Introduction
Prionen sind schwere neurodegenerative Erkrankungen, die das ZNS beeinflussen. Prionenkrankheiten ergeben sich aus der Fehlfaltung des normalen zellulären Prionproteins PrP C, durch einen infektiösen Isomer genannt PrP Res. Diese Krankheiten betreffen eine Vielzahl von Arten , einschließlich der bovinen spongiformen Enzephalopathie bei Rindern, Scrapie bei Schafen, Chronic Wasting Disease bei Hirschartigen, und der Creutzfeldt-Jakob - Krankheit beim Menschen 1-3. Prionen verursachen Neurodegeneration, die mit synaptischen Verlust beginnt, und zu Vakuolisation fortschreitet, Gliose, Neuronenverlust und Plaque-Ablagerungen. Schließlich, was zum Tod des Tieres / Einzel - 4. Seit Jahrzehnten haben Forscher untersuchten Verbindungen gemeint, zu verlangsamen oder das Fortschreiten der Prionenerkrankung stoppen. Allerdings haben die Forscher nicht entweder eine erfolgreiche Therapie oder eine wirksame systemische Abgabe Fahrzeug gefunden.
Endogenes PrP C Expression für die Entwicklung von Prionenkrankheiten notwendigen 5 C - Expression in einer Verzögerung oder Linderung von Krankheiten führen kann. Mehrere Gruppen erstellt transgene Mäuse mit reduzierten Mengen an PrP C oder injiziert lentivectors shRNA direkt in murine Hirngewebe exprimiert die Rolle von PrP C - Expressionsniveaus in Prion - Krankheit zu untersuchen. Diese Forscher Verringerung der Menge an neuronaler PrP C gefunden führte die progressive neuropathology von Prion - Erkrankungen in Anhalten und verlängert die Lebensdauer der Tiere 6-9. Wir haben in der Clearance von PrP Res in Maus - Neuroblastomzellen 10 , dass PrP C siRNA Behandlungsergebnisse berichtet. Diese Studien legen nahe , dass die Verwendung von Therapien PrP C Expressionsniveaus, wie small interfering RNA (siRNA), die spaltet mRNA, ausreichend verzögert das Fortschreiten der Prion - Krankheiten können zu verringern. Allerdings sind die meisten Therapien für Prionenerkrankungen untersucht wurden in einer Weise geliefert, die nicht praktikabel wärein einer klinischen Umgebung. Daher muss ein siRNA-Therapie eine systemische Verabreichungssystem, das an das ZNS intravenös und gezielte geliefert wird.
Die Ermittler haben die Verwendung von Liposomen als Abgabevehikel für die Gentherapie Produkte untersucht. Kationische und anionische Lipide zur Bildung von Liposomen verwendet beides. Kationische Lipide sind weiter verbreitet als anionische Lipide verwendet, weil die Ladungsdifferenz zwischen dem kationischen Lipid und DNA / RNA für eine effiziente Verpackung ermöglicht. Ein weiterer Vorteil von kationischen Lipiden ist , dass sie die Zellmembran leichter als andere Lipide 11-14 kreuzen. Jedoch kationische Lipide sind immunogener als anionische Lipide 13,14. Daher haben begonnen Forscher unter Verwendung von kationischen zu verschieben Lipiden in Liposomen anionische. Die Gentherapie Produkte effizient in anionische Liposomen verpackt werden , um die positiv geladenen Peptid Protaminsulfat verwendet, die DNA kondensiert / RNA - Moleküle 15-19. Da anionische lipids sind weniger immunogen als kationische Lipide sie Zirkulationszeiten zugenommen haben kann, und kann in Tiermodellen 13,14 toleriert werden. Liposome werden auf spezifische Gewebe gezielt Peptide unter Verwendung von Targeting, die an die Liposomen gebunden sind. Die RVG-9R Neuropeptid, das an nikotinische Acetylcholin - Rezeptoren bindet, wurde verwendet, siRNA und Liposomen an das ZNS 17-20 abzuzielen.
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll drei siRNA Fahrzeuge zu produzieren und zu verpacken und die siRNA zu neuronalen Zellen (Abbildung 1) zu liefern. Liposom-siRNA-Peptid-Komplexe (LSPCs) bestehen aus Liposomen mit siRNA und die RVG-9R Peptid elektrostatisch an der äußeren Oberfläche des Liposoms Targeting. Peptid gerichtet Liposomen therapeutische siRNA (PALETS) eingekapselt sind, bestehend aus siRNA und Protamin im Liposom verkapselt, mit RVG-9R zu Lipid PEG-Gruppen kovalent gebunden sind. die folgenden Methoden verwenden LSPCs und PALET zu erzeugenS, PrP C siRNA verringert PrP C Ausdruck zu 90% in neuronalen Zellen auf, die enorme Versprechen hält das Auftreten von Prion - Krankheit Pathologie zu heilen oder erheblich verzögern.
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Protocol
Alle Mäuse wurden in Labortier Ressourcen gezüchtet und gepflegt, von der Association akkreditiert für Evaluierung und Akkreditierung von Lab Animal Care International, in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Colorado State University genehmigt.
1. Herstellung von LSPCs
- Verwenden Sie ein 1: 1 DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan): Cholesterin-Verhältnis für LSPCs. Für ein 4 nmol Liposom-Zubereitung, Mischung 2 nmol DOTAP und 2 nmol von Cholesterin in 10 ml eines 1: 1 Chloroform: Methanol-Lösung in einem Kolben.
- Verdunsten 9 ml Chloroform: Methanol - Lösung unter Verwendung von N 2 -Gas in einer Abzugshaube. Dampft die letzten 1 ml Lösungsmittel in einem Abzug über Nacht ohne Gas. Beobachten eines dünnen Lipidfilm auf dem Boden des Kolbens.
- Wärme 10 ml einer 10% Saccharose-Lösung auf 55 ° C.
- Gießen Sie die erhitzte 10% Saccharose - Lösung auf die dünne Lipidfilm langsam, dh 1 ml / min, während gently Schwenken des Kolbens. Aufrechterhaltung der 10% Sucrose und Kolben mit Lipiden bei 55 ° C so, dass die Lipidmoleküle in dem Gel-Flüssigkeits-Phase verbleiben. Rehydrierung Ergebnisse in multilamellare Vesikel (MLV) Bildung.
- Erlauben Lipide für mindestens eine Stunde bei 55 ° C rehydriert, bevor die Liposomen Größen.
- Montieren eines Extruders den Anweisungen des Herstellers mit 1,0 & mgr; m-Filter oder verwenden 1,0 um Spritzenfilter für die Dimensionierung.
- 1 ml der erwärmten Liposomensuspension auf eine der Spritzen auf den Extruder, und passieren die Suspension zwischen den zwei Spritzen 11 mal. Stellen Sie sicher, dass die Suspension in die entgegengesetzte Spritze ist als die Ausgangs Spritze nach den 11 verläuft.
- Größe die Liposomen wieder durch 0,45 um dann 0,2 um Filter große unilamellare Vesikel (LUV) zu erzeugen. Halten Sie die Liposomensuspension zur einfacheren Dimensionierung erwärmt.
- Inkubiere 20 ul des 4 nmol Liposom-Suspension (200 & mgr; M) mit 200 & mgr; l einer 20 & mgr; M (4nmol gesamt) Lager siRNA-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Inkubiere 80 ul einer 500 uM (40 nmol Gesamt) stock RVG-9R-Lösung mit der siRNA / Liposom-Lösung für 10 min bei RT. LSPCs sollte so bald wie möglich verwendet werden, sondern kann bis zu mehreren Stunden nach der Herstellung verwendet werden. Store LSPCs bei 4 ° C für mehrere Stunden nach der Zubereitung.
2. Herstellung von PALETS
- Verwenden, um eine 55: 40: 5 Molverhältnis von entweder DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin): Cholesterin: DSPE-PEG oder DOTAP: Cholesterin: DSPE-PEG für PALETS. Für ein 4 nmol Liposom-Zubereitung, Mischung 2,2 nmol entweder DSPE oder DOTAP, 1,6 nMol von Cholesterin und 0,2 nmol von DSPE-PEG in 10 ml eines 2: 1 Chloroform: Methanol-Lösung in einem Kolben.
- Bereiten Sie Liposomensuspension genau wie in Schritt 1.1 und 1.2 oben beschrieben. Rehydrieren DSPE-Liposomen in 10 ml 1x PBS erhitzt auf 75ºC, Zugabe von 1 ml / min. Erlauben Lipiden bei 75 ° C rehydriert zuminmindestens 1 Stunde vor dem Kalibrieren.
- Größe der Liposomensuspension genau wie in Schritt 1.6-1.8 beschrieben.
- Pipettieren 20 ul jeder der 4 nmol (200 uM) Liposomensuspensionen in einzelne Aliquots nach DOTAP und DSPE Liposomen Größe gewesen, und für 30 min lyophilisieren ein Benchtop - Gefriertrockner (Abbildung 2).
- Inkubieren 200 ul einer 20 uM (4 nmol Gesamt) stock siRNA-Lösung mit 1,4 ul einer 26,6 & mgr; M Lösung von Protaminsulfat für 10 min bei RT für siRNA, die in DSPE PALETS Liposomen verkapselt werden soll.
- Rehydratisieren die DOTAP PALETS Liposomen mit 200 ul einer 4 nmol Stammlösung von siRNA oder DSPE PALETS Liposomen mit 201,4 & mgr; l der siRNA / Protamin Lösung rehydratisiert. Inkubieren Liposom / siRNA-Lösung für 10 min bei RT.
- Werden 10 ul einer 60 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) Lösung der Liposomen / siRNA Lösung sowohl DOTAP und DSPE PALETS.
- Werden 10 ul einer 150 mM N-Hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) Lösung der Liposomen / siRNA Lösung sowohl DOTAP und DSPE PALETS.
- Inkubieren des EDC und sulfo-NHS mit der siRNA / Liposomen-Suspension für 2 h bei RT.
- Inkubiere 80 ul einer 500 uM (40 nmol Gesamt) stock RVG-9R-Lösung mit der siRNA / Liposom-Vernetzungslösung für 10 min bei RT.
HINWEIS: Die EDC / Sulfo-NHS die RVG-9R zu kovalent an die PEG-Lipide ermöglicht. Verwenden Sie PALETS innerhalb von mehreren Stunden nach der Vorbereitung. Store PALETS bei 4 ° C für mehrere Stunden nach der Zubereitung. - Um siRNA Verkapselungswirksamkeit von PALETS bestimmen:
- Messen der Konzentration von siRNA vor und nach der Zugabe von Protamin und Liposomen unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 260 nm eingestellt.
- Filtern Sie die nicht eingekapselten siRNA aus dem Liposom / verkapselt siRNA Suspension mit 50 kDa Zentrifugalfilter. Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min.
- Messen der Konzentration vonunverkapselte siRNA im Filtrat und der Konzentration an verkapseltem siRNA im Retentat eines Spektrophotometers bei 260 nm verwendet wird.
3. Injizierender Mäuse mit LSPCs oder PALETS
- Expose Mäuse für 5-10 min einer Wärmelampe Gefäß aufzuweiten.
- Anesthetize Maus mit einem 2-3% Isofluran / Sauerstoff fließen 5-10 min vor der Injektion und während der Injektion. Bestätigen anesthetization wenn Tier ist nicht mehr ambulanter und Respiration verlangsamt haben durch eine Zehe Prise zu tun. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken oder der Seite, um die Schwanzvene zugreifen. Verwenden Sie vet Salbe auf die Augen der Maus Austrocknen zu verhindern, während sie unter Narkose.
- Wischen / Spray den Schwanz mit 70% EtOH und injizieren 300 ul LSPCs oder PALETS auf die Schwanzvene der Maus eine 26 G Insulin-Spritze. Beginnen Sie distal in die Schwanzvene Injektion und proximal zu bewegen, wenn die Vene oder Brüche zusammenbricht.
- Bewegen Sie die Maus in einem sauberen Käfig, bis sie Brustlage beibehält. Stellen Sie keine moverwenden, um mit anderen Käfiggenossen, bis sie vollständig erholt hat. Die Mäuse sollten in 5 bis 15 min zu erholen. Sie können auf einem Heizkissen oder unter einer Heizlampe angeordnet werden Körpertemperatur zu halten, wenn Erholung länger braucht. Die Mäuse sollten genau überwacht werden, um Schutz vor Überhitzung.
- Überwachen Sie die Tier mehrere Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, Anästhesie nachlässt, und es gibt keine negativen Auswirkungen der Behandlung. Lassen Sie die LSPCs oder PALETS für mindestens 24 Stunden zirkulieren zu lassen.
4. Analyse der Proteinexpression über Durchflusszytometrie
- Euthanize Mäuse mit einer 20% CO 2 Durchflussrate für 15 min.
- Präparieren aus einem halben Hemisphäre des Gehirns durch Schneiden der Haut und Schädel der Maus mit einer Schere entfernt. Peel weg halben Hemisphäre des Gehirns aus dem Schädel entfernt Zangen oder das Ende einer Schere.
- Press halben Hemisphäre des Gehirns von jeder Maus durch ein 40 & mgr; m mesh Zellsieb 2,5 ml FACS Puffer (1x; PBS, 1% fötalem Rinderserum, 10 mM EDTA) in einer Petrischale mit dem Kolben einer Spritze.
- Spülen Sie die Zelle Sieb und Petrischale mit einem zusätzlichen 2,5 ml FACS-Puffer. Legen Sie die Einzelzellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis.
- Jeweils 100 ul der 5 ml Einzelzellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 350 x g. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer. Spin bei 350 xg für 5 min. Wiederholen Sie mit weiteren 1 ml FACS-Puffer. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
- Inkubieren der Zellen in 100 ul 1: 100-Verdünnung einer 0,5 mg / ml Ratten-anti-Maus-Fc-Block in FACS-Puffer für 30-60 min auf Eis. Pelletieren, und die Zellen wie in Schritt 4.5 waschen. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
- Inkubieren der Zellen in 100 ul einer 20 ug / ml Fluoreszenz - Antikörper gegen Maus - PrP C in 7% Mausserum in FACS - Puffer auf Eis für 30-60 min. Pelletieren, und die Zellen wie in Schritt 4.5 waschen. Halten Sie die Zellsuspensionauf Eis.
- Pellet und die Zellen in 1 ml RBC - Lyse - Puffer (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM NaHCO 3, 0,1 mM EDTA) für 1 min resuspendieren. Pellet wie in Schritt 4.5 und die Zellen in 1 ml FACS-Puffer resuspendieren. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
- Analysieren PrP C - Ausdruck ein Durchflusszytometer unter Verwendung von wie zuvor 10 beschrieben. Tor lebende Zellen aus Gesamtzellpopulation. Tor PrP C + Zellen von lebenden Zellpopulation MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) zu bestimmen.
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Representative Results
Um die Effizienz der siRNA Die Verkapselung in anionischer PALETS erhöhen, wurde die siRNA mit Protamin gemischt. Um die beste Protamin Konzentration für die siRNA bestimmen, wurde die siRNA mit verschiedenen Konzentrationen von Protamin gemischt, von 1: 1 bis 2: 1 (3A). Es gab eine 60-65% siRNA Verkapselungseffizienz in anionischen Liposomen ohne Verwendung von Protamin. Proben mit Protamin: siRNA Molverhältnissen von 1: 1 bis 1,5: 1 (133-266 nM) hatten 80-90% siRNA Verkapselung. Molverhältnisse oberhalb von 1,5: 1 führte zur Ausfällung von siRNA / Protamin-Komplexe. Diese gefällten Komplexe wurden nicht in anionische Liposomen verkapselt. Nach der Zugabe von Protamin auf die siRNA war ein leichter Abfall in der Konzentration der siRNA, aufgrund der Verdünnung; Jedoch blieb die Konzentration stabil nach der Zugabe von Protamin (3B). Nach dem Abfiltrieren der Liposomen mit 50 kDa Filter, 90-95% der siRNAwurde mit dem Liposom Retentat verbunden, während 5-10% der siRNA in dem Filtrat "frei" ist. Keine siRNA wurde in Protamin oder ein Liposom nur Proben (3C) festgestellt.
Um die Wirkung von LSPCs in vivo zu bestimmen, wurden Wildtyp-Mäuse für 24 Stunden mit LSPCs behandelt. PrP C Expression von Wildtyp - Mäusen mit LSPCs behandelt wurden Mäusen verglichen mit 1x PBS behandelt und PrP knockout (PrP KO) Mäuse (Abbildung 4). Durchflusszytometrieanalyse von PrP C in den Gehirnen von Mäusen , die mit LSPCs zeigten eine Abnahme in PrP C Niveaus (4A und 4B). In einem Experiment hatten alle Mäuse 80-90% Reduktion von PrP - C - Spiegel, in der Nähe von PrP - C - Spiegel, die in den PrP KO - Mäuse (4A) beobachtet wurden. Mäuse behandelt mit LSPCs in zwei weiteren unabhängigen Experimenten zeigten eine 40-80% ige Reduktion von PrP C </ sup> Ebenen (4B). Von den gesamten LSPCs behandelten Mäuse (n = 14), gab es nur eine Maus keine Antwort auf die LSPCs hatte.
Abb . 1: Übersicht des Protokolls PALETS / LSPCs zu Erzeugen und Liefern von siRNA Intravenös in das ZNS von Mäusen Liposome wurden über die dünne Lipidfilm Hydratisierungsmethode erzeugt. Das PrP C siRNA wurde dann an die Liposomen gebunden , entweder durch eine elektrostatische Wechselwirkung oder durch Verkapselung. Die PALETS oder LSPCs wurden durch die Zugabe des ZNS Targeting-Peptid RVG-9R abgeschlossen. Nach der Montage wurden die PALETS / LSPCs in die Schwanzvenen von Mäusen injiziert, und 24 Stunden nach der Behandlung Ausdruck PrP C wurde über Durchflusszytometrie bewertet. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Protokoll des Thin Lipid - Film Hydratisierungsmethode zu generieren DSPE Liposome für die PALETS Delivery Vehicle Die Lipide wurden aufgelöst und in einem Chloroform gemischt. Methanollösung, die verdampft wurde mit einem trockenen Lipidfilm zu erzeugen. Der trockene Lipidfilm wurde in 1x PBS zu multilamellare Vesikel (MLV) erstellen. MLVs wurden dann bemessen gleichmäßig unter Verwendung eines Extruders LUVs zu erzeugen. Die LUVs können dann in Suspension verwendet werden, oder in einzelnen Aliquots lyophilisiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Umhüllungs - Effektivität von siRNA in DSPE PALETS u sing Protaminsulfat. (A) etwa 60-65% der siRNA wurde ohne die Zugabe von Protamin eingekapselt. Mit der Zugabe von Protamin, gab es eine 90% Einkapselungseffizienz zwischen 1: 1 und 1,5: 1 Protamin: siRNA-Verhältnis. (B) Nach dem Abfiltrieren der Liposomen aus jedem freien siRNA out, 90% der siRNA wurde im liposomalen Fraktion, während 5-10% unverkapseltem siRNA wurde gefunden im Filtrat gefunden. (C) Protamin und Liposom nur Lösungen sind frei von verkapselten siRNA. Etwa 60-65% der siRNA wurde ohne die Verwendung von Protamin innerhalb DSPE-Liposomen eingekapselt. Mit der Verwendung von Protamin in einer Konzentration von 186,2 nM, ungefähr 90% der siRNA wurde innerhalb der DSPE-Liposomen eingekapselt. Fehlerbalken zeigen SEM. **** Zeigt P <0,0001. * Zeigt p <0,01. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Repräsentative Analyse über Durchflusszytometrie von Brain Zellsuspensionen 24 Stunden nach der Behandlung mit LSPCs LSPCs in die Schwanzvenen von Wildtyp - Mäusen injiziert wurden und Gehirne wurden 24 Stunden später geerntet. PBS wurde als Behandlungskontrolle und ein PrP KO - Maus verwendet wurde , als Kontrolle für PrP C Niveaus verwendet. (A) Mäuse mit LSPCs behandelt wurden , zeigten eine signifikante Abnahme der PrP C Spiegel im Vergleich zu der PBS - Kontrolle, die Wildtyp- PrP C Ebenen zeigt. Die LSPCs behandelten Mäuse zeigten PrP - C - Spiegel nahe an die eines PrP KO - Maus. (B) Kumulative Daten aus drei unabhängigen Experimenten , die die gleichen 24 Stunden Behandlungsprotokolls unter Verwendung zeigte die relative Menge von PrP C in PBS Wildtyp- und LSPCs Mäuse behandelt. Über die drei Experimenten Mäuse mit LSPCs sho behandeltwed einem signifikanten Rückgang der Ebenen PrP C als zu PBS Wildtyp- Kontrollen verglichen. Fehlerbalken zeigen SEM. *** Zeigt p <0,0003. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll, das zwei Systeme zur gezielten Verabreichung zu schaffen, die effizient siRNA zum ZNS transportiert. Frühere Verfahren zur enthalten siRNA zum ZNS Liefern Injizieren siRNA / shRNA Vektoren direkt in das Gehirn, intravenöse Injektion von gezielten siRNA oder intravenöse Injektion von nicht-zielgerichteten Liposomen-siRNA-Komplexe. Injektion von siRNA / shRNA Vektoren in das ZNS verursacht eine Abnahme der Zielprotein-Expressionsniveaus. Jedoch die siRNA / shRNA diffundiert nicht frei durch das ZNS. Darüber hinaus führen diese Injektionen in Schädigung des benachbarten Nervengewebe 6-9. Die intravenöse Injektion von gezielten siRNA führt auch zu einer Verringerung des Zielproteins. Die meisten der siRNA jedoch durch Serumproteine abgebaut 20. Schließlich intravenöse Injektion von untargeted Liposom-siRNA - Komplexe führt zur Einklemmung des siRNA in der Leber und der Abbau durch das einkernige Phagozyten - System 21. Die siRNAFahrzeuge oben beschrieben, LSPCs und PALETS, eine sicherere, wirksame, effiziente und Liefersystem als bisherige Verfahren durch siRNA direkt an das ZNS zu liefern. Die LSPCs und die PALETS sind auch in der Lage an das ZNS andere Medikamente aus kleinen Molekülen zu transportieren.
PALETS oder LSPCs sollte nach der Montage innerhalb weniger Stunden verwendet werden. Andernfalls besteht die Gefahr der siRNA immer nichtfunktionelle / verschlechtert. Der andere kritische Schritt, der nicht gestoppt werden kann / unterbrochen ist die Vorbereitung und Durchführung der Zellsuspension für die Durchflusszytometrie. Es ist wichtig, Durchflusszytometrie am selben Tag durchzuführen, die die Zellsuspension hergestellt wird, da die Suspension lebender Zellen enthält, die für die Analyse am Leben zu sein brauchen.
Es gibt ein paar Schritte im Protokoll , das je nach geändert werden kann , ob der LSPCs oder PALETS wird in vitro oder in vivo verwendet werden, auf das, was kleines Molekül als Wirkstoff in die LSPCs oder PALETS geladen wird, und der ArbeitsAtory bevorzugt. Zunächst werden die Lipid Molverhältnisse der LSPCs und PALETS können für andere Anwendungen optimiert werden. Allerdings Phosphatidylethanolamin (PE in DSPE) Hydrate schlecht, wenn sie bei einer 60% Gewicht / Gewicht oder höher verwendet. Wenn bei diesen höheren Konzentrationen verwendet, DSPE Moleküle miteinander aggregieren und eine unlösliche Masse von Lipiden bilden. Diese Masse von Lipiden ist nicht in der Lage siRNA einzukapseln. Wenn N & sub2 ; -Gas nicht verfügbar ist, kann die Lipidmischung getrocknet werden Verdampfung. Eindampfen nimmt etwa 3 Tagen und sollte aufgrund der Verwendung von Methanol und Chloroform in einem Abzug durchgeführt werden. In diesem Protokoll wurde der dünne Lipidfilm mit 1x PBS resuspendiert, es kann aber auch mit anderen Hydratisierung Puffer resuspendiert werden. Andere Puffer umfassen Wasser, 10% Saccharose, oder einen anderen wässrigen Puffer. Die Wahl des Rehydrationspuffer ist abhängig von der beabsichtigten Verwendung der Liposomen und das Mittel in dem Liposom 22,23 eingekapselt ist. Die Hydratisierung Puffer sollte oberhalb der Gel-liq gehalten werdenuid Kristall-Übergangstemperatur (Tc oder Tm) der Lipide oder Liposomen nicht richtig rehydrieren. In dem beschriebenen Protokoll wurden die suspendierten Liposomen einheitlich dimensionierten unter Verwendung eines Extruders. Allerdings können die Liposomen auch mit Spritzenfilter oder Beschallung ausgelegt werden. Die gleichen Filterporengrößen für den Extruder verwendet wird, kann als Spritzenfilter verwendet werden. Auch kann die Liposomensuspension nach der Hydratisierung mit der siRNA-Lösung der Größe verändert werden. Jedoch beobachteten wir einen Verlust von siRNA aus Liposomen, wenn sie durch den Extruder nach der Hydratationsstufe (nicht veröffentlichte Daten) bemessen.
Da die biologische Rolle von PrP C ist noch nicht verstanden , 5 ist es möglich , dass es könnten einige schädliche Wirkungen durch Verringerung PrP C Stufen hergestellt werden. Da jedoch Prion - Protein - defiziente Mäuse entwickeln, verhalten, und das Alter der Regel 24, ist es wahrscheinlich , dass diese schädlichen Wirkungen entweder gering sein würde oder nicht sichtbar offensichtlich. Des Weiteren siRNA Knockdown von PrP <sup> C - Ausdruck nicht vollständig Proteinexpression abschaffen und ist vollständig reversibel , ohne die Möglichkeit der viralen Onkogenese, im Gegensatz zu lentivector RNAi 23.
Einschränkungen bei den Abgabesysteme umfassen die Aufnahme von anionischen PALETS in biologische Membranen verringert, und die Immunogenität von LSPCs aufgrund der kationischen Lipiden. Wenn Immunogenität der LSPCs beobachtet wird, kann PALETS als Alternative verwendet werden. Verminderte Aufnahme von anionischen PALETS in anionische biologische Membranen können unter Verwendung von kationischen PALETS überwunden werden oder durch Reformulierung anionische PALETS mit einem Gemisch aus kationischen und anionischen Lipiden.
In diesem Bericht ändert sich die Reduktion von PrPC weit von der Maus zum Maus. Variation zwischen Mäusen, die kleine Durchmesser von Venen in Mäuse oder Abbau von siRNA: Diese Variante könnte auf eine Vielzahl von Faktoren zurückzuführen sein. Die Verwendung von durch Inzucht erzeugten Mäusen sollte viel der Variabilität zwischen Mäusen beseitigen, aber Variation ist immer möglich, sogarmit Inzuchtmäusen. Auch Mäuse haben sehr kleine Venen im Vergleich zu anderen Tiermodellen. So kann problematisch sein, ein großes Volumen in die Venen von Mäusen injiziert wird. Wir empfehlen, zu üben Injektionen, bevor Sie versuchen PALETS oder LSPCs zu injizieren. Aber auch bei der Praxis manchmal dauert es noch ein paar Injektionen alle Volumen PALETS / LSPCs in die Maus zu erhalten, und die Vene in jedem dieser Injektionen kollabieren kann. So könnte man die Maus erhalten alle das Volumen der PALETS / LSPCs, während eine andere Maus nur 75-90% des PALETS / LSPCs Volumen erhalten könnten.
Andere mögliche Variationsquellen umfassen Zirkulationszeit und Abbau der siRNA durch Serumproteine. Die PALETS / LSPCS könnte länger zirkulieren, bevor das Gehirn in einer Maus im Vergleich zu einem anderen zu erreichen, die die Variation erklären könnte. Wir ließen nur LSPCs 24 h zirkulieren, bevor Mäuse in dem obigen Experiment euthanizing. Wenn die Umlaufzeit die Veränderung verursacht, zu erhöhen dann die circulation Zeit über 24 Stunden sollte eine gewisse Variation zu reduzieren. Obwohl wir die siRNA mit den PALETS / LSPCs verpacken, gibt es immer eine Möglichkeit der Verschlechterung der siRNA und / oder Lieferfahrzeuge. Wie bereits erwähnt, sind die kationischen Lipide geringfügig immunogen. Also, wenn Immunzellen im Blut, die Fahrzeuge angreifen, dann würde es länger dauern, für die Fahrzeuge an das Gehirn oder die Fahrzeuge geliefert werden könnten abgebaut werden. Der Wechsel von kationischen Lipiden PALETS anionische könnte helfen, die langsam Zirkulationszeit oder den Abbau zu reduzieren, wenn kationische Lipide verwendet wird.
Das RVG-9R Peptid transportiert die LSPCs und PALETS auf eine beliebige Zelle innerhalb des ZNS, die Nikotinacetylcholinrezeptoren enthält. Dies umfasst sowohl neuronale Zellen Mikroglia und Astrozyten 26. Für PALETS oder LSPCs eine wirksame Behandlung für Prionenerkrankungen zu sein, ist es wichtig, alle Zellen zu zielen, die Prion-Pathogenese beitragen. Neuronale Zellen enthalten die meisten PrP C 27,28 , die Ausbreitung von Prionen im Gehirn beitragen. Neuronalen Zellen Targeting und die Verringerung der Ausdruck "Zellen PrP C könnte zu einer Erniedrigung der Prionen Pathogenese zur Folge haben . Jedoch sind neuronalen Zellen nicht der einzige Zelltyp, der Prionenerkrankung beiträgt. Astrozyten wurden in der Replikation von Prionen 29,30 gebracht. Daher ist es nicht nur wichtig, neuronale Zellen zu zielen, sondern auch Astrozyten Ziel prion Pathogenese reduzieren.
Die Liefer hier beschriebenen Systeme sind offen für verschiedene Optimierungsstrategien, die sie geeignet für ein breites Spektrum von Krankheiten Anwendungen machen würde. LSPCs und PALETS fähig sind, jede kleines Molekül als Wirkstoff in das ZNS zu transportieren, nicht nur siRNA, denen die Fahrzeuge die Möglichkeit gibt mehr als nur neurodegenerative Krankheiten zu behandeln. PALETS und LSPCs könnte jede Krankheit zu behandeln verwendet werden, wirkt sichdas Gehirn auf dem kleinen Molekül als Wirkstoff je in die Fahrzeuge geladen. Außerdem könnte die Targeting-Peptid zu ändern erlauben die Abgabevehikeln niedermolekularer Wirkstoffe auf eine bestimmte Untergruppe von Zellen innerhalb des ZNS, anstelle einer beliebigen Zelle zu liefern, die Acetylcholin-Rezeptoren aufweist. PALETS und LSPCs stellen eine neue, effizientere und flexiblere Abgabesystem für Medikamente kleines Molekül zur Behandlung von Krankheiten, die das ZNS beeinflussen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
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