Introduction
Les prions sont des maladies neurodégénératives graves qui affectent le système nerveux central. Les maladies à prion résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale, la PrPc, par un isomère infectieuse appelée PrP Res. Ces maladies touchent une grande variété d'espèces , y compris l' encéphalopathie spongiforme bovine chez les vaches, la tremblante du mouton, la maladie du dépérissement chronique chez les cervidés et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l' homme 1-3. Prion provoquent la neurodégénérescence qui commence par la perte synaptique, et progresse vers vacuolisation, gliose, perte neuronale, et les dépôts de plaque. Finalement, ce qui entraîne la mort de l'animal / personne 4. Pendant des décennies, les chercheurs ont étudié les composés destinés à ralentir ou arrêter la progression de la maladie du prion. Cependant, les chercheurs ont pas trouvé soit une thérapie réussie ou un véhicule de livraison systémique efficace.
L' expression endogène de PrP C est nécessaire pour le développement des maladies à prion 5 C peut entraîner un retard ou l' amélioration de la maladie. Plusieurs groupes ont créé des souris transgéniques avec des niveaux réduits de PrP C ou lentivecteurs injectés exprimant shRNA directement dans le tissu cérébral murin pour étudier le rôle des niveaux d'expression de la PrP C dans les maladies à prions. Ces chercheurs ont constaté la réduction de la quantité de neurones PrP C ont donné lieu à l' arrêt de la neuropathologie progressive des maladies à prions et prolongé la durée de vie des animaux 6-9. Nous avons signalé que les résultats de traitement PrP C siRNA de la clairance de la PrP Res dans les cellules de neuroblastome de souris 10. Ces études suggèrent que l'utilisation des thérapies pour réduire les niveaux d'expression de la PrP C, comme des petits ARN interférents (siRNA), qui clive l' ARNm, peut suffisamment retarder la progression des maladies à prions. Cependant, la plupart des thérapies étudiées pour les maladies à prions ont été livrées d'une manière qui ne serait pas pratiquedans un contexte clinique. Par conséquent, une thérapie par ARNsi a besoin d'un système d'administration systémique, qui est délivré par voie intraveineuse et ciblée vers le système nerveux central.
Chercheurs ont étudié l'utilisation de liposomes en tant que véhicules de délivrance pour des produits de thérapie génique. Des lipides cationiques et anioniques sont utilisés à la fois dans la formation des liposomes. Des lipides cationiques sont plus largement utilisés que les lipides anioniques, car la différence de charge entre le lipide cationique et l'ADN / ARN permet un conditionnement efficace. Un autre avantage de lipides cationiques est celle qu'ils traversent la membrane cellulaire plus facilement que d' autres lipides 11-14. Cependant, les lipides cationiques sont plus immunogènes que les lipides anioniques 13,14. Par conséquent, les chercheurs ont commencé à passer de l'aide cationique anioniques lipides dans des liposomes. Les produits de thérapie génique peuvent être efficacement emballés dans des liposomes anioniques , en utilisant le sulfate de protamine peptide chargé positivement, qui condense les molécules d' ADN / ARN 15-19. Depuis lipi anioniqueds sont moins immunogènes que les lipides cationiques , ils peuvent avoir une augmentation des temps de circulation, et peuvent être plus tolérés dans des modèles animaux 13,14. Les liposomes sont ciblés vers des tissus spécifiques en utilisant des peptides de ciblage qui sont attachés à des liposomes. Neuropeptide RVG-9R, qui se lie à des récepteurs nicotiniques de l' acétylcholine, a été utilisé pour cibler l' ARNsi et des liposomes au système nerveux central 17-20.
Ce rapport décrit un protocole pour produire trois véhicules de livraison de siRNA et d'emballer et de livrer le siRNA aux cellules neuronales (Figure 1). les complexes liposome-siRNA peptide (LSPCs) sont composées de liposomes avec l'ARNsi et RVG-9R peptide ciblant électrostatiquement fixés sur la surface extérieure du liposome. Peptide thérapeutique encapsulé dans des liposomes adressé siRNA (PALETS) sont composés d'ARNsi et la protamine encapsulé dans le liposome, avec RVG-9R lié de manière covalente à des groupes de lipides PEG. En utilisant les méthodes ci-dessous pour générer LSPCs et PALETS, PrP C siRNA diminue PrP C expression jusqu'à 90% dans les cellules neuronales, qui détient la promesse énorme pour guérir ou retarder l'apparition de la pathologie de la maladie du prion sensiblement.
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Protocol
Toutes les souris ont été élevées et maintenues au laboratoire des ressources animales, agréés par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International, conformément aux protocoles approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université d'État du Colorado.
1. Préparation de LSPCs
- En utilisant un mélange 1: 1 DOTAP (1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane): Taux de cholestérol pour LSPCs. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2 nmoles de DOTAP et 2 nmoles de cholestérol dans 10 ml d'un mélange 1: solution de méthanol dans un ballon: 1 chloroforme.
- S'évaporer 9 ml de chloroforme et une solution de methanol en utilisant du N2 gazeux sous une hotte aspirante. Evaporer les dernières 1 ml de solvant dans une hotte nuit sans gaz. Observer un mince film de lipide sur le fond du flacon.
- Chauffer 10 ml d'une solution de saccharose à 10% à 55 ° C.
- Verser la solution de saccharose à 10% chauffé sur le film lipidique mince lentement, soit 1 ml / min, tandis que GEtourbillonnant ntly le ballon. Maintenir le saccharose à 10% et d'un flacon avec les lipides à 55 ° C, de sorte que les molécules de lipides restent dans la phase gel-liquide. Résultats de réhydratation dans des vésicules (MLV) formation multilamellaire.
- Laisser les lipides se réhydrater à 55 ° C pendant au moins une heure avant le dimensionnement des liposomes.
- Assembler une extrudeuse selon les instructions du fabricant avec 1,0 um filtres ou utiliser des filtres de seringue 1,0 um pour le dimensionnement.
- Ajouter 1 ml de la suspension de liposomes chauffé à une des seringues à l'extrudeuse, et passer la suspension entre les deux seringues de 11 fois. Assurez-vous que la suspension est dans la seringue opposée à la seringue de départ après 11 passes.
- Taille des liposomes à nouveau de 0,45 um puis 0,2 um filtres pour générer de grandes vésicules unilamellaires (LUV). Gardez la suspension de liposomes chauffé pour faciliter le dimensionnement.
- Incuber 20 ul de 4 nmol suspension de liposomes (200 um) avec 200 ul d'une 20 um (4totale nmol) de solution mère de siRNA pendant 10 min à température ambiante.
- Incuber 80 ul d'un 500 uM (40 nmol totale) de solution RVG-9r disponible avec la solution / liposome siRNA pendant 10 min à température ambiante. LSPCs doivent être utilisés le plus tôt possible, mais peuvent être utilisés jusqu'à plusieurs heures après la préparation. LSPCs Conserver à 4 ° C pendant plusieurs heures après la préparation.
2. Préparation de PALETS
- Utiliser un 55 ratio molaire 5 de l'une ou l'autre DSPE (1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine): 40 cholestérol: DSPE-PEG ou de DOTAP: cholestérol: DSPE-PEG pour PALETS. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2,2 nmol de chacune DSPE ou DOTAP, 1,6 nmol de cholestérol, et 0,2 nmoles de DSPE-PEG dans 10 ml d'un mélange 2: solution de méthanol dans un ballon: 1 chloroforme.
- Préparer suspension de liposomes exactement comme décrit à l'étape 1.1 et 1.2 ci-dessus. Réhydrater les liposomes DSPE dans 10 ml de 1 x PBS chauffé à 75 ° C, en ajoutant 1 ml / min. Laisser les lipides se réhydrater à 75 ° C pendant aumoins 1 h avant de dimensionner.
- Taille de la suspension de liposomes exactement comme décrit à l'étape 1,6-1,8.
- Pipet 20 pi de chacune des 4 nmole (200 uM) suspensions de liposomes en aliquots à usage unique après DOTAP et DSPE liposomes ont été de taille, et lyophiliser pendant 30 minutes en utilisant un lyophilisateur de paillasse (Figure 2).
- Incuber 200 pi d'un 20 uM (4 au total nmole) stock solution siRNA avec 1,4 ul d'une solution de 26,6 uM de sulfate de protamine pendant 10 min à température ambiante pendant siRNA qui doit être encapsulé dans des liposomes DSPE Palets.
- Réhydrater les liposomes DOTAP Palets avec 200 pi d'une solution à 4 actions nmole de siRNA ou réhydrater liposomes DSPE Palets avec 201,4 pi de la solution / protamine siRNA. Incuber la solution / ARNsi de liposomes pendant 10 min à température ambiante.
- Ajouter 10 ul d'un 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), une solution 60 mM à la solution de liposomes / ARNsi pour les DOTAP et PALETS DSPE.
- Ajouter 10 ul d'une 150 mM de N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) solution à la solution de liposomes / ARNsi pour les DOTAP et PALETS DSPE.
- Incuber EDC et sulfo-NHS avec le / suspension de liposomes siRNA pendant 2 heures à la température ambiante.
- Incuber 80 ul d'un 500 uM (40 nmol totale) de solution RVG-9r actions avec le siRNA / liposome solution pendant 10 min à température ambiante de réticulation.
NOTE: L'ECD / sulfo-NHS permet au RVG-9r pour lier de manière covalente aux lipides PEG. Utilisez PALETS au sein de plusieurs heures après la préparation. PALETS Conserver à 4 ° C pendant plusieurs heures après la préparation. - Pour déterminer siRNA encapsulation efficacité de PALETS:
- Mesurer la concentration de l'ARNsi avant et après l'addition de protamine et des liposomes en utilisant un spectrophotomètre réglé à 260 nm.
- Filtrer le ARNsi non encapsulée dans le liposome / encapsulée suspension ARNsi en utilisant des filtres centrifuges 50 kDa. Centrifuger à 1000 xg pendant 20 min.
- Mesurer la concentration deARNsi non encapsulée dans le filtrat et la concentration de l'ARNsi encapsulé dans le rétentat à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm.
3. Injecter Souris avec LSPCs ou PALETS
- Exposer les souris pendant 5 à 10 min à une lampe chauffante pour dilater le système vasculaire.
- Anesthetize souris avec un 2-3% isofluorane / oxygène flux 5-10 min avant l'injection, et pendant l'injection. Confirmer anesthetization lorsque l'animal est plus ambulant et la respiration ont ralenti en faisant une pincée d'orteil. Placez la souris sur le dos ou sur le côté pour accéder à la veine de la queue. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement sous anesthésie.
- Essuyez / pulvériser la queue avec 70% EtOH et injecter 300 pi de LSPCs ou PALETS sur la veine de la queue de la souris à l'aide d'une seringue à insuline G 26. Commencer à injecter distalement dans la veine de la queue et de se déplacer proximalement si la veine s'effondre ou ruptures.
- Placez la souris dans une cage propre jusqu'à ce qu'elle maintient décubitus sternale. Ne placez pas moutiliser avec d'autres compagnons de cage jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré. Les souris doivent récupérer en 5 à 15 min. Ils peuvent être placés sur un coussin chauffant ou sous une lampe de chaleur pour maintenir la température du corps si la récupération prend plus de temps. Les souris doivent être étroitement surveillés pour se protéger contre la surchauffe.
- Surveiller les animaux plusieurs heures après l'injection pour assurer l'anesthésie se dissipe, et il n'y a pas de mauvais effets du traitement. Permettre aux LSPCs ou PALETS de circuler pendant au moins 24 heures.
4. Analyse de l'expression des protéines par l'intermédiaire de cytométrie en flux
- Euthanasier souris avec un débit de 20% de CO 2 pendant 15 min.
- Disséquer un demi-hémisphère du cerveau en coupant la peau et le crâne de la souris à l'aide de ciseaux. Peler la moitié d'un hémisphère de cerveau loin du crâne à l'aide de pinces ou la fin d'une paire de ciseaux.
- Presser la moitié d'un hémisphère de cerveau de chaque souris à travers un tamis de maille 40 um en utilisant 2,5 ml de tampon FACS (1x; Du PBS, 1% de sérum bovin fœtal, 10 mM d'EDTA) dans une boîte de Petri avec le piston d'une seringue.
- Rincer la crépine cellulaire et boîte de Pétri avec un 2,5 ml supplémentaires de tampon FACS. Mettre la suspension monocellulaire dans un tube conique de 15 ml sur de la glace.
- Distribuer 100 ul de 5 ml seule suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml et centrifuger pendant 5 min à 350 x g. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 1 ml de tampon FACS. Spin à 350 g pendant 5 min. Répéter l'opération avec un autre 1 ml de tampon FACS. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
- Incuber les cellules dans 100 ul de dilution 1: 100 d'une solution à 0,5 mg / ml de rat bloc Fc anti-souris dans un tampon de FACS pendant 30 à 60 minutes sur de la glace. Pellet et laver les cellules comme dans l'étape 4.5. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
- Incuber les cellules dans 100 ul d'une 20 pg / ml d' anticorps fluorescent contre les souris PrP C dans le sérum de la souris 7% dans un tampon FACS sur la glace pendant 30 à 60 min. Pellet et laver les cellules comme dans l'étape 4.5. Gardez la suspension cellulairesur la glace.
- Pellet et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse RBC (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM NaHCO 3, EDTA 0,1 mM) pendant 1 min. Pellet à l'étape 4.5 et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon FACS. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
- Analyser la PrPc expression en utilisant un cytomètre en flux comme décrit précédemment 10. Porte cellules de la population cellulaire totale vit. Porte PrP C + cellules de la population de cellules vivantes pour déterminer MFI (intensité de fluorescence de la médiane).
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Representative Results
Pour augmenter l'efficacité de l'ARNsi à l'intérieur de l'encapsulation PALETS anioniques, l'ARNic a été mélangé avec de la protamine. Pour déterminer la meilleure concentration de protamine pour l'ARNsi, l'ARNic a été mélangé avec différentes concentrations de protamine, de 1: 1 à 2: 1 (figure 3A). Il y avait un rendement d'encapsulation ARNsi de 60 à 65% dans des liposomes anioniques sans l'utilisation de la protamine. Les échantillons ayant des rapports molaires: protamine siRNA de 1: 1 à 1,5: 1 (133-266 nM) ont de 80 à 90% ARNsi encapsulation. Les rapports molaires ci-dessus 1,5: 1 ont donné lieu à la précipitation des complexes / protamine siARN. Ces complexes précipités sont encapsulées dans des liposomes anioniques. Après l'addition de la protamine à l'ARNsi il y avait une légère diminution de la concentration de l'ARNsi, en raison de la dilution; cependant, la concentration est restée stable après l'addition de protamine (figure 3B). Après séparation par filtration des liposomes avec 50 filtres kDa, 90 à 95% de l'ARNsia été associée à rétentat de liposome, tandis que 5-10% de l'ARNsi était «libre» dans le filtrat. Aucun ARNsi a été détectée dans la protamine ou de liposomes seuls échantillons (figure 3C).
Pour déterminer l'effet de LSPCs in vivo, les souris de type sauvage ont été traités avec LSPCs pendant 24 h. PrPC niveaux de souris de type sauvage traitées avec LSPCs d'expression ont été comparés à des souris traitées avec PBS 1x et knock-out pour la PrP (PrP KO) chez la souris (figure 4). Cytométrie en flux de la PrPc dans le cerveau des souris traitées avec LSPCs a montré une diminution du taux de PrP C (figure 4A et 4B). Dans une expérience, toutes les souris ont eu une réduction de 80 à 90% du taux de PrP C, à proximité des niveaux PrPC qui ont été observés chez les souris KO PrP (figure 4A). Les souris traitées avec LSPCs dans deux expériences indépendantes ont montré une réduction de la PrP C 40-80% </ sup> niveaux (figure 4B). Sur le total des LSPCs souris traitées (n = 14), il n'y avait qu'une souris avait aucune réponse aux LSPCs.
Figure 1:. Vue d' ensemble du protocole pour générer Palets / LSPCs and Deliver siRNA Intraveineusement au SNC de souris Liposomes ont été générés par la méthode d'hydratation du film lipidique mince. La PrPc ARNsi a été ensuite fixé aux liposomes , soit par une interaction électrostatique ou par encapsulation. Les PALETS ou LSPCs ont été complétés par l'ajout du CNS peptide ciblant RVG-9r. Après assemblage, les PALETS / LSPCs ont été injectés dans les veines de la queue de souris, et 24 heures après le traitement expression PrP C a été évaluée par cytométrie en flux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Protocole du lipide Thin Film Hydratation méthode pour générer DSPE Liposomes pour le véhicule de livraison PALETS Les lipides ont été dissous et mélangés dans un mélange chloroforme:. Solution de méthanol qui a été évaporé pour produire un film lipidique sec. Le film lipidique séché a été remis en suspension dans du PBS 1X pour créer des vésicules multilamellaires (MLV). MLV ont ensuite été uniformément dimensionnée en utilisant une extrudeuse pour générer LUV. Les LUV peuvent ensuite être utilisés en suspension, ou lyophilisé en aliquots à usage unique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Encapsulation efficacité de siRNA dans DSPE PALETS u sing Sulfate de protamine. (a) environ 60 à 65% de l'ARNsi a été encapsulé sans l'addition de la protamine. Avec l'addition de protamine, il y avait un rendement d'encapsulation de 90% compris entre 1: 1 et 1,5: 1 protamine ratio ARNsi. (B) Après filtration des liposomes à partir d'une quelconque ARNsi libre, 90% de l'ARNsi a été trouvée dans la fraction liposomale, tandis que 5 à 10% de l' ARNsi non encapsulé a été trouvée dans le filtrat. (C) protamine et liposome que des solutions sont exemptes de encapsulé siRNA. Environ 60-65% de l'ARNsi a été encapsulé dans des liposomes DSPE sans l'utilisation de la protamine. Avec l'utilisation de la protamine à une concentration de 186,2 nm, environ 90% de l'ARNsi a été encapsulé dans les liposomes DSPE. Les barres d'erreur indiquent SEM. **** Indique P <0,0001. * Indique P <0,01. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Représentant cytométrie en flux Analyse des cellules cérébrales Suspensions 24 heures après traitement avec LSPCs LSPCs ont été injectés dans les veines de la queue de souris de type sauvage et les cerveaux ont été récoltées 24 heures plus tard. PBS a été utilisé comme témoin de traitement, et une souris KO PrP a été utilisé comme témoin pour les niveaux PrP C. (A) Des souris traitées avec LSPCs ont montré une diminution significative des taux de PrP C par rapport au témoin PBS, ce qui montre les niveaux de type sauvage PrP C. Les LSPCs souris traitées ont montré des niveaux PrP C proche de celle d'une souris PrP KO. (B) Les données cumulées à partir de trois expériences indépendantes en utilisant le même protocole de traitement 24 h montrent la quantité relative de PrP C dans du PBS type sauvage et des souris traitées LSPCs. Dans les trois expériences, les souris traitées avec LSPCs showed une diminution significative des niveaux de PrP C par rapport à PBS contrôles de type sauvage. Les barres d'erreur indiquent SEM. *** Indique P <0,0003. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce rapport décrit un protocole pour créer deux systèmes d'administration ciblés qui transporte efficacement siRNA au SNC. Les procédés antérieurs de prestation ARNsi au système nerveux central inclus l'injection des vecteurs de siRNA / shRNA directement dans le cerveau, l'injection intraveineuse de siRNA ciblé, ou injection intraveineuse de complexes de liposomes ARNsi non ciblées. Injection de vecteurs de siRNA / shRNA dans le système nerveux central ne provoque une diminution du taux d'expression de la protéine cible. Cependant, le siRNA / shRNA ne diffuse pas librement à travers le système nerveux central. En outre, ces injections entraînent des dommages au 6-9 nerveux adjacent tissulaire. L'injection intraveineuse d'ARNic ciblé se traduit également par une réduction de la protéine cible. Cependant, la majeure partie de l'ARNsi est dégradé par les protéines sériques 20. Enfin, l' injection intraveineuse de liposomes non ciblés ARNsi complexes entraîne le piégeage de l'ARNsi dans le foie et à la dégradation par le système phagocytaire mononucléaire 21. La livraison siRNAles véhicules décrits ci-dessus, et LSPCs PALETS, fournissent un système de distribution plus sûr, plus efficace et plus efficace que les procédés antérieurs en fournissant des ARNsi directement au système nerveux central. Les LSPCs et les PALETS sont également capables de transporter d'autres médicaments à petites molécules pour le SNC.
PALETS ou LSPCs devraient être utilisés dans les quelques heures après l'assemblage. Sinon, il y a un risque de devenir l'ARNsi non fonctionnels et / ou dégradé. L'autre étape critique qui ne peut pas être arrêté / interrompu est la préparation et le déroulement de la suspension cellulaire pour cytométrie en flux. Il est important d'effectuer cytométrie en flux sur le même jour que la suspension cellulaire est préparée, étant donné que la suspension contient des cellules vivantes qui ont besoin d'être vivant pour l'analyse.
Il y a quelques étapes dans le protocole qui peut être modifié selon que les LSPCs ou PALETS seront utilisés in vitro ou in vivo, sur ce médicament à petite molécule est chargée dans les LSPCs ou PALETS, et sur le travailatoire préférence. Tout d'abord, les rapports molaires des lipides et LSPCs PALETS peuvent être optimisées pour d'autres applications. Cependant, la phosphatidyléthanolamine (PE en DSPE) hydrate mal lorsqu'il est utilisé à 60% en poids / poids ou plus. Lorsqu'ils sont utilisés à ces concentrations plus élevées, des molécules de DSPE va agréger les uns avec les autres et forment une masse insoluble dans les lipides. Cette masse de lipides ne sont pas capables d'encapsuler ARNsi. Si N 2 gazeux est indisponible, le mélange lipidique peut être séché en utilisant l' évaporation. L'évaporation dure environ 3 jours et doit être réalisée dans une hotte d'aspiration en raison de l'utilisation du methanol et du chloroforme. Dans ce protocole, le mince film de lipides est remis en suspension avec du PBS 1X, mais il peut également être remis en suspension avec d'autres tampons d'hydratation. D'autres tampons comprennent l'eau, 10% de saccharose, ou tout autre tampon aqueux. Le choix d' un tampon de réhydratation dépend de l'utilisation prévue des liposomes et l'agent étant encapsulé dans le liposome 22,23. Le tampon d'hydratation doit être maintenue au-dessus du gel liqcristal uid température de transition (Tc ou Tm) des lipides ou des liposomes ne se réhydrater correctement. Dans le protocole décrit, les liposomes en suspension ont été uniformément dimensionnés à l'aide d'une extrudeuse. Cependant, les liposomes peuvent également être dimensionnés en utilisant des filtres de seringue ou sonication. Les mêmes filtres de tailles de pores utilisés pour l'extrusion peuvent être utilisés comme filtres à seringue. En outre, la suspension de liposomes peut être redimensionnée après hydratation avec la solution ARNsi. Cependant, nous avons observé une perte d'ARNsi à partir de liposomes de taille lors de l'extrudeuse après l'étape d'hydratation (données non publiées).
Etant donné que le rôle biologique de la PrP C est pas encore compris 5, il est possible qu'il puisse y avoir des effets délétères produits par la réduction des niveaux de PrP C. Cependant, parce que les souris déficientes en protéine prion se développent, se comportent, et de l' âge normalement 24, il est probable que ces effets délétères seraient soit mineur ou pas visiblement apparente. En outre, l'ARNsi knock-down de la PrP <sup> C expression ne serait pas abolir complètement l' expression des protéines et est complètement réversible sans possibilité d'oncogenèse virale, contrairement à lentivector ARNi 23.
Limitations avec les systèmes d'administration comprennent l'absorption de PALETS anioniques dans les membranes biologiques, et l'immunogénicité de LSPCs réduits en raison des lipides cationiques. Si l'immunogénicité des LSPCs est observée, PALETS peuvent être utilisés comme une alternative. l'absorption réduite des palets anioniques dans les membranes biologiques anioniques peuvent être surmontés en utilisant PALETS cationiques ou anioniques en reformulant PALETS avec un mélange de lipides cationiques et anioniques.
Dans ce rapport, la réduction de la PrPC varie considérablement d'une souris à. Cette variation peut être due à divers facteurs: la variation entre les souris, le faible diamètre des veines chez la souris, ou la dégradation des ARNsi. L'utilisation de souris consanguines devrait éliminer une grande partie de la variabilité entre les souris, mais la variation est toujours possible mêmeavec des souris consanguines. En outre, les souris ont très petites veines par rapport à d'autres modèles animaux. Ainsi, l'injection d'un grand volume dans les veines de souris peut être problématique. Nous vous recommandons de pratiquer des injections avant d'essayer d'injecter PALETS ou LSPCs. Cependant, même avec la pratique, il faut parfois encore quelques injections pour obtenir tout le volume de Palets / LSPCs dans la souris, et la veine peut s'effondrer à l'une de ces injections. Ainsi, une souris peut recevoir tout le volume de Palets / LSPCs, alors qu'une autre souris seulement pourrait recevoir 75-90% du volume Palets / LSPCs.
D'autres sources possibles de variation comprennent un temps de circulation et de la dégradation de l'ARNsi par des protéines sériques. Les Palets / LSPCS pourraient circuler plus longtemps avant d'atteindre le cerveau d'une souris par rapport à l'autre, ce qui pourrait expliquer la variation. Nous ne LSPCs permis de circuler pendant 24 heures avant d'euthanasier les souris dans l'expérience ci-dessus. Si le temps de circulation est à l'origine de la variation, puis en augmentant la circultemps ation au-delà de 24 heures devrait réduire une certaine variation. Même si nous emballons le siRNA avec les Palets / LSPCs, il y a toujours une chance de dégradation du siRNA et / ou les véhicules de livraison. Comme mentionné précédemment, les lipides cationiques sont légèrement immunogène. Donc, si les cellules immunitaires dans le sang attaquent les véhicules, il faudrait plus de temps pour les véhicules à être livrés au cerveau ou les véhicules pourrait se dégrader. Le passage de lipides cationiques anioniques PALETS pourrait aider à réduire le temps de circulation lente ou de dégradation lors de l'utilisation des lipides cationiques.
Le peptide RVG-9r transporte les LSPCs et PALETS toute cellule dans le SNC qui contient des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. Cela inclut les cellules neuronales et les cellules astrocytes 26 microgliales. Ou pour PALETS LSPCs être un traitement efficace pour les maladies à prions, il est important de cibler toutes les cellules qui contribuent à la pathogenèse prion. Les cellules neuronales contiennent le plus PrP C 27,28. Le ciblage des cellules neuronales et la réduction de la PrP C expression de cellules peut se traduire par une diminution de prion pathogenèse. Cependant, les cellules neuronales sont pas le seul type de cellule qui contribue à la maladie à prion. Les astrocytes ont été impliqués dans la réplication du prion 29,30. Par conséquent, non seulement il est important de cibler les cellules neuronales, mais de cibler également les astrocytes pour réduire la pathogenèse des prions.
Les systèmes d'administration décrits ici se prêtent à diverses stratégies d'optimisation qui les rendent aptes à une large gamme d'applications de la maladie. LSPCs et PALETS sont capables de transporter tout médicament à petite molécule pour le SNC, non seulement siRNA, qui donne aux véhicules le potentiel de traiter plus de maladies neurodégénératives juste. PALETS et LSPCs pourraient être utilisés pour traiter une maladie qui affectele cerveau en fonction de la petite drogue molécule chargée dans les véhicules. En outre, la modification du peptide de ciblage pourrait permettre aux véhicules de livraison pour livrer des médicaments à petites molécules pour un sous-ensemble spécifique de cellules au sein du système nerveux central, au lieu d'une cellule qui possède des récepteurs de l'acétylcholine. PALETS et LSPCs représentent un roman, système de distribution plus efficace et flexible pour les médicaments à petites molécules pour le traitement de maladies qui affectent le système nerveux central.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
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