Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تسليم العلاجية سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الموجبة وأنيوني الليبوزومات

Published: July 23, 2016 doi: 10.3791/54106
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

Introduction

البريونات هي الأمراض العصبية الشديدة التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. أمراض البريون تنتج من misfolding من بروتين بريون الخلوي العادي، بي ار بي سي، من خلال آيزومور المعدية يسمى بي ار بي الدقة. هذه الأمراض تؤثر على مجموعة واسعة من الأنواع بما في ذلك مرض جنون البقر في بقرة، سكرابي في الأغنام ومرض الهزال المزمن في cervids، ومرض كروتزفيلد جاكوب في البشر 1-3. البريونات تسبب التنكس العصبي الذي يبدأ مع فقدان متشابك، ويتقدم لتشكل الفجوات، دباق، وفقدان الخلايا العصبية، والترسبات. في نهاية المطاف، مما أدى إلى موت الحيوان / الفردي 4. على مدى عقود، وقد حقق باحثو تهدف إلى إبطاء أو وقف تطور مرض بريون. ومع ذلك، لم يتم العثور على الباحثين إما العلاج الناجح أو وسيلة فعالة لتوصيل النظامية.

مطلوب الذاتية التعبير بي ار بي سي لتطور أمراض البريون 5 C التعبير في تأخير أو تحسين من المرض. خلقت عدة مجموعات الفئران المعدلة وراثيا مع انخفاض مستويات بي ار بي C أو lentivectors حقن معربا عن shRNA مباشرة إلى أنسجة المخ الفئران للتحقيق في دور مستويات التعبير بي ار بي سي في مرض بريون. أدت هذه وجد الباحثون تقليل كمية الخلايا العصبية بي ار بي سي في وقف الأعصاب التدريجي للأمراض البريون وتمديد حياة الحيوانات 6-9. لقد ذكرت أن نتائج العلاج بي ار بي سي سيرنا في تطهير بي ار بي الدقة في الخلايا العصبية الماوس 10. وتشير هذه الدراسات إلى أن استخدام العلاج لخفض مستويات التعبير بي ار بي سي، مثل صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا)، الذي يشق مرنا، قد يؤخر بما فيه الكفاية تطور أمراض البريون. ومع ذلك، تم تسليم معظم العلاجات التحقيق لأمراض البريون بطرق لن يكون عمليافي عملية إعداد سريرية. ولذلك، فإن العلاج سيرنا يحتاج إلى نظام تسليم النظامية، والتي يتم تسليمها عن طريق الوريد وهادفة إلى الجهاز العصبي المركزي.

وقد درس الباحثون استخدام الجسيمات الشحمية بوصفها وسائل إيصال للمنتجات العلاج الجيني. كلاهما يستخدم الدهون الموجبة والأيونية في تشكيل الجسيمات الشحمية. وتستخدم الدهون الموجبة أكثر على نطاق واسع من الدهون أنيوني لأن الفرق تهمة بين الدهون الموجبة وDNA / RNA يسمح للتعبئة فعالة. ميزة أخرى من الدهون الموجبة هي أنها عبور غشاء الخلية بسهولة أكثر من الدهون الأخرى 11-14. ومع ذلك، والدهون الموجبة أكثر مناعة من الدهون أنيوني 13،14. ولذلك، فقد بدأ الباحثون في التحول من استخدام الموجبة لأنيونية الدهون في الجسيمات الشحمية. منتجات العلاج الجيني يمكن تعبئتها بكفاءة في الجسيمات الشحمية الأيونية باستخدام موجبة كبريتات الببتيد بروتامين، التي يتكثف جزيئات DNA / RNA 15-19. منذ معهد العلوم الإندونيسي انيونيس أقل مناعة من الدهون الموجبة أنها قد زادت مرات الدورة الدموية، ويمكن أكثر التسامح في النماذج الحيوانية 13،14. وتستهدف الجسيمات الشحمية لأنسجة معينة باستخدام استهداف الببتيدات التي تعلق على الجسيمات الشحمية. ونيوروبيبتيدي RVG-9R التي تربط لمستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية وقد استخدمت لاستهداف سيرنا والجسيمات الشحمية إلى الجهاز العصبي المركزي 17-20.

ويعرض هذا التقرير على بروتوكول لإنتاج ثلاث عربات تسليم سيرنا، وحزم وتسليم سيرنا إلى الخلايا العصبية (الشكل 1). وتتكون المجمعات الحويصلية سيرنا الببتيد (LSPCs) من الجسيمات الشحمية مع سيرنا وRVG-9R استهداف الببتيد تعلق كهربية إلى السطح الخارجي للالحويصلية. تناول الببتيد الحويصلية مغلفة العلاجية سيرنا (PALETS) وتتكون من سيرنا وبروتامين مغلفة ضمن الجسيمات الشحمية، مع RVG 9R المستعبدين تساهميا إلى مجموعة الدهون PEG. باستخدام الأساليب التالية لتوليد LSPCs وPALETS، بي ار بي سي سيرنا يقلل بي ار بي C التعبير تصل إلى 90٪ في الخلايا العصبية، التي يحمله من آمال عريضة لعلاج أو إلى حد كبير تأخير ظهور الأمراض مرض بريون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كانت ولدت كل الفئران والحفاظ على الثروة الحيوانية مختبر، المعتمدة من قبل جمعية للتقويم والاعتماد للمختبر رعاية الحيوان الدولية، وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ولاية كولورادو.

1. إعداد LSPCs

  1. استخدام 1: DOTAP 1 (1،2-dioleoyl-3-trimethylammonium-البروبان): نسبة الكولسترول لLSPCs. ل4 إعداد الحويصلية nmole، مزيج 2 nmoles من DOTAP و 2 nmoles الكولسترول إلى 10 مل من 1: حل الميثانول في قارورة: 1 الكلوروفورم.
  2. تتبخر 9 مل من الكلوروفورم: حل الميثانول باستخدام N 2 الغاز في غطاء الدخان. تتبخر 1 مل الأخيرة من المذيبات في غطاء الدخان ليلة وضحاها بدون غاز. مراقبة فيلم الدهون رقيقة على الجزء السفلي من القارورة.
  3. الحرارة 10 مل من محلول السكروز 10٪ إلى 55 درجة مئوية.
  4. من أجل حل ساخنة 10٪ السكروز على الفيلم الدهون رقيقة ببطء، أي 1 مل / دقيقة، في حين أن شركة جنرال الكتريكيحوم ntly القارورة. الحفاظ على السكروز 10٪ وقارورة مع الدهون في 55 درجة مئوية بحيث تبقى جزيئات الدهون في مرحلة هلام السائل. نتائج الإماهة في الحويصلة (MLV) تشكيل الصفاحات.
  5. السماح الدهون لترطيب عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل تغيير حجم الجسيمات الشحمية.
  6. تجميع الطارد في تعليمات الشركة الصانعة مع 1.0 ميكرون مرشحات أو استخدام مرشحات حقنة 1.0 ميكرون لتحجيم.
  7. إضافة 1 مل من تعليق الحويصلية تسخينها إلى واحدة من الحقن على الطارد، وتمرير تعليق بين الحقن اثنين 11 مرة. تأكد من أن العملية تعتبر حقنة المعاكس من الحقنة تبدأ بعد 11 ممرات.
  8. حجم الجسيمات الشحمية مرة أخرى من خلال 0.45 ميكرون ثم 0.2 ميكرون مرشحات لتوليد الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs). حافظ على تعليق الحويصلية ساخنة لتسهيل التحجيم.
  9. احتضان 20 ميكرولتر من 4 nmole تعليق الحويصلية (200 ميكرومتر) مع 200 ميكرولتر من 20 ميكرومتر (4مجموعه nmole) حل سهم سيرنا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. احتضان 80 ميكرولتر من 500 ميكرومتر (40 nmole الكل) الأسهم حل RVG-9R مع الحل / الحويصلية سيرنا لمدة 10 دقيقة في RT. وينبغي أن تستخدم LSPCs في أقرب وقت ممكن ولكن يمكن استخدام ما يصل إلى عدة ساعات بعد الإعداد. متجر LSPCs في 4 درجات مئوية لعدة ساعة بعد الإعداد.

2. إعداد PALETS

  1. استخدام 55: نسبة 5 الرحى إما DSPE (1،2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine): 40 الكوليسترول: DSPE-PEG أو DOTAP: الكولسترول: DSPE-PEG لPALETS. ل4 إعداد الحويصلية nmole، مزيج 2.2 nmoles إما DSPE أو DOTAP، 1.6 nmoles من الكولسترول، و 0.2 nmoles من DSPE-PEG إلى 10 مل من 2: حل الميثانول في قارورة: 1 الكلوروفورم.
  2. إعداد تعليق الحويصلية بالضبط كما هو موضح في الخطوة 1.1 و 1.2 أعلاه. ترطيب الجسيمات الشحمية DSPE في 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X تسخينها إلى 75 درجة مئوية، بإضافة 1 مل / دقيقة. السماح الدهون لترطيب عند 75 درجة مئوية لمدة فيأقل 1 ساعة قبل التحجيم.
  3. حجم تعليق الحويصلية بالضبط كما هو موضح في الخطوة 1،6-1،8.
  4. الماصة كانت 20 ميكرولتر من كل واحد من 4 nmole (200 ميكرومتر) تعليق الحويصلية إلى قسامات تستخدم مرة واحدة بعد DOTAP وDSPE الجسيمات الشحمية الحجم، ويجفد لمدة 30 دقيقة باستخدام مجفف الفوق تجميد (الشكل 2).
  5. احتضان 200 ميكرولتر من 20 ميكرومتر (4 nmole الكل) الأسهم حل سيرنا مع 1.4 ميكرولتر من محلول 26.6 ميكرومتر من سلفات بروتامين لمدة 10 دقيقة في RT لسيرنا الذي هو أن تكون مغلفة في الجسيمات الشحمية DSPE PALETS.
  6. ترطيب الجسيمات الشحمية DOTAP PALETS مع 200 ميكرولتر من محلول المخزون nmole 4 من سيرنا أو ترطيب الجسيمات الشحمية DSPE PALETS مع 201.4 ميكرولتر من محلول / بروتامين سيرنا. احتضان الحويصلية / سيرنا حل لمدة 10 دقيقة في RT.
  7. إضافة 10 ميكرولتر من 60 ملي 1-إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) حل الحويصلية / حل سيرنا على حد سواء DOTAP وDSPE PALETS.
  8. إضافة 10 ميكرولتر من حل 150 ملي N-hydroxysulfosuccinimide (سلفو NHS) إلى الجسيمات الشحمية / حل سيرنا على حد سواء DOTAP وDSPE PALETS.
  9. احتضان EDC وسلفو NHS مع تعليق / الحويصلية سيرنا لمدة 2 ساعة على RT.
  10. احتضان 80 ميكرولتر من 500 ميكرومتر (40 nmole الكل) الأسهم حل RVG-9R مع سيرنا / الحويصلية يشابك حل لمدة 10 دقيقة في RT.
    ملاحظة: EDC / سلفو NHS يسمح للRVG-9R إلى السندات تساهمي إلى الدهون PEG. استخدام PALETS في غضون عدة ساعة بعد الإعداد. متجر PALETS في 4 درجات مئوية لعدة ساعة بعد الإعداد.
  11. لتحديد سيرنا كفاءة التغليف من PALETS:
    1. قياس تركيز سيرنا قبل وبعد إضافة بروتامين والجسيمات الشحمية باستخدام مقياس الطيف الضوئي التي وضعت في 260 نانومتر.
    2. تصفية سيرنا unencapsulated من الجسيمات الشحمية / التعليق سيرنا مغلفة باستخدام 50 كيلو دالتون مرشحات الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة.
    3. قياس تركيزسيرنا unencapsulated في الترشيح وتركيز سيرنا مغلفة في retentate باستخدام معمل في 260 نانومتر.

3. حقن الفئران مع LSPCs أو PALETS

  1. كشف الفئران لمدة 5-10 دقيقة لمصباح الحرارة إلى تمدد الأوعية الدموية.
  2. تخدير الماوس مع 2-3٪ آيزوفلوران / الأكسجين تدفق 5-10 دقيقة قبل الحقن، وأثناء الحقن. تأكيد التخدير عند الحيوان لم يعد متنقل وتباطأت التنفس عن طريق القيام قرصة أخمص قدميه. ضع الماوس على ظهرها أو الجانب للوصول إلى الوريد الذيل. استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني في عيون الماوس لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  3. مسح / رذاذ الذيل مع 70٪ ETOH وحقن 300 ميكرولتر من LSPCs أو PALETS على الوريد ذيل الماوس باستخدام 26 G حقنة الأنسولين. البدء في ضخ بشكل أقصى في الوريد الذيل ونقل قريب إذا الوريد ينهار أو تمزقات.
  4. ضع الماوس في قفص نظيفة حتى يحافظ على الاستلقاء القصية. لا تضع مواستخدام مع زملائه في قفص آخر حتى تعافى تماما. يجب أن الفئران على التعافي في 5 إلى 15 دقيقة. يمكن وضعها على وسادة التدفئة أو تحت مصباح الحرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم إذا الانتعاش وقتا أطول. ينبغي رصد الفئران عن كثب لحماية ضد الإفراط في التدفئة.
  5. رصد عدة ساعات بعد الحقن الحيوانية لضمان التخدير يلبس، وليس هناك أي آثار الضارة للعلاج. السماح للLSPCs أو PALETS أن تعمم لمدة 24 ساعة على الأقل.

4. تحليل التعبير البروتين عن طريق التدفق الخلوي

  1. الموت ببطء الفئران مع معدل تدفق 20٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة.
  2. تشريح خارج نصف الكرة الأرضية من الدماغ عن طريق قطع بعيدا الجلد والجمجمة من الفأرة باستخدام المقص. قشر بعيدا نصف الكرة الأرضية من الدماغ بعيدا من الجمجمة باستخدام ملقط أو نهاية مقصا.
  3. الصحافة نصف الكرة الأرضية من الدماغ من كل فأر خلال 40 ميكرون خلية شبكة مصفاة باستخدام 2.5 مل من العازلة FACS (1X، PBS، 1٪ الجنين المصل البقري، 10 ملي EDTA) في طبق بيتري مع المكبس من حقنة.
  4. شطف مصفاة الخلية وطبق بيتري مع 2.5 مل إضافية من FACS العازلة. وضع تعليق خلية واحدة في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
  5. الماصة 100 ميكرولتر من 5 مل تعليق خلية واحدة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 ز س. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل من FACS العازلة. تدور في 350 x ج لمدة 5 دقائق. كرر مع 1 مل أخرى من FACS العازلة. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد.
  6. احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من 1: 100 التخفيف من 0.5 ملغ / مل الفئران كتلة مكافحة فأر التيسير في المخزن FACS لمدة 30-60 دقيقة على الجليد. بيليه وغسل الخلايا كما في الخطوة 4.5. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد.
  7. احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل الأجسام المضادة الفلورسنت ضد الماوس بي ار بي سي في 7٪ مصل الفأر في المخزن FACS على الجليد لمدة 30-60 دقيقة. بيليه وغسل الخلايا كما في الخطوة 4.5. الحفاظ على تعليق خليةعلى الجليد.
  8. بيليه وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من العازلة تحلل RBC (برنامج تلفزيوني 1X، 155 ملي NH 4 CL، 12 مم NaHCO 3، 0.1 ملي EDTA) لمدة 1 دقيقة. بيليه كما في الخطوة 4.5 و resuspend الخلايا في 1 مل من FACS العازلة. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد.
  9. تحليل بي ار بي C التعبير باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا (10). بوابة تعيش الخلايا من مجموع السكان الخلية. بوابة بي ار بي C + الخلايا من سكان الخلية الحية لتحديد مؤسسات التمويل الأصغر (كثافة الفلورسنت متوسط).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لزيادة كفاءة سيرنا التغليف داخل PALETS الأيونية، كان سيرنا مختلطة مع بروتامين. لتحديد أفضل تركيز بروتامين لسيرنا، كان سيرنا مختلطة مع تركيزات مختلفة من بروتامين، من 1: 1-2: 1 (الشكل 3A). كان هناك 60-65٪ سيرنا كفاءة التغليف في الجسيمات الشحمية الأيونية دون استخدام بروتامين. كان 1 (133-266 نانومتر) 80-90٪ سيرنا التغليف: العينات مع بروتامين: النسب المولية سيرنا من 1: 1 و 1.5. نسب المولي فوق 1.5: 1 أسفرت عن هطول الأمطار من المجمعات / بروتامين سيرنا. لم تكن مغلفة هذه المجمعات عجلت في الجسيمات الشحمية الأيونية. بعد إضافة بروتامين إلى سيرنا كان هناك انخفاض طفيف في تركيز سيرنا، بسبب التخفيف. ومع ذلك، ظل تركيز مستقر بعد إضافة بروتامين (الشكل 3B). بعد تصفية الجسيمات الشحمية مع 50 مرشحات كيلو دالتون، 90-95٪ من سيرناكان مرتبطا مع retentate الحويصلية، في حين أن 5-10٪ من سيرنا "الحرة" في الترشيح. تم الكشف لا سيرنا في بروتامين أو الحويصلية عينات فقط (الشكل 3C).

لتحديد تأثير LSPCs في الجسم الحي، وعولج الفئران wildtype مع LSPCs لمدة 24 ساعة. وتمت مقارنة مستويات التعبير بي ار بي سي من الفئران wildtype تعامل مع LSPCs إلى الفئران التي عولجت مع برنامج تلفزيوني 1X وخروج المغلوب PRP (بي ار بي KO) الفئران (الشكل 4). تحليل تدفق cytometric من بي ار بي سي في أدمغة الفئران التي عولجت مع LSPCs أظهرت انخفاضا في مستويات بي ار بي سي (الشكل 4A و 4B). في تجربة واحدة، كانت جميع الفئران للحد من 80-90٪ من مستويات بي ار بي سي، بالقرب من مستويات بي ار بي سي التي لوحظت في الفئران بي ار بي KO الشكل (4A). وأظهرت الفئران التي عولجت مع LSPCs في تجربتين أكثر استقلالية انخفاض 40-80٪ من بي ار بي سي </ sup> في المستويات (الشكل 4B). من مجموع LSPCs الفئران التي عولجت (ن = 14)، وكان هناك زيارتها الماوس واحد فقط أي رد إلى LSPCs.

شكل 1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول لتوليد PALETS / LSPCs وتسليم سيرنا وريدي إلى الجهاز العصبي المركزي من الفئران تم إنشاء الليبوزومات عبر الفيلم الدهون طريقة ترطيب رقيقة. ان بي ار بي سي سيرنا ثم تعلق على الجسيمات الشحمية إما عن طريق التفاعل الكهربائي أو عن طريق التغليف. تم الانتهاء من PALETS أو LSPCs بإضافة الجهاز العصبي المركزي استهداف الببتيد RVG-9R. بعد التجميع، / تم حقن PALETS LSPCs في الأوردة ذيل الفئران، وجرى تقييم 24 ساعة بعد العلاج بي ار بي C التعبير عبر التدفق الخلوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: بروتوكول الدهون رقيقة فيلم الترطيب طريقة لتوليد DSPE الليبوزومات لPALETS تسليم السيارة وتم حل الدهون ومختلطة في الكلوروفورم: حل الميثانول، الذي تبخرت لتوليد فيلم الدهون الجافة. وكان معلق الفيلم الدهون الجافة في برنامج تلفزيوني 1X لخلق الحويصلات الصفاحات (MLVs). وبعد ذلك الحجم MLVs موحد باستخدام الطارد لتوليد LUVs. ويمكن بعد ذلك LUVs استخدامها في تعليق، أو مجفف بالتجميد في قسامات تستخدم مرة واحدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: تغليف كفاءة سيرنا إلى DSPE PALETS ش الغناء بروتامين سلفات. (A) عن 60-65٪ من سيرنا ومغلفة بدون إضافة بروتامين. مع إضافة بروتامين، كان هناك كفاءة التغليف 90٪ بين 1: 1 و 1.5: 1 بروتامين: نسبة سيرنا. (ب) بعد تصفية والجسيمات الشحمية من أي سيرنا الحرة، تم العثور على 90٪ من سيرنا في جزء liposomal، في حين تم العثور على 5-10٪ من سيرنا unencapsulated في الترشيح. (C) بروتامين والحويصلية الحلول فقط خالية من سيرنا مغلفة. وقد لخص عن 60-65٪ من سيرنا داخل الجسيمات الشحمية DSPE دون استخدام بروتامين. مع استخدام بروتامين بتركيز 186.2 نيوتن متر، ومغلفة حوالي 90٪ من سيرنا داخل الجسيمات الشحمية DSPE. أشرطة الخطأ تشير SEM. **** يشير P <0.0001. * يشير P <0.01. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ve_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (4)
تم حصاد الممثل تحليل تدفق Cytometric من معلقات خلايا الدماغ 24 ساعة بعد العلاج مع LSPCs تم حقن LSPCs في الأوردة ذيل الفئران wildtype والعقول بعد 24 ساعة: الرقم 4. وقد استخدم برنامج تلفزيوني كعنصر تحكم العلاج، واستخدام الماوس بي ار بي KO كعنصر تحكم لمستويات بي ار بي سي. (A) الفئران التي عولجت مع LSPCs أظهرت انخفاضا كبيرا في مستويات بي ار بي C مقارنة بالمجموعة الضابطة برنامج تلفزيوني، مما يدل على wildtype مستويات بي ار بي سي. أظهرت LSPCs معاملة الفئران مستويات بي ار بي سي وثيقة إلى أن من الماوس بي ار بي KO. أظهرت (ب) البيانات التراكمية من ثلاث تجارب مستقلة باستخدام نفس 24 بروتوكول العلاج ساعة على مبلغ قريب من بي ار بي سي في برنامج تلفزيوني wildtype وLSPCs الفئران المعالجة. عبر ثلاث تجارب، الفئران التي عولجت مع LSPCs شوالأربعاء انخفاض كبير في مستويات بي ار بي C مقارنة بمجموعة التحكم wildtype برنامج تلفزيوني. أشرطة الخطأ تشير SEM. *** يشير P <0.0003. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويصف هذا التقرير بروتوكول لإنشاء نظامين تسليم المستهدفة التي تنقل بكفاءة سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي. وتضمنت الأساليب السابقة من تقديم سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الحقن ناقلات سيرنا / shRNA مباشرة في الدماغ، والحقن في الوريد من سيرنا المستهدفة، أو الحقن في الوريد من المجمعات الحويصلية سيرنا غير المستهدفة. حقن ناقلات سيرنا / shRNA إلى الجهاز العصبي المركزي لا تسبب انخفاضا في مستويات بروتين تعبير الهدف. ومع ذلك، فإن سيرنا / shRNA لا تنتشر بحرية من خلال الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، هذه الحقن يؤدي إلى تلف الأنسجة 6-9 العصبي المجاور. الحقن في الوريد من سيرنا المستهدفة النتائج أيضا في الحد من البروتين المستهدف. ومع ذلك، فإن معظم سيرنا والتي تدهورت بفعل بروتينات مصل 20. وأخيرا، الحقن في الوريد من غير مستهدفة-الحويصلية سيرنا المجمعات النتائج في فخ من سيرنا داخل الكبد وتدهور من قبل النظام بلعمية وحيدات النوى 21. تسليم سيرناالمركبات المذكورة أعلاه، LSPCs وPALETS، توفير نظام تسليم أكثر أمنا وأكثر فعالية، وأكثر كفاءة من الطرق السابقة من خلال تقديم سيرنا مباشرة إلى الجهاز العصبي المركزي. وLSPCs وPALETS هي أيضا قادرة على نقل المخدرات جزيء صغير الأخرى إلى الجهاز العصبي المركزي.

PALETS أو LSPCs ينبغي أن تستخدم في غضون ساعات قليلة بعد التجميع. وإلا فسيكون هناك خطر من سيرنا تصبح غير وظيفية / متدهورة. الخطوة الهامة الأخرى التي لا يمكن وقفها / توقف هو إعداد وإدارة وتعليق خلية لمدة التدفق الخلوي. ومن المهم لأداء التدفق الخلوي في نفس اليوم الذي أعد تعليق خلية، منذ تعليق يحتوي على الخلايا الحية التي تحتاج إلى أن يكون على قيد الحياة لتحليلها.

هناك بعض الخطوات ضمن البروتوكول الذي يمكن تغييرها تبعا لما إذا كان LSPCs أو PALETS سوف تستخدم في المختبر أو في الجسم الحي، على ما يتم تحميل المخدرات جزيء صغير في LSPCs أو PALETS، وعلى العملatory تفضيل. أولا، النسب المولية الدهون من LSPCs وPALETS يمكن أن يكون الأمثل لتطبيقات أخرى. ومع ذلك، فسفاتيديل إيثانولامين (PE في DSPE) هيدرات سيئة عندما تستخدم في وزن 60٪ / الوزن أو أعلى. عندما تستخدم في هذه التركيزات العالية، وجزيئات DSPE تجميع مع بعضها البعض وتشكل كتلة غير قابلة للذوبان في الدهون. هذا الكم الهائل من الدهون ليست قادرة على تغليف سيرنا. إذا N 2 الغاز غير متوفر، مزيج الدهن يمكن أن تجفف باستخدام التبخر. تبخر يستغرق حوالي 3 أيام، ويجب أن يتم تنفيذ في غطاء الدخان بسبب استخدام الميثانول والكلوروفورم. في هذا البروتوكول، ومعلق الفيلم الدهون رقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X ولكن يمكن أيضا أن يكون معلق مع مخازن الماء الأخرى. وتشمل مخازن أخرى للمياه، و 10٪ سكروز، أو أي عازلة مائي آخر. الاختيار من العازلة الإماهة يعتمد على الاستخدام المقصود من الجسيمات الشحمية وكيل يجري مغلفة داخل الجسيمات الشحمية 22،23. يجب أن تبقى المخزن المؤقت الماء فوق هلام liqسوف المرن الكريستال درجة حرارة التحول (ح أو تيم) من الدهون أو الجسيمات الشحمية لا ترطيب بشكل صحيح. في البروتوكول وصفها، وتغيير حجم الجسيمات الشحمية علقت بشكل موحد باستخدام الطارد. ومع ذلك، فإن الجسيمات الشحمية ويمكن أيضا أن يكون الحجم باستخدام مرشحات حقنة أو صوتنة. نفس أحجام المسام مرشح المستخدمة في الطارد يمكن أن تستخدم مرشحات حقنة. أيضا، وتعليق الحويصلية يمكن تغيير حجمها بعد الترطيب مع الحل سيرنا. ومع ذلك، لاحظنا فقدان سيرنا من الجسيمات الشحمية عندما الحجم من الطارد بعد خطوة الترطيب (بيانات غير منشورة).

وبما أن الدور البيولوجي للبي ار بي سي ليست مفهومة حتى الآن 5، فمن الممكن أنه قد تكون هناك بعض الآثار الضارة الناتجة عن خفض مستويات بي ار بي سي. ومع ذلك، لأن بروتين بريون الفئران ناقص تطوير، تتصرف، والعمر عادة 24، فمن المرجح أن هذه الآثار الضارة إما أن تكون طفيفة أو غير ظاهرة للعيان بشكل واضح. وعلاوة على ذلك، سيرنا ضربة قاضية للبي ار بي <سوب> أن التعبير C لا تلغي تماما تعبير البروتين وهو عكسها تماما دون أية إمكانية لتكون الورم الفيروسي، على عكس lentivector رني 23.

وتشمل القيود مع أنظمة تسليم تقليل امتصاص PALETS الأيونية في الأغشية البيولوجية، والمناعية للLSPCs بسبب الدهون الموجبة. إذا لوحظ المناعية للLSPCs، PALETS يمكن أن تستخدم كبديل. امتصاص منخفض من PALETS الأيونية في الأغشية البيولوجية الأيونية يمكن التغلب عليها باستخدام PALETS الموجبة، أو عن طريق إعادة صياغة PALETS الأيونية مع خليط من الموجبة والدهون الأيونية.

في هذا التقرير، والحد من PrPC يختلف على نطاق واسع من الفأر إلى الماوس. يمكن أن يكون هذا الاختلاف يرجع إلى مجموعة من العوامل: الاختلاف بين الفئران، وقطره صغير من الأوردة في الفئران، أو تدهور سيرنا. استخدام الفئران الفطرية يجب أن يقضي على الكثير من التباين بين الفئران، ولكن الاختلاف هو من الممكن دائما حتىمع الفئران الفطرية. أيضا، توجد لدى الفئران عروق صغيرة جدا بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الأخرى. لذلك، عن طريق الحقن حجم كبير في عروق الفئران يمكن أن يكون مشكلة. نحن نعتقد بأن ممارسة الحقن قبل محاولة حقن PALETS أو LSPCs. ولكن، حتى مع ممارسة، وأحيانا لا يزال يأخذ اثنين من الحقن للحصول على كل حجم PALETS / LSPCs في الماوس، وعلى المنوال يمكن أن ينهار في أي واحد من هذه الحقن. لذلك، قد يتلقى الماوس واحد فقط حجم PALETS / LSPCs، في حين الماوس آخر قد لا يحصلون إلا على 75-90٪ من حجم PALETS / LSPCs.

وتشمل المصادر الأخرى المحتملة لاختلاف التوقيت الدورة الدموية وتدهور سيرنا من البروتينات في الدم. وPALETS / LSPCS أن توزع لفترة أطول قبل الوصول إلى الدماغ في الماوس واحد مقابل لآخر، وهو ما قد يفسر الاختلاف. سمحنا فقط LSPCs أن تعمم لمدة 24 ساعة قبل القتل الرحيم الفئران في التجربة المذكورة أعلاه. إذا كان الوقت تداول يسبب الاختلاف، ثم زيادة circulالوقت أوجه بعد 24 ساعة يجب أن تخفض بعض الاختلاف. على الرغم من أننا حزم سيرنا مع PALETS / LSPCs، وهناك دائما فرصة لتدهور سيرنا و / أو وسائل إيصالها. كما ذكر سابقا، فإن نسبة الدهون الموجبة هي مناعة قليلا. لذا، إذا الخلايا المناعية داخل مجرى الدم يهاجمون المركبات، فإنه سيكون وقتا أطول للمركبات ليتم تسليمها إلى الدماغ أو قد تصبح المركبات المتدهورة. التحول من الدهون الموجبة لأنيونية PALETS قد يساعد على التقليل من وقت التداول بطيئا أو التدهور عند استخدام الدهون الموجبة.

الببتيد RVG-9R ينقل LSPCs وPALETS إلى أي خلية داخل الجهاز العصبي المركزي الذي يحتوي مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية. وهذا يشمل كل من الخلايا العصبية الخلايا الدبقية والخلايا النجمية (26). لPALETS أو LSPCs ليكون علاجا فعالا لأمراض البريون من المهم أن تستهدف جميع الخلايا التي تساهم في التسبب بريون. الخلايا العصبية تحتوي على معظم بي ار بي سي 27،28. يمكن استهداف الخلايا العصبية وتقليل بي ار بي C التعبير الخلايا يؤدي إلى انخفاض المرضية بريون. ومع ذلك، فإن الخلايا العصبية ليست هي نوع من الخلايا الوحيدة التي تساهم في أمراض البريون. قد تورطت الخلايا النجمية في تكرار البريونات 29،30. لذلك، ليس فقط لأنه من المهم لاستهداف الخلايا العصبية، ولكن أيضا باستهداف الخلايا النجمية للحد من بريون المرضية.

نظم تسليم الموصوفة هنا قابلة للاستراتيجيات التحسين المختلفة التي من شأنها أن تجعل منها مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات المرض. LSPCs وPALETS قادرة على نقل أي نوع من المخدرات جزيء صغير إلى الجهاز العصبي المركزي، وليس فقط سيرنا، والتي تعطي المركبات القدرة على علاج الأمراض أكثر من مجرد الاعصاب. PALETS وLSPCs يمكن أن تستخدم لعلاج أي مرض يصيبالدماغ يتوقف على المخدرات جزيء صغير تحميلها في عربات. أيضا، تغيير الببتيد تستهدف قد تسمح لوسائل نقلها لتسليم المخدرات جزيء صغير لمجموعة فرعية معينة من الخلايا داخل الجهاز العصبي المركزي، بدلا من أي الخلية التي لديها مستقبلات الأستيل كولين. PALETS وLSPCs تمثل الرواية، ونظام تسليم أكثر كفاءة ومرونة للأدوية جزيء صغير لعلاج الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOTAP lipid Avanti Lipids 890890
Cholesterol Avanti Lipids 700000
DSPE Avanti Lipids 850715
DSPE-PEG Avanti Lipids 880125
Chloroform Fisher Scientific AC268320010
Methanol EMD Millipore 113351
N2 Gas AirGas
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Extruder Avanti Lipids 610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filters Avanti Lipids 610010, 610007, 610006
PBS Life Technologies 70011-044
Protamine sulfate Fisher Scientific ICN10275205
EDC Thermo Scientific 22980 Aliquoted for single use
Sulfo-NHS Thermo Scientific 24510 Aliquoted for single use
40 μm Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block BD Pharmigen 553141
Anti-PrP antibody (PRC5) Proprietary - PRC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  2. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  3. Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
  5. Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
  6. Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
  7. White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
  8. Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
  9. Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
  10. Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
  11. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
  12. Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
  13. Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
  14. Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
  15. Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
  16. Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  17. Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
  18. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  19. Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
  20. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  21. Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
  22. Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  23. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  24. Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
  25. Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
  26. Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
  27. Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
  28. Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
  29. Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
  30. Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 113، التنكس العصبي، العلاجات، بريون، سيرنا، الجسيمات الشحمية، بروتامين سلفات، حاجز الدم في الدماغ، والدماغ
تسليم العلاجية سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الموجبة وأنيوني الليبوزومات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bender, H. R., Kane, S., Zabel, M.… More

Bender, H. R., Kane, S., Zabel, M. D. Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes. J. Vis. Exp. (113), e54106, doi:10.3791/54106 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter