringene i cellemorfologi og celle avløsning. Så lenge det ikke er noen åpenbar cytotoksisitet, inkubering over natten i serumfritt vekstmedium forbedrer transfeksjon. - Merk cellene 48 timer etter transfeksjon ved tilsetning av 1,2 til 1,6 mg / ml G418 for ~ 10 dager til kontrollkulturen (uten transfekterte plasmider) har ikke levende celler. Endre media annenhver dag med vekstmedier supplert med G418.
- Opprettholde de G418-resistente celler i vekstmedium og 5% CO2 ved 37 ° C for etterfølgende eksperimenter.
- 24 timer før transfeksjon, psene 7.0 x 10 5 C2C12-celler i en brønn av en seks-brønns plate for hver transfeksjon.
- Retrovirus forberedelse og C2C12 retroviral transduksjon
- Forbered HEK 293 kulturmedium ved å supplere DMEM høy glukose med 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin.
- Omtrent 24 timer før transfeksjon, plate 4,0 x 10 6 ekotropisk HEK 293-basert emballasje celler i en 100 mm plate (80% samløpet ved transfeksjon) containing cellekulturmedium.
- Tillat transfeksjon reagens for å komme til romtemperatur før bruk.
- Blande 15 ug plasmid DNA (pMSCV-Puro eller pMSCV-Celf1Flag-Puro) i 1 ml serum-fritt vekstmedium. Vortex kort. Tilsett 30 mL transfeksjon reagens fra trinn 2.2.2 i DNA / serum-fritt vekstmedium rør, og bland godt ved hjelp av vortex. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 min.
- Legg transfeksjon blandingen dråpevis til ekotropisk HEK 293-baserte pakkingscellene. Forsiktig virvel platene og returnere dem tilbake til 5% CO 2, 37 ° C inkubator. Etter 24 timer, endre media til 10 ml forvarmet frisk vekst medium.
- Høste supernatanten (inneholdende retrovirus) 48 timer etter transfeksjon ved hjelp av en pipette og overføres supernatanten til et 50 ml sentrifugerør. Tilsett 10 ml av nye varme medier til platen og returnere det til inkubatoren. Hold supernatanten ved 4 ° C.
Merk: Medie legges forsiktig til than side av brønnen for ikke å forstyrre celle monolag. - Høste andre parti av supernatant 60 timer etter transfeksjon og basseng det med supernatanten fra 2.2.5. Sentrifuger ved 500 xg, 4 ° C i 7 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale.
- Overfør supernatanten til et nytt 50 ml sentrifugerør. Bruk retrovirus for å transdusere C2C12-celler ved dette punktet ved å fortsette til trinn 2.2.9 eller alikvot og lagre den overliggende væske ved -20 ° C for fremtidig bruk.
- Tine retrovirus fra 2.2.7 ved værelsestemperatur, hvis et frossent lager er brukt her.
Merk: Unngå flere fryse-tine sykluser. - Plate C2C12 celler på samme dag av transduksjon sikter på 30 - 40% av samløpet.
- Kast vekstmediet og vaskes C2C12-celler sammen med 3 ml PBS romtemperatur. Fjern PBS, tilsett 500 ul 0,25% Trypsin-EDTA, og inkuber platen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 3 - 5 min.
- Nøytralisere trypsin ved å tilsette 3 ml vekst MedIUM. Pipetter 6 - 8 ganger for å suspendere cellene. Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og tilsett 8,0 x 10 5 C2C12-celler til en 60 mm plate.
- Tilsett 0,5 ml retrovirus for å infisere en 60 mm plate av celler i 3 ml vekstmedium. Returnere platen til inkubatoren.
- Erstatt med 3 ml friskt medium supplert med antibiotika utvalg (puromycin 1 - 3 pg / ml) 48 timer etter infeksjon. Erstatt 3 ml medium med antibiotika hver dag for ~ 5 dager til untransduced C2C12 kontroll kultur dør ut.
- Forbered HEK 293 kulturmedium ved å supplere DMEM høy glukose med 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin.
- Lentivirus forberedelse og C2C12 lentiviral transduksjon
Merk: Utfør alle lentivirus relaterte prosedyrer i biosikkerhetsnivå 2 skap og følg biologiske sikkerhetsretningslinjer. Flytende avfall som inneholder viruset må desinfiseres før avhending.- Plate 4,0 x 10 6 293T-celler i en 100 mm skål (~ 80% konfluens på dagen for transfeksjon) med HEK 293-cellekulturmedium (DMEM høy glukose, supplert med 10% føtaltbovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin) 24 timer før transfeksjon.
- Varm transfeksjon reagens til romtemperatur. Bland lentiviral emballasje vektorer (4 ug pMD2.G og 6 ug psPAX2) sammen med 8 ug lentiviral overføringsvektor (Celf1 shRNA eller kryptert kontroll shRNA) i 1 ml serumfritt cellekulturmedium. Vortex kort.
- Legg 36 mL forvarmet transfeksjon reagens til DNA / DMEM tube og bland godt med vortex. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 min.
- Fjern 293T celler fra inkubatoren og legge til transfeksjon blandingen til plate. Forsiktig virvel platen og returnere det tilbake til 5% CO 2, 37 ° C inkubator. Etter 24 timer, må du bytte transfeksjon blanding med 10 ml friskt kulturmedium.
- Samle supernatanten som inneholder lentivirus 48 timer etter transfeksjon, og overføre den til et 50 ml sentrifugerør. Tilsett 10 ml nye varme medier til platen og returnere dentil kuvøse. Oppbevar supernatanten ved 4 ° C.
- Samle andre parti av supernatant 60 timer etter transfeksjon og kombinere det med supernatanten fra 2.3.5. Sentrifuger en kort stund ved 500 xg, 4 ° C i 7 min.
- Overfør supernatanten til et nytt 50 ml sentrifugerør. Hvis du bruker fersk virus, fortsett til trinn 2.3.9. For fremtidig bruk, lagre virusholdige supernatant ved -20 ° C i alikvoter på 10 ml.
- Tine viruset fra 2.3.7 i romtemperatur før bruk, hvis en frossen lager blir brukt.
Merk: Unngå flere fryse-tine sykluser. - Plate C2C12-CUG200 celler (oppnådd i punkt 2.1) som beskrevet i 2.2.9 på samme dag av transduksjon.
Merk: Mål for 30 - 40% av samløpet. - Tilsett 0,5 ml virus å infisere en 60 mm plate av C2C12-CUG200 og returnere platen til inkubatoren.
- Erstatte dyrkningsmediet med friskt medium supplert med det merkede antibiotika (puromycin 1 - 3 pg / ml) 72 timer etter transduksjon.Oppdater kultur media hver dag med valget antibiotika for ~ 5 dager før alle untransduced C2C12-CUG200 kontroll kultur dør ut.
- Bruk Western blot for å verifisere Celf1 knockdown i GFP-CUG200 transfekterte celler.
3. C2C12 celledifferensiering
- Plate 2 x 10 6 celler i en brønn i en seks-brønns plate i 2,5 ml vekstmedier 24 timer før oppstart av differensiering.
Merk: pletteringstettheten kan justeres slik at full konfluens er nådd i 24 timer.- Skyll sammenflytende celler med PBS og tilsett 2,5 ml av lav-serum differensieringsmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 2% hesteserum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1 pM insulin) . Bytt medium annenhver dag.
Merk: Hold lager insulin frosset og legge den til media ved hvert medium endring.
- Skyll sammenflytende celler med PBS og tilsett 2,5 ml av lav-serum differensieringsmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 2% hesteserum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1 pM insulin) . Bytt medium annenhver dag.
- Under C2C12 differensiering, samle inn prøver for quantitative RT-PCR (se punkt 4) på følgende tidspunkter: Day0, 1, 2, 4 og 6. Prosess kulturen for farging i dag 6-8 (se kapittel 5).
4. RNA Isolation og kvantitativ RT-PCR
- Bruk produsentens protokoll for RNA isolering. Etter isolering resuspender pelleten RNA i 30 ul RNase-fritt vann og pipetter opp og ned flere ganger.
Merk: Prøvene kan gå videre til Kvantitativ RT-PCR eller kan lagres ved -80 ° C. - Bruk en RT qPCR kit for kvantitativ RT-PCR 10 og følg produsentens anvisninger. Forbered reaksjonsblandingen i henhold til tabell 1.
| Komponent | Volum (mL) | endelig Konsentrasjon |
| 2x reaksjon buffer | 10 | 1x |
| Forward primer | 0.5 | 200 nM |
| omvendt primer | 0.5 | 200 nM |
| Sonde | 0.5 | 200 nM |
| Revers transkriptase og RNase Inhibitor | 0.1 | 0,25 U / ml |
| Mal | 1 | 100 ng total-RNA |
| RNase fritt vann | 7.4 | NA |
| Total Mix | 20 |
Tabell 1. Kvantitativ RT-PCR Master Mix Forberedelse
- Kjør en 20 ul RT-qPCR reaksjon ved hjelp av termisk profil Tabell 2.
| Revers transkripsjon steg | 30 min, 48 ° C |
| DNA-polymerase aktivering / revers transkriptase inaktive | 10 min, 95 ° C |
| 40 Cycles | 15 sek, 95 ° C |
| 1 min, 60 ° C |
Tabell 2. Kvantitativ RT-PCR termiske profil
5. Farging
- Fest monolagskultur i 2,5 ml nyfremstilt 4% paraformaldehyd / PBS ved romtemperatur i 10 min.
- Permeabilize prøvene i 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS i 30 min ved romtemperatur.
- Overføre prøvene til et fuktet kammer. Blokkere prøver i 2,5 ml blokkeringsbuffer (0,1% ikke-ionisk overflateaktivt middel / PBS, 10% normalt geiteserum) i 30 minutter ved 37 ° C.
- Kast blokkeringsbuffer og anvende 800 ul primære antistoff mot Myosin Heavy Chain fortynnet i blokkeringsbuffer (1: 100). Inkuber i et fuktet kammer over natten ved romtemperatur.
- Vask platen 3 times (10 min hver) med 2,5 ml vaskebuffer (0,1% polysorbat 20 / PBS) på dag to.
- Fjerne vaskebufferen og anvende 800 pl sekundært antistoff (geite-anti-mus IgG, 1: 500 fortynnet i PBS). Inkuber i et fuktet kammer ved romtemperatur i 1 time.
- Vask to ganger (10 min hver) med 2,5 ml vaskebuffer.
- Inkuber med 800 ul DAPI (1 ug / ml, fortynnet i destillert avionisert H2O) i 5 minutter.
- Vask med 2,5 ml vaskebuffer på nytt i 10 min.
- Endre vaskebuffer til 2,5 ml PBS og bruke et fluorescerende mikroskop for å ta bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C2C12 celler ble transfektert med GFP-CUG5 eller GFP-CUG200. Etter medikamentresistens seleksjon, ble stabile bassenger etablert, som kan visualiseres ved GFP uttrykket (figur 1A). Myotube dannelse i de differensierte myoblaster ble påvist ved myosin tungkjede farging 10 (figur 1B). Kvantifisering av myotube formasjonen viste at fusjons indeksene ble redusert fra 35,4 ± 4,1% til 2,6 ± 1,1% og myotube områder ble redusert fra 35,6 ± 2,2% til 2,7 ± 0,8% av unormal CUG ekspansjon i GFP-CUG200 (figur 1C). Fusjonsindeksen og myotube område ble tellet via det totale antall kjerner i myotubes (≥ to kjerner) dividert med det totale antall kjerner, og prosentandelen av det totale bildeområdet som dekkes av myotubes, respektivt. Sanntids RT-PCR 10 ble utført for å analysere ekspresjon av en rekke forskjellige muskeliation relaterte gener inkludert myod, MyoG, Mef2c og Celf1. Sammenlignet med CUG5 kulturer, øket CUG200 ekspresjonen av mRNA Celf1 i prolifererende myoblaster ved begynnelsen av differensiering. Sammenfallende med tidligere rapporter, ble Celf1 oppregulering forbundet med CUG-ekspansjon i myogenic dystrofi 1 (figur 1D). Videre Western blotting 10 konsekvent viste Celf1 proteinnivå ble forhøyet (figur 1E), og CUG200 hemmet uttrykk for myod, MyoG og Mef2c under differensiering (figur 1D). Disse resultatene tyder på at CUG-utvidelsen fører til myotube skader og nedsatt myoblast differensiering.
For å studere rollen Celf1 i myoblast differensiering, ble pMSCV- Celf1Flag retroviral vektor konstruert for å transduce C2C12 celler. 10 puromycin-resistente kloner ble slått sammen for differensiering studier. Western blot Resultatene viste at the Flag-tagged Celf1 var bare til stede i pMSCV-Celf1Flag omsatte kulturer og uttrykk for Celf1 protein ble oppregulert (figur 2A). Dannelsen av myotubes i Celf1-overuttrykkende celler er sjelden når sammenlignet med kontrollkulturer (figur 2B), noe som antyder at overekspresjon av Celf1 alvorlig svekker myoblast differensiering.
For å avgjøre om Celf1 knockdown redder differensieringen mangel i CUG-utvidelse celler, ble Celf1 shRNA levert til GFP-CUG200 celler ved lentiviral vektorer. Doble resistente kloner (G418 og puromycin) ble valgt ut og slått sammen for differensiering studier. Nivået av endogent Celf1 protein ble markert redusert i nærvær av Celf1 shRNA (figur 3A). Etter 6 dager med differensiering, effekten av Celf1 shRNA på å øke myotube dannelse var tydelig (figur 3B). Fusion indekser og myotube ersom var 16,1 ± 3,0% og 15,2 ± 1,2%, respektivt, sammenlignet med 4,6 ± 0,8% og 5,1 ± 1,3% i kontrollkulturer (figur 3C). I mellomtiden, real-time RT-PCR resultater tyder på at uttrykket av myod, MyoG og Mef2c ble betydelig økt i Celf1 shRNA celler (Figur 3D) støtter Celf1 knockdown reddet myocyte differensiering mangel.
Figur 1. CUG-Expansion Hemmer myocyte Differensiering i C2C12 Cells. (A) C2C12 cellene uttrykte GFP-CUG5 eller GFP-CUG200 overalt etter valget. Skala barer er 100 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra vår forrige papir 10. (B) Myotubes ble dannet i GFP-CUG5 celler, men mindre i GFP-CUG200 celler. Myotubes ble visualisert ved myosin tung kjede (MF-20) immunfarging. Skala barer er 100 mikrometer. (C) (D) Real-time RT-PCR analyse av Celf1, transkripsjon faktorer myod, MyoG, og Mef2c uttrykk under myoblast differensiering. mRNA-nivåer ble nedtegnet etter GAPDH normalisert. Feilstolpene representerer standardavvik. Student t-testen ble utført for å sammenligne prøvene med kontrollene. n> 3, * P <0,05. (E) GFP-CUG200 transfeksjon økt Celf1 protein uttrykk. ß-aktin er vist som lasting kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Overuttrykte Celf1 Svekker Myoblast Differensiering. (A) Bevis for eksogene Celf1Flag EXPREssion i C2C12 celler ved Western blot. (B) Myotube formasjonen ble svekket i Celf1Flag-overekspresjon C2C12 myoblasts. Myotubes ble visualisert ved MF-20 immunfarging. Skala barer er 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. knockdown av Celf1 Delvis berger CUG-Expansion-Induced Myoblast Differensiering mangel. (A) Bevis på Celf1 knockdown av Western blot. (B) Celf1 shRNA indusert myotube formasjonen i GFP-CUG200 myoblasts. Myotubes ble visualisert ved MF-20 immunfarging. Skala barer er 100 mikrometer. (C) Celf1 shRNA-reddet celler som hadde økt fusjon indeks- og myotube områder. Feilstolpene representerer standardavvik. (D) Real-time RT-PCR analyse av Celf1, transkripsjon faktorer myod, MyoG, og Mef2c uttrykk under differensiering. mRNA nivået ble plottet etter normalisering til den for GAPDH. Feilstolpene representerer standardavvik. Student t-testen ble utført for å sammenligne prøvene til kontroll. n> 3, * P <0.05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C2C12 cellelinje har blitt brukt som modell for å studere myogenesen 11-14. Disse cellene beholde en fibroblast-lignende utseende, sprer seg raskt i media inneholdende 20% føtalt bovint serum og lett skille i media inneholdende 2% hesteserum 15. Den raske vekst og differensiering er fordelaktige egenskaper i en myogenesen celle modell. Her viser vi bruken av plasmidet, retroviral og lentiviral vektorer for å innføre cDNA, 3'-UTR, og shRNA inn C2C12 celler. De kritiske punktene for transfeksjon / transduksjon og vedlikehold av konsistens i differensiering er uthevet nedenfor.
Celletettheten i celle daglig vedlikehold er kritisk. Disse cellene må dyrkes under 50 - 70% samløpet. På grunn av den korte befolkning doblingstiden, spontant skiller høy konfluens (> 70%) C2C12 kultur når stå natten over. Mens den fraksjon av spontant differensierte celler, kan være liten, nærværetav differensierte celler vil bidra til uoverensstemmelser i påfølgende differensiering eksperimenter. I tillegg fersk tinte C2C12 celler som har lav passasje antall foretrekkes. For differensiering, blir cellene sådd ut ved forhåndsbestemte tall, slik at de oppnår full konfluens etter 24 timer. Insulin er holdt frosset i små porsjoner og tilsettes hver gang differensieringsmediet blir endret. Disse tiltakene bedre differensiering utfall.
Serum fritt medium forbedrer C2C12 celle transfeksjon. Cellene kan inkuberes i transfeksjon blanding / serumfritt medium over natten. I vårt laboratorium, oppnår vi opp til 20% transfeksjon hastighet, ledsaget av liten tegn på cytotoksisitet. Konsentrasjonen av stoffet som brukes for å velge C2C12 celle er høyere, 1,2 til 1,6 mg / ml G418 eller 1 til 3 ug / ml puromycin, og varigheten av det merkede er lengre enn de fleste andre cellelinjer. På grunn av potensiell toksisitet under høyt legemiddelkonsentrasjonen og den utvidede inkubasjonstiden, lot til myevariasjon i differensiering potensial kan oppstå. Det er viktig å justere utvalget ordningen (konsentrasjon og varighet) basert på celle utseende og for å behandle eksperiment- og kontrollgrupper sammen.
Vi har med hell innført GFP-CUG200 inn C2C12 celler som reproduserer 3'-UTR CUG ekspansjon i DM1. Vi presenterer Celf1 inn C2C12 celler og Celf1 shRNA inn GFP-CUG200 C2C12 celler har tillatt evalueringen av cellulære og molekylære hendelser utløst av Celf1 oppregulering og utforskning av målretting Celf1 å hjelpe DM1 myoblast differensiering, henholdsvis. Oppsummert C2C12 myoblast modellen presenteres her fordeler etterforskningen av myotonic dystrofi samt generell muskelcellebiologi og myogenic differensiering. Begrensningen i denne modellen er at funnene i cellelinjer kanskje ikke helt strekker til organismer. Funnene i dagens modeller er ofte avanserte til å isolere friske myoblasts fra dyr og studere deres differentiasjon. Til syvende og sist vi bygge myoblast funn i organismer.
Den unike styrken i denne studien er multi-tier genmanipulering i C2C12 myoblasts, som muliggjør modellering sekvensielle genetiske / patologiske hendelser i DM1. Tidligere ble RNA toksisitet effekten av DMPK CUG utvidelse dokumentert i myoblasts 11-14, mens de patologiske roller Celf1 ble separat studert i musemodeller 16,17. Modellering disse sekvensielle genetiske / patologiske hendelser er teknisk krevende og tidkrevende hvis det utføres i dyremodeller. Som vist i denne studien, tillater den kombinerte anvendelse av fluorescerende og medikamentresistente markører modellering av ytterligere molekylære hendelser i myotonisk dystrofi. Modellene etablert i denne studien vil være nyttig i å dissekere de detaljerte mekanismene i DM1 patogenese. De vil også være verdifulle i screening for legemidler som er rettet mot ulike trinn av DM1 patogenesen. Strategier og prosedyrer for dettestudien kan belyse etablere andre muskulære sykdomsmodeller i myoblasts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
