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Bioengineering

सीएनएस को चिकित्सीय siRNA की डिलिवरी cationic और Anionic Liposomes का प्रयोग

Published: July 23, 2016 doi: 10.3791/54106
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

Introduction

Prions गंभीर neurodegenerative रोगों कि सीएनएस को प्रभावित कर रहे हैं। Prion रोगों सामान्य सेलुलर प्रिओन प्रोटीन, पीआरपी सी, के misfolding PrP रेस नामक एक संक्रामक isomer द्वारा से परिणाम। इन रोगों मनुष्य 1-3 में गायों में गोजातीय स्पॉन्जिफ़ॉर्म एनसिफ़लॉपैथी, स्क्रैपी भेड़ में, cervids में जीर्ण बर्बाद कर रोग, और क्रुत्ज़फेल्ट-जेकब रोग सहित प्रजातियों में से एक विस्तृत विविधता प्रभावित करते हैं। Prions neurodegeneration कि synaptic हानि के साथ शुरू होता है, और vacuolization की प्रगति, gliosis, न्यूरोनल हानि, और पट्टिका जमा कारण। आखिरकार, पशु / व्यक्तिगत 4 की मौत हो जाती है। दशकों के लिए, शोधकर्ताओं ने धीमी गति से या प्रिओन रोग की प्रगति को रोकने के लिए होती यौगिकों की जांच की है। लेकिन, शोधकर्ताओं या तो एक सफल चिकित्सा या एक प्रभावी प्रणालीगत डिलीवरी वाहन नहीं मिला है।

अंतर्जात PrP सी अभिव्यक्ति प्रिओन रोगों 5 के विकास के लिए आवश्यक है सी अभिव्यक्ति एक देरी या बीमारी के सुधार में परिणाम हो सकता है। कई समूहों PrP सी का स्तर कम या सीधे shRNA व्यक्त murine मस्तिष्क के ऊतकों में प्रिओन रोग में PrP सी अभिव्यक्ति के स्तर की भूमिका की जांच करने के लिए इंजेक्शन lentivectors साथ ट्रांसजेनिक चूहों बनाया। इन शोधकर्ताओं ने न्यूरोनल PrP सी की मात्रा को कम पाया प्रिओन रोगों के प्रगतिशील तंत्रिकाविकृति विज्ञान रोकने में हुई और जानवरों 6-9 के जीवन बढ़ाया। हम उस माउस neuroblastoma कोशिकाओं 10 में PrP रेस की निकासी में PrP सी siRNA उपचार के परिणाम की सूचना है। इन अध्ययनों कि चिकित्सा के उपयोग, पीआरपी सी अभिव्यक्ति के स्तर को कम करने के लिए, छोटे दखल शाही सेना (siRNA), जो cleaves mRNA की तरह पर्याप्त प्रिओन रोगों की प्रगति में देरी हो सकती सुझाव देते हैं। हालांकि, ज्यादातर उपचारों प्रिओन रोगों के लिए जांच तरीके है कि व्यावहारिक नहीं होगा में दिया गयाएक नैदानिक ​​सेटिंग में। इसलिए, एक siRNA चिकित्सा एक प्रणालीगत वितरण प्रणाली है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नसों के द्वारा दिया और लक्षित है की जरूरत है।

जांचकर्ता जीन थेरेपी उत्पादों के लिए वितरण वाहनों के रूप में liposomes के उपयोग का अध्ययन किया है। Cationic और ऋणात्मक लिपिड दोनों liposomes के गठन में इस्तेमाल कर रहे हैं। Cationic लिपिड अधिक व्यापक रूप से ऋणात्मक लिपिड से इस्तेमाल कर रहे हैं क्योंकि cationic लिपिड और डीएनए / आरएनए के बीच अंतर प्रभारी कुशल पैकेजिंग के लिए अनुमति देता है। Cationic लिपिड का एक अन्य लाभ यह है कि वे अन्य लिपिड 11-14 की तुलना में अधिक आसानी से कोशिका झिल्ली को पार है। हालांकि, cationic लिपिड ऋणात्मक लिपिड 13,14 से अधिक immunogenic हैं। इसलिए, शोधकर्ताओं liposomes में लिपिड anionic को cationic का उपयोग करने से शिफ्ट करने शुरू कर दिया है। जीन थेरेपी उत्पादों कुशलता से सकारात्मक आरोप लगाया पेप्टाइड protamine सल्फेट, जो डीएनए / आरएनए अणुओं 15-19 संघनित का उपयोग कर ऋणात्मक liposomes में पैक किया जा सकता है। ऋणात्मक लिपि के बादडी एस cationic लिपिड वे संचलन गुना वृद्धि हुई है, हो सकता है और पशु मॉडल 13,14 में और अधिक सहन किया जा सकता है की तुलना में कम immunogenic हैं। Liposomes पेप्टाइड्स कि liposomes से जुड़े होते हैं लक्ष्यीकरण का उपयोग विशिष्ट ऊतकों को लक्षित कर रहे हैं। RVG-9R neuropeptide, जो निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स को बांधता है, सीएनएस 17-20 को siRNA और liposomes निशाना बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

इस रिपोर्ट की रूपरेखा एक प्रोटोकॉल तीन siRNA वितरण वाहनों का उत्पादन करने के लिए, और पैकेज और neuronal कोशिकाओं (चित्रा 1) के लिए siRNA देने के लिए। Liposome-siRNA पेप्टाइड परिसरों (LSPCs) siRNA साथ liposomes से बना रहे हैं और RVG-9R को लक्षित पेप्टाइड electrostatically liposome की बाहरी सतह से जुड़ी है। पेप्टाइड समझाया चिकित्सीय siRNA (Palets) liposome siRNA और protamine liposome भीतर समझाया से बना रहे हैं को संबोधित किया, साथ RVG-9R covalently लिपिड खूंटी समूहों को बंधुआ। नीचे विधियों का प्रयोग LSPCs और Palet उत्पन्न करने के लिएएस, पीआरपी सी siRNA neuronal कोशिकाओं में 90% है, जो इलाज या काफी हद तक प्रिओन रोग विकृति की शुरुआत में देरी करने के लिए जबरदस्त वादा धारण करने के लिए PrP सी अभिव्यक्ति कम हो जाती है।

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Protocol

सभी चूहों नस्ल और लैब पशु संसाधन, कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आकलन और लैब पशु की देखभाल इंटरनेशनल, के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा मान्यता प्राप्त पर बनाए रखा गया।

1. LSPCs की तैयारी

  1. 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-प्रोपेन): LSPCs के लिए कोलेस्ट्रॉल अनुपात एक 1 का प्रयोग करें। 1 क्लोरोफॉर्म: एक फ्लास्क में मेथनॉल समाधान के लिए एक 4 nmole liposome तैयारी के लिए, DOTAP के 2 nmoles और एक 1 के 10 मिलीलीटर में कोलेस्ट्रॉल के 2 nmoles मिश्रण।
  2. मेथनॉल समाधान के लिए एक धूआं हुड में उपयोग करते हुए एन 2 गैस: क्लोरोफॉर्म के 9 मिलीलीटर लुप्त हो जाना। एक धूआं हुड में रात भर गैस के बिना विलायक के अंतिम 1 मिलीलीटर लुप्त हो जाना। कुप्पी के तल पर एक पतली लिपिड फिल्म का निरीक्षण करें।
  3. 55 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 10% sucrose के समाधान के हीट 10 मिलीलीटर।
  4. पतली लिपिड फिल्म पर गर्म 10% sucrose के समाधान धीरे-धीरे, न्यूनतम डालो यानी 1 मिलीग्राम / है, जबकि जीईntly कुप्पी घूमता। 10% sucrose और 55 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड के साथ फ्लास्क को बनाए रखने के लिए इतना है कि लिपिड अणु जेल तरल चरण में रहते हैं। multilamellar पुटिका (MLV) के गठन में पुनर्जलीकरण का परिणाम है।
  5. लिपिड liposomes नौकरशाही का आकार घटाने से पहले कम से कम एक घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर rehydrate करने की अनुमति दें।
  6. 1.0 माइक्रोन फिल्टर के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक extruder इकट्ठा या नौकरशाही का आकार घटाने के लिए 1.0 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करें।
  7. बाहर निकालना पर सीरिंज से एक के लिए गर्म liposome निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 11 बार दो सीरिंज के बीच निलंबन गुजरती हैं। सुनिश्चित करें कि निलंबन 11 गुजरता के बाद शुरू सिरिंज से विपरीत सिरिंज में है।
  8. आकार liposomes फिर से 0.45 माइक्रोन के माध्यम से तो 0.2 माइक्रोन फिल्टर बड़े unilamellar पुटिकाओं (LUVs) उत्पन्न करने के लिए। liposome निलंबन आसान नौकरशाही का आकार घटाने के लिए गर्म रखें।
  9. एक 20 माइक्रोन के 200 μl के साथ 4 nmole liposome निलंबन (200 माइक्रोन) के 20 μl सेते (4nmole कुल) कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए शेयर siRNA समाधान।
  10. एक 500 माइक्रोन (40 nmole कुल) शेयर आरटी पर 10 मिनट के लिए siRNA / liposome समाधान के साथ RVG-9R समाधान के 80 μl सेते हैं। LSPCs संभव के रूप में जल्द ही इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन तैयारी के बाद कई घंटे तक इस्तेमाल किया जा सकता है। तैयारी के बाद कई घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर LSPCs।

2. Palets की तैयारी

  1. 40:: या तो डीएसपीई (1,2-distearoyl-एस.एन.-glycero-3-phosphoethanolamine) के 5 दाढ़ अनुपात: कोलेस्ट्रॉल: डीएसपीई खूंटी या DOTAP: कोलेस्ट्रॉल: डीएसपीई खूंटी Palets के लिए एक 55 का प्रयोग करें। 1 क्लोरोफॉर्म: एक फ्लास्क में मेथनॉल समाधान के लिए एक 4 nmole liposome तैयारी के लिए, या तो डीएसपीई या DOTAP के 2.2 nmoles, कोलेस्ट्रॉल की 1.6 nmoles, और एक 2 के 10 मिलीलीटर में डीएसपीई खूंटी के 0.2 nmoles मिश्रण।
  2. वास्तव में कदम 1.1 और इसके बाद के संस्करण 1.2 में वर्णित के रूप में liposome निलंबन तैयार करें। 1x पीबीएस के 10 मिलीलीटर में डीएसपीई liposomes rehydrate 75 डिग्री सेल्सियस तक गर्म, 1 मिलीग्राम / मिनट जोड़ने। लिपिड पर के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर rehydrate करने की अनुमति देंनौकरशाही का आकार घटाने से पहले कम से कम 1 घंटा।
  3. आकार liposome निलंबन बिल्कुल के रूप में कदम 1.6-1.8 में वर्णित है।
  4. Pipet DOTAP और डीएसपीई liposomes के बाद एकल उपयोग aliquots में 4 nmole (200 माइक्रोन) के liposome निलंबन से प्रत्येक के 20 μl आकार दिया गया है, और एक benchtop फ्रीज ड्रायर (चित्रा 2) का उपयोग करते हुए 30 मिनट के लिए lyophilize है।
  5. एक 20 माइक्रोन के एक 26.6 माइक्रोन के siRNA के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए protamine सल्फेट के समाधान है कि डीएसपीई Palets liposomes में समझाया जा करने के लिए 1.4 μl के साथ (4 nmole कुल) शेयर siRNA समाधान के 200 μl सेते हैं।
  6. siRNA के एक 4 nmole शेयर समाधान के 200 μl के साथ DOTAP Palets liposomes rehydrate या siRNA / protamine समाधान के 201.4 μl साथ rehydrate डीएसपीई Palets liposomes। आरटी पर 10 मिनट के लिए liposome / siRNA समाधान सेते हैं।
  7. दोनों DOTAP और डीएसपीई Palets के लिए liposome / siRNA समाधान करने के लिए एक 60 मिमी 1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी) समाधान के 10 μl जोड़ें।
  8. दोनों DOTAP और डीएसपीई Palets के लिए liposome / siRNA समाधान के लिए एक 150 मिमी एन hydroxysulfosuccinimide (sulfo एनएचएस) समाधान के 10 μl जोड़ें।
  9. आरटी पर 2 घंटे के लिए siRNA / liposome निलंबन के साथ ईडीसी और sulfo एनएचएस सेते हैं।
  10. एक 500 माइक्रोन (40 nmole कुल) शेयर siRNA / liposome आरटी पर 10 मिनट के लिए समाधान crosslinking साथ RVG-9R समाधान के 80 μl सेते हैं।
    नोट: ईडीसी / sulfo एनएचएस खूंटी लिपिड covalently बंधन को RVG-9R अनुमति देता है। तैयारी के बाद कई घंटा के भीतर Palets का प्रयोग करें। तैयारी के बाद कई घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर Palets।
  11. Palets की siRNA encapsulation क्षमता का निर्धारण करने के लिए:
    1. siRNA की एकाग्रता को मापने के पहले और protamine और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 260 एनएम पर सेट का उपयोग कर liposomes के अलावा के बाद।
    2. 50 केडीए केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग liposome / समझाया siRNA निलंबन से unencapsulated siRNA फ़िल्टर। 20 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. की एकाग्रता को मापनेछानना में unencapsulated siRNA और retentate में समझाया siRNA की एकाग्रता 260 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग।

3. LSPCs या Palets के साथ चूहों को इंजेक्शन

  1. एक गर्मी दीपक को 5-10 मिनट के लिए चूहों को बेनकाब वाहिका को चौड़ा करने के लिए।
  2. एक 2-3% isofluorane / ऑक्सीजन के साथ माउस anesthetize प्रवाह 5-10 मिनट के इंजेक्शन से पहले, और इंजेक्शन के दौरान। anesthetization की पुष्टि जब जानवर नहीं रह चलनक्षम है और श्वास एक पैर की अंगुली चुटकी कर रही द्वारा धीमा है। पूंछ नस का उपयोग करने के लिए अपनी पीठ या पक्ष पर माउस रखें। जबकि संज्ञाहरण के तहत सुखाने को रोकने के लिए माउस की आँखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
  3. पोंछ / 70% EtOH के साथ पूंछ स्प्रे और एक 26 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग माउस की पूंछ नस पर LSPCs या Palets के 300 μl इंजेक्षन। पूंछ नस में इंजेक्शन लगाने distally शुरू करें और proximally लिए कदम नस गिर या ruptures है।
  4. एक साफ पिंजरे में माउस रखें जब तक यह स्टर्नल लेटना बनाए रखता है। मो जगह नहीं हैअन्य पिंजरे साथियों के साथ उपयोग करें जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो गया है। चूहे 5 से 15 मिनट में ठीक हो जाना चाहिए। वे एक हीटिंग पैड पर या एक गर्मी दीपक शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए वसूली अब लगता है कि अगर अंतर्गत रखा जा सकता है। चूहे अधिक हीटिंग के खिलाफ की रक्षा करने के लिए बारीकी से नजर रखी जानी चाहिए।
  5. इंजेक्शन के बाद जानवर कई घंटे मॉनिटर संज्ञाहरण बंद पहनता है सुनिश्चित करने के लिए है, और वहाँ उपचार की कोई बुरा प्रभाव हैं। LSPCs या Palets कम से कम 24 घंटे के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें।

4. से फ्लो के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति की विश्लेषण

  1. 15 मिनट के लिए एक 20% सीओ 2 के प्रवाह की दर के साथ चूहों euthanize।
  2. त्वचा और माउस का उपयोग कैंची की खोपड़ी दूर काटने से मस्तिष्क के आधे से एक गोलार्द्ध काटना। पील दूर आधे मस्तिष्क के एक गोलार्द्ध खोपड़ी चिमटे या कैंची की एक जोड़ी के अंत का उपयोग करने से दूर।
  3. एक 40 माइक्रोन जाल सेल FACS बफर के 2.5 मिलीलीटर का उपयोग कर झरनी के माध्यम से प्रत्येक माउस से मस्तिष्क के आधे से एक गोलार्द्ध प्रेस (1x; पीबीएस, 1% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 मिमी EDTA) एक सिरिंज के सवार के साथ एक पेट्री डिश में।
  4. FACS बफर के एक अतिरिक्त 2.5 मिलीलीटर के साथ सेल झरनी और पेट्री डिश कुल्ला। बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एकल कक्ष निलंबन रखो।
  5. Pipet पर 350 x जी 5 मिनट के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 5 मिलीलीटर एकल कक्ष निलंबन के 100 μl। FACS बफर के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली त्यागें। 5 मिनट के लिए 350 XG पर स्पिन। FACS बफर के एक और 1 मिलीलीटर के साथ दोहराएँ। बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  6. बर्फ पर 30-60 मिनट के लिए एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल चूहा विरोधी माउस एफसी FACS बफर में ब्लॉक के 100 कमजोर पड़ने: 1 के 100 μl में कोशिकाओं को सेते हैं। गोली और 4.5 कदम के रूप में कोशिकाओं को धो लें। बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  7. 30-60 मिनट के लिए एक 20 माइक्रोग्राम / एमएल फ्लोरोसेंट माउस PrP सी के खिलाफ 7% माउस सीरम में FACS बफर में बर्फ पर एंटीबॉडी के 100 μl में कोशिकाओं को सेते हैं। गोली और 4.5 कदम के रूप में कोशिकाओं को धो लें। सेल निलंबन रखेंबर्फ पर।
  8. गोली और 1 मिनट के लिए आरबीसी lysis बफर के 1 मिलीलीटर (1x पीबीएस 155 मिमी एनएच 4 सीएल, 12 मिमी NaHCO 3, 0.1 मिमी EDTA) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 4.5 कदम के रूप में गोली और FACS बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  9. के रूप में पहले 10 में वर्णित कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग कर विश्लेषण PrP सी अभिव्यक्ति। गेट कुल सेल की आबादी से कोशिकाओं रहते हैं। गेट PrP सी + लाइव सेल की आबादी से कोशिकाओं एमएफआई (मंझला फ्लोरोसेंट तीव्रता) निर्धारित करने के लिए।

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Representative Results

ऋणात्मक Palets भीतर siRNA encapsulation की दक्षता बढ़ाने के लिए, siRNA protamine के साथ मिलाया गया था। SiRNA के लिए अच्छी protamine एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, siRNA protamine के विभिन्न सांद्रता के साथ मिलाया गया था, 1 से: 1 से 2: 1 (चित्रा 3)। protamine के उपयोग के बिना ऋणात्मक liposomes में एक 60-65% siRNA encapsulation दक्षता नहीं थी। protamine साथ नमूने: siRNA दाढ़ अनुपात 1: 1 से 1.5: 1 (133-266 एनएम) 80-90% siRNA encapsulation था। 1.5 ऊपर दाढ़ अनुपात: 1 siRNA / protamine परिसरों की वर्षा में हुई। ये उपजी परिसरों ऋणात्मक liposomes में समझाया नहीं कर रहे थे। siRNA को protamine के अलावा के बाद वहाँ siRNA की एकाग्रता में मामूली कमी, कमजोर पड़ने की वजह से था; हालांकि, एकाग्रता protamine के अलावा (चित्रा 3 बी) के बाद स्थिर बने रहे। 50 केडीए फिल्टर, siRNA के 90-95% के साथ liposomes छानने के बादliposome retentate के साथ जुड़े थे, जबकि siRNA के 5-10% छानना में 'मुफ्त' था। कोई siRNA protamine या liposome केवल नमूने (चित्रा -3 सी) में पाया गया था।

विवो में LSPCs के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, wildtype चूहों 24 घंटे के लिए LSPCs के साथ इलाज किया गया। LSPCs के साथ इलाज किया wildtype चूहों के PrP सी अभिव्यक्ति के स्तर 1x पीबीएस के साथ इलाज चूहों को और पीआरपी पीटकर (पीआरपी को) चूहों (चित्रा 4) की तुलना में थे। PrP सी की cytometric विश्लेषण प्रवाह LSPCs के साथ इलाज चूहों के दिमाग में PrP सी के स्तर में कमी देखी गई (चित्रा -4 ए और 4 बी)। एक प्रयोग में, सभी चूहों PrP सी स्तर के 80-90% की कमी, पीआरपी सी का स्तर है कि PrP को चूहों (चित्रा 4 ए) में मनाया गया के करीब था। दो और स्वतंत्र प्रयोगों में LSPCs के साथ इलाज चूहों PrP सी के एक 40-80% की कमी <दिखाया/ sup> स्तर (चित्रा 4 बी)। कुल LSPCs से बाहर इलाज चूहों (एन = 14), वहाँ केवल एक माउस LSPCs लिए कोई जवाब नहीं था।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रोटोकॉल Palets / LSPCs पैदा करते हैं और चूहे की सीएनएस को नसों के siRNA उद्धार करने का अवलोकन Liposomes पतली लिपिड फिल्म हाइड्रेशन विधि के माध्यम से उत्पन्न किया गया। PrP सी siRNA तो या तो एक electrostatic बातचीत के माध्यम से या encapsulation द्वारा liposomes से जुड़ा था। Palets या LSPCs सीएनएस को लक्षित पेप्टाइड RVG-9R के अलावा द्वारा पूरा किया गया। विधानसभा के बाद, Palets / LSPCs चूहों की पूंछ नसों में इंजेक्शन थे, और 24 घंटा उपचार के बाद PrP सी अभिव्यक्ति के प्रवाह के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था cytometry। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: पतली लिपिड फिल्म जलयोजन विधि के प्रोटोकॉल Palets डिलीवरी वाहन के लिए डीएसपीई Liposomes उत्पन्न करने के लिए लिपिड भंग कर दिया और एक क्लोरोफॉर्म में मिलाया गया। मेथनॉल समाधान है, जो एक सूखी लिपिड फिल्म उत्पन्न करने के लिए सुखाया गया था। सूखे लिपिड फिल्म 1x पीबीएस में resuspended था multilamellar पुटिकाओं (MLVs) बनाने के लिए। MLVs तो समान रूप से LUVs उत्पन्न करने के लिए एक extruder का उपयोग कर आकार थे। LUVs तो निलंबन में इस्तेमाल किया जा सकता है, या एकल उपयोग aliquots में lyophilized। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: में siRNA के encapsulation क्षमता डीएसपीई Palets U गाओ Protamine सल्फेट। (ए) siRNA के बारे में 60-65% protamine के अलावा बिना समझाया गया था। 1 और 1.5: 1 protamine: siRNA अनुपात protamine के अलावा के साथ, वहाँ 1 के बीच एक 90% encapsulation दक्षता था। (ख) किसी भी मुक्त siRNA से liposomes को छान के बाद, siRNA के 90% लिपोसोमल अंश में पाया गया था, जबकि unencapsulated siRNA के 5-10% छानना में मिला था। (सी) Protamine और liposome ही समाधान समझाया siRNA के लिए स्वतंत्र हैं। siRNA के बारे में 60-65% protamine के उपयोग के बिना डीएसपीई liposomes भीतर समझाया गया था। 186.2 एनएम के एक एकाग्रता में protamine के उपयोग के साथ, siRNA के बारे में 90% डीएसपीई liposomes भीतर समझाया गया था। त्रुटि सलाखों SEM संकेत मिलता है। **** पी <0.0001 इंगित करता है। * पी <0.01 इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ve_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 4
चित्रा 4:। ब्रेन सेल निलंबन के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric विश्लेषण LSPCs साथ 24 घंटा उपचार के बाद LSPCs wildtype चूहों और दिमाग की पूंछ नसों में इंजेक्शन थे 24 घंटा बाद में काटा गया। पीबीएस एक इलाज के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और एक PrP KO माउस PrP सी स्तर के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। (ए) LSPCs के साथ इलाज चूहों पीबीएस नियंत्रण है, जो wildtype PrP सी के स्तर से पता चलता है की तुलना में PrP सी स्तर की एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई। LSPCs इलाज चूहों एक PrP KO माउस के करीब PrP सी स्तर से पता चला। (बी) के तीन स्वतंत्र ही 24 घंटा उपचार प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगों से संचयी डेटा पीबीएस wildtype में PrP सी के रिश्तेदार राशि दिखाया और LSPCs इलाज चूहों। तीन प्रयोगों के उस पार, चूहों LSPCs थानेदार के साथ इलाजPrP सी के स्तर में महत्वपूर्ण घटने से शादी पीबीएस wildtype नियंत्रण की तुलना में। त्रुटि सलाखों SEM संकेत मिलता है। *** पी <0.0003 इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस रिपोर्ट में दो लक्षित वितरण प्रणाली है कि कुशलतापूर्वक सीएनएस को siRNA transports बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। सीएनएस को siRNA पहुंचाने का पिछला तरीकों मस्तिष्क, लक्षित siRNA की नसों में इंजेक्शन, या गैर लक्षित liposome-siRNA परिसरों की नसों में इंजेक्शन में सीधे इंजेक्शन लगाने siRNA / shRNA वैक्टर शामिल थे। सीएनएस में siRNA / shRNA वैक्टर इंजेक्शन लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में कमी का कारण होता है। हालांकि, siRNA / shRNA सीएनएस के माध्यम से स्वतंत्र रूप से फैलाना नहीं है। इसके अलावा, इन इंजेक्शनों आसन्न तंत्रिका ऊतक 6-9 को नुकसान में परिणाम। लक्षित siRNA की नसों में इंजेक्शन भी लक्ष्य प्रोटीन की कमी का परिणाम है। हालांकि, siRNA के सबसे सीरम प्रोटीन 20 से अपमानित किया जाता है। अन्त में, जिगर और mononuclear भक्षककोशिकीय प्रणाली 21 से गिरावट के भीतर siRNA के फंसाने में अलक्षित liposome-siRNA परिसरों परिणामों की नसों में इंजेक्शन। siRNA वितरणऊपर वर्णित वाहनों, LSPCs और Palets, सीधे siRNA पहुंचाने सीएनएस द्वारा पिछले विधियों की तुलना में एक सुरक्षित, और अधिक प्रभावी और कुशल वितरण प्रणाली प्रदान करते हैं। LSPCs और Palets भी सीएनएस के लिए अन्य छोटे अणु दवाओं ले जाने में सक्षम हैं।

Palets या LSPCs विधानसभा के बाद कुछ ही घंटों के भीतर किया जाना चाहिए। अन्यथा वहाँ siRNA गैर कार्यात्मक / अपमानित बनने का खतरा है। अन्य महत्वपूर्ण कदम है कि नहीं रोका जा सकता है / बाधित तैयारी और से फ्लो के लिए सेल निलंबन के चल रहा है। यह वही दिन है कि सेल निलंबन के लिए तैयार है पर प्रवाह cytometry प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि निलंबन जीवित कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए जिंदा रहने के लिए जरूरत है कि शामिल हैं।

वहाँ प्रोटोकॉल उस पर LSPCs या Palets क्या छोटे अणु दवा LSPCs या Palets में भरी हुई है पर, इन विट्रो में या विवो में इस्तेमाल किया जाएगा कि क्या आधार पर बदला जा सकता है के भीतर कुछ कदम उठाए हैं, और श्रम परatory वरीयता। सबसे पहले, LSPCs और Palets के लिपिड दाढ़ अनुपात में अन्य अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, phosphatidylethanolamine (डीएसपीई में पीई) खराब है जब एक 60% वजन / वजन या अधिक पर इस्तेमाल किया हाइड्रेट्स। जब इन उच्च सांद्रता में इस्तेमाल किया, डीएसपीई अणुओं एक दूसरे के साथ समग्र और लिपिड के एक अघुलनशील बड़े पैमाने के रूप में होगा। लिपिड के इस जन siRNA encapsulate करने के लिए सक्षम नहीं है। अगर एन 2 गैस उपलब्ध नहीं है, लिपिड मिश्रण वाष्पीकरण का उपयोग कर सुखाया जा सकता है। वाष्पीकरण के बारे में 3 दिन लगते हैं, और मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म के उपयोग के कारण एक धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, पतली लिपिड फिल्म 1x पीबीएस के साथ resuspended गया था, लेकिन यह भी अन्य हाइड्रेशन buffers के साथ resuspended जा सकता है। अन्य बफ़र्स पानी, 10% सूक्रोज, या किसी अन्य जलीय बफर शामिल हैं। पुनर्जलीकरण बफर के चुनाव liposomes का इरादा उपयोग पर निर्भर है और एजेंट liposome 22,23 भीतर समझाया जा रहा है। हाइड्रेशन बफर जेल liq ऊपर रखा जाना चाहिएलिपिड या liposomes की यूआईडी क्रिस्टल संक्रमण तापमान (टीसी या टीएम) ठीक से rehydrate नहीं होंगे। वर्णित प्रोटोकॉल में, निलंबित liposomes समान रूप से एक extruder का उपयोग कर आकार थे। हालांकि, liposomes भी सिरिंज फिल्टर या sonication का उपयोग आकार जा सकता है। एक ही फिल्टर ताकना बाहर निकालना के लिए इस्तेमाल किया आकार सिरिंज फिल्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, liposome निलंबन siRNA समाधान के साथ हाइड्रेशन के बाद आकार दिया जा सकता है। हालांकि, हम liposomes से siRNA के एक नुकसान मनाया जब हाइड्रेशन कदम (अप्रकाशित डेटा) के बाद बाहर निकालना द्वारा आकार।

चूंकि PrP सी की जैविक भूमिका अभी तक समझ नहीं है 5, यह संभव है कुछ हानिकारक PrP सी के स्तर को कम करने से उत्पादित प्रभाव हो सकता है। हालांकि, क्योंकि प्रिओन प्रोटीन चूहों की कमी का विकास, व्यवहार करते हैं, और उम्र सामान्य रूप से 24 है, यह संभावना है कि इन हानिकारक प्रभाव या तो मामूली या दिख स्पष्ट नहीं किया जाएगा है। इसके अलावा, पीआरपी के siRNA पछाड़ना <sup> सी अभिव्यक्ति पूरी तरह से प्रोटीन अभिव्यक्ति को समाप्त नहीं होता और वायरल oncogenesis की कोई संभावना नहीं के साथ पूरी तरह से प्रतिवर्ती है, lentivector आरएनएआई 23 के विपरीत है।

वितरण प्रणाली के साथ सीमाओं cationic लिपिड के कारण जैविक झिल्लियों में ऋणात्मक Palets, और LSPCs के प्रतिरक्षाजनकता के तेज कम करना शामिल है। LSPCs के प्रतिरक्षाजनकता मनाया जाता है, Palets एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ऋणात्मक जीवविज्ञान झिल्ली में ऋणात्मक Palets की घटी हुई तेज, cationic Palets का या cationic और ऋणात्मक लिपिड का एक मिश्रण के साथ ऋणात्मक Palets को पुन: द्वारा दूर किया जा सकता है।

इस रिपोर्ट में, PrPC की कमी माउस से माउस के लिए व्यापक रूप से भिन्न होता है। इस बदलाव कारकों की एक किस्म की वजह से हो सकता है: siRNA के चूहों के बीच भिन्नता, चूहों में नसों के छोटे व्यास, या गिरावट। जन्मजात चूहों का उपयोग चूहों के बीच परिवर्तनशीलता के बहुत खत्म करना चाहिए, लेकिन भिन्नता भी हमेशा संभव हैजन्मजात चूहों के साथ। इसके अलावा, चूहों अन्य पशु मॉडल की तुलना में बहुत छोटी नसों है। तो, चूहों की रगों में एक बड़ी मात्रा में इंजेक्शन लगाने के समस्याग्रस्त किया जा सकता है। हम Palets या LSPCs इंजेक्षन करने के लिए प्रयास करने से पहले इंजेक्शन का अभ्यास सलाह देते हैं। हालांकि, यहां तक ​​अभ्यास के साथ, कभी कभी यह अभी भी इंजेक्शन के एक जोड़े के माउस में Palets / LSPCs के सभी मात्रा ले लेता है, और नस इन इंजेक्शनों में से किसी एक में गिर सकते हैं। तो, एक माउस, Palets / LSPCs के सभी मात्रा प्राप्त हो सकती है, जबकि एक और माउस केवल Palets / LSPCs मात्रा का 75-90% प्राप्त हो सकता है।

भिन्नता के अन्य संभावित स्रोतों प्रचलन समय और siRNA की गिरावट सीरम प्रोटीन से शामिल हैं। Palets / LSPCS अन्य की तुलना में एक माउस में दिमाग है, जो बदलाव की व्याख्या कर सकता तक पहुँचने से पहले लंबे समय तक प्रसारित हो सकता है। हम केवल LSPCs ऊपर प्रयोग में चूहों euthanizing से पहले 24 घंटे के लिए प्रसारित करने की अनुमति दी। संचलन समय भिन्नता पैदा कर रहा है, तो circul बढ़ रही है24 घंटा से परे व्यावहारिक समय कुछ भिन्नता को कम करना चाहिए। हालांकि हम Palets / LSPCs साथ siRNA पैकेज, वहाँ हमेशा siRNA और / या वितरण वाहनों की गिरावट का एक मौका है। जैसा कि पहले उल्लेख, cationic लिपिड थोड़ा immunogenic हैं। तो, खून के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के वाहनों पर हमला कर रहे हैं, तो यह लंबे समय तक ले जाएगा वाहनों के लिए मस्तिष्क के लिए दिया जाना या वाहनों अपमानित हो सकता है। cationic लिपिड से स्विचिंग Palets anionic करने के लिए धीमी गति से प्रचलन समय या गिरावट को कम जब cationic लिपिड का उपयोग कर मदद कर सकता है।

RVG-9R पेप्टाइड सीएनएस कि निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स में शामिल है के भीतर किसी भी सेल को LSPCs और Palets transports। यह दोनों neuronal कोशिकाओं microglial कोशिकाओं और astrocytes 26 में शामिल हैं। Palets या LSPCs प्रिओन रोगों के लिए एक प्रभावी उपचार होने के लिए यह सब कोशिकाओं है कि प्रिओन रोगजनन के लिए योगदान को लक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। Neuronal कोशिकाओं सबसे PrP सी होते 27,28 भर प्रायन के प्रसार में योगदान करने के लिए मदद करते हैं। Neuronal कोशिकाओं लक्ष्य निर्धारण और 'कोशिकाओं PrP सी अभिव्यक्ति को कम करने प्रिओन रोगजनन की कमी हो सकती थी। हालांकि, neuronal कोशिकाओं केवल सेल प्रकार है कि प्रिओन रोग के लिए योगदान नहीं कर रहे हैं। Astrocytes प्रायन 29,30 की प्रतिकृति में फंसाया गया है। इसलिए, न केवल यह महत्वपूर्ण न्यूरोनल कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए, लेकिन यह भी astrocytes लक्षित करने प्रिओन रोगजनन कम करना है।

वितरण प्रणाली यहाँ वर्णित विभिन्न अनुकूलन रणनीति है कि उन्हें बीमारी आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त बनाने के लिए होगा के लिए उत्तरदायी हैं। LSPCs और Palets सीएनएस में ही नहीं, siRNA, जो वाहनों संभावित सिर्फ neurodegenerative रोगों से भी अधिक का इलाज करने के लिए देता है के लिए किसी भी छोटे अणु दवा ले जाने में सक्षम हैं। Palets और LSPCs को प्रभावित करता है कि किसी भी बीमारी के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैमस्तिष्क वाहनों में लोड छोटे अणु दवा पर निर्भर करता है। इसके अलावा, लक्षित कर पेप्टाइड बदलते वितरण वाहनों acetylcholine रिसेप्टर्स है कि किसी भी सेल के बजाय, सीएनएस के भीतर कोशिकाओं की एक विशिष्ट सबसेट के लिए छोटे अणु दवाओं देने के लिए अनुमति दे सकता है। Palets और LSPCs रोगों कि सीएनएस को प्रभावित कर इलाज के लिए छोटे अणु दवाओं के लिए एक उपन्यास, अधिक कुशल और लचीला वितरण प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOTAP lipid Avanti Lipids 890890
Cholesterol Avanti Lipids 700000
DSPE Avanti Lipids 850715
DSPE-PEG Avanti Lipids 880125
Chloroform Fisher Scientific AC268320010
Methanol EMD Millipore 113351
N2 Gas AirGas
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Extruder Avanti Lipids 610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filters Avanti Lipids 610010, 610007, 610006
PBS Life Technologies 70011-044
Protamine sulfate Fisher Scientific ICN10275205
EDC Thermo Scientific 22980 Aliquoted for single use
Sulfo-NHS Thermo Scientific 24510 Aliquoted for single use
40 μm Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block BD Pharmigen 553141
Anti-PrP antibody (PRC5) Proprietary - PRC

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References

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सीएनएस को चिकित्सीय siRNA की डिलिवरी cationic और Anionic Liposomes का प्रयोग
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Bender, H. R., Kane, S., Zabel, M.… More

Bender, H. R., Kane, S., Zabel, M. D. Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes. J. Vis. Exp. (113), e54106, doi:10.3791/54106 (2016).

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