Introduction
I prioni sono gravi malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale. Le malattie da prioni risultano dalla misfolding della normale proteina prionica cellulare, PrP C, con un isomero infettiva chiamata PrP Res. Queste malattie colpiscono una grande varietà di specie, tra cui encefalopatia spongiforme bovina nelle vacche, la scrapie degli ovini, malattia del dimagrimento cronico nei cervidi, e la malattia di Creutzfeldt-Jakob nell'uomo 1-3. I prioni causano neurodegenerazione che inizia con la perdita sinaptica, e progredisce a vacuolizzazione, gliosi, perdita neuronale, e depositi di placca. Alla fine, con la conseguente morte dell'animale / individuale 4. Per decenni, i ricercatori hanno studiato i composti destinati a rallentare o arrestare la progressione della malattia da prioni. Tuttavia, i ricercatori non hanno trovato né una terapia di successo o un efficace veicolo di consegna sistemica.
Endogena espressione PrP C è necessario per lo sviluppo di malattie da prioni 5 C può provocare un ritardo o miglioramento della malattia. Diversi gruppi creati topi transgenici con ridotti livelli di PrP C o lentivectors iniettati esprimono shRNA direttamente nel tessuto cerebrale murino per studiare il ruolo dei livelli di espressione PrP C nelle malattie da prioni. Questi ricercatori hanno scoperto riducendo la quantità di neuroni PrP C provocato arrestare la progressiva neuropatologia delle malattie da prioni e esteso la vita degli animali 6-9. Ci hanno riferito che i risultati del trattamento PrP C siRNA a distanza di PrP Res nelle cellule di topo neuroblastoma 10. Questi studi suggeriscono che l'uso di terapie per diminuire i livelli di espressione PrP C, come small interfering RNA (siRNA), che scinde mRNA, può sufficientemente ritardare la progressione delle malattie da prioni. Tuttavia, la maggior parte delle terapie indagati per malattie da prioni sono stati consegnati in un modo che non sarebbe praticoin un ambiente clinico. Pertanto, una terapia siRNA bisogno di un sistema di erogazione sistemica, che viene trasportato via endovenosa e mirata al SNC.
Gli investigatori hanno studiato l'uso di liposomi come veicoli di consegna per i prodotti di terapia genica. lipidi cationici e anionici sono entrambi utilizzati nella formazione di liposomi. lipidi cationici sono più ampiamente usati di lipidi anionici perché la differenza di carica tra i lipidi cationici e il DNA / RNA permette di confezionamento efficiente. Un altro vantaggio di lipidi cationici è che attraversano la membrana cellulare più facilmente di altri lipidi 11-14. Tuttavia, lipidi cationici sono più immunogenico di lipidi anionici 13,14. Pertanto, i ricercatori hanno cominciato a spostarsi da utilizzare cationico per anionica lipidi nei liposomi. Prodotti per la terapia genica possono essere confezionati in modo efficiente nei liposomi anionici utilizzando la carica positiva solfato di protamina peptide, che condensa le molecole di DNA / RNA 15-19. Dal momento che Lipi anionicods sono meno immunizzanti lipidi cationici che possono avere un aumento dei tempi di circolazione, e possono essere più tollerati in modelli animali 13,14. I liposomi sono mirati a specifici tessuti utilizzando il targeting peptidi che sono attaccati ai liposomi. Il neuropeptide RVG-9r, che si lega ai recettori nicotinici, è stato utilizzato per indirizzare siRNA e liposomi al SNC 17-20.
Questo rapporto delinea un protocollo per la produzione di tre veicoli di consegna siRNA, e di confezionare e consegnare il siRNA per le cellule neuronali (Figura 1). complessi liposoma-siRNA-peptide (LSPCs) sono costituiti da liposomi con siRNA e RVG-9r di targeting peptide elettrostaticamente attaccati alla superficie esterna del liposoma. Peptide indirizzata incapsulata in liposomi terapeutici siRNA (PALETS) sono composte da siRNA e protamina incapsulato all'interno della liposomi, con RVG-9r covalentemente legato a gruppi di lipidi PEG. Utilizzando i metodi indicati per generare LSPCs e PALETS, PrP C siRNA riduce espressione PrP C fino al 90% in cellule neuronali, che detiene tremenda promessa per curare o sostanzialmente ritardare l'insorgenza della patologia malattia da prioni.
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Protocol
Tutti i topi sono stati allevati e mantenuti in laboratorio le risorse animali, accreditati dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care International, secondo protocolli approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali presso la Colorado State University.
1. Preparazione di LSPCs
- Utilizzare un 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetilammonio-propano): rapporto di colesterolo per LSPCs. Per una preparazione nmole liposoma 4, mescolare 2 nmoli di DOTAP e 2 nmoli di colesterolo in 10 ml di una miscela 1: 1 di cloroformio: metanolo soluzione in un pallone.
- Far evaporare 9 ml di cloroformio: soluzione di metanolo con N 2 gas in una cappa aspirante. Evaporare ultimi 1 ml di solvente in una cappa aspirante notte senza gas. Osservare un sottile film lipidico sul fondo del pallone.
- Calore 10 ml di una soluzione di saccarosio al 10% a 55 ° C.
- Versare la soluzione di saccarosio al 10% riscaldato sul sottile film lipidico lentamente, vale a dire 1 ml / min, mentre la gente roteare il pallone. Mantenere il saccarosio 10% e pallone con lipidi a 55 ° C in modo che le molecole lipidiche rimangono nella fase gel-liquido. risultati di reidratazione in vescicole (MLV) formazione multilamellare.
- Consentire lipidi reidratare a 55 ° C per almeno un ora prima dimensionamento dei liposomi.
- Assemblare un estrusore secondo le istruzioni del produttore con 1,0 micron filtri o utilizzare filtri per siringa 1,0 micron per il dimensionamento.
- Aggiungere 1 ml della sospensione di liposomi riscaldato a una delle siringhe sul estrusore, e passare la sospensione tra le due siringhe 11 volte. Assicurarsi che la sospensione è nella siringa opposta rispetto alla siringa di partenza dopo le 11 passate.
- Dimensione liposomi nuovo attraverso 0,45 micron poi 0,2 micron filtri per generare grandi vescicole unilamellari (luvs). Mantenere la sospensione di liposomi riscaldato per facilitare dimensionamento.
- Incubare 20 microlitri della sospensione di liposomi 4 nmole (200 mM) con 200 ml di a 20 pM (4totale nmole) soluzione di riserva siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare 80 microlitri di una 500 micron (40 nmole totale) stock soluzione RVG-9r con la soluzione / liposomi siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente. LSPCs devono essere utilizzati al più presto possibile, ma possono essere utilizzati fino a diverse ore dopo la preparazione. LSPCs Conservare a 4 ° C per diverse ore dopo la preparazione.
2. Preparazione di PALETS
- Utilizzare un 55: rapporto di 5 molare di entrambi DSPE (1,2-distearoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterolo: DSPE-PEG o DOTAP: colesterolo: DSPE-PEG per PALETS. Per una preparazione nmole liposoma 4, mescolare 2,2 nmoli di entrambi DSPE o DOTAP, 1,6 nmoli di colesterolo, e 0,2 nmoli di DSPE-PEG in 10 ml di 2: 1 di cloroformio: metanolo soluzione in un pallone.
- Preparare sospensione di liposomi esattamente come descritto al punto 1.1 e 1.2 di cui sopra. Reidratare liposomi DSPE in 10 ml di PBS 1x riscaldata a 75 ° C, aggiungendo 1 ml / min. Consentire lipidi per reidratare a 75 ° C peralmeno 1 ora prima del dimensionamento.
- Dimensioni della sospensione di liposomi esattamente come descritto al punto 1,6-1,8.
- Dispensare 20 l di ciascuno dei 4 nmole (200 micron) sospensioni di liposomi in singole aliquote usare dopo DOTAP e DSPE liposomi sono stati di dimensioni, e liofilizzare per 30 minuti utilizzando un essiccatore da banco congelamento (Figura 2).
- Incubare 200 ml di a 20 micron (4 in totale nmole) stock soluzione siRNA con 1,4 ml di una soluzione 26,6 micron di solfato di protamina per 10 minuti a temperatura ambiente per siRNA che deve essere incapsulata nei liposomi DSPE pallets.
- Reidratare il liposomi DOTAP Palets con 200 ml di una soluzione madre nmole 4 di siRNA o reidratare liposomi DSPE pallets con 201,4 ml di soluzione / protamina siRNA. Incubare liposomi soluzione / siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 10 ml di una soluzione 60 mM-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) al / soluzione siRNA liposomi sia per DOTAP e DSPE PALETS.
- Aggiungere 10 ml di una soluzione 150 mM N-hydroxysulfosuccinimide (solfo-NHS) alla / soluzione siRNA liposomi sia per DOTAP e DSPE PALETS.
- Incubare la EDC e solfo-NHS con la sospensione / liposomi siRNA per 2 ore a temperatura ambiente.
- Incubare 80 microlitri di una 500 micron (40 nmole totale) stock soluzione RVG-9r con il siRNA / liposomi reticolazione soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: L'EDC / solfo-NHS permette al RVG-9r al legame covalente ai lipidi PEG. Utilizzare PALETS all'interno di diverse ore dopo la preparazione. PALETS Conservare a 4 ° C per diverse ore dopo la preparazione. - Per determinare siRNA efficienza di incapsulamento di PALETS:
- Misurare la concentrazione di siRNA prima e dopo l'aggiunta di protamina e liposomi utilizzando uno spettrofotometro regolato a 260 nm.
- Filtrare il non incapsulata siRNA dal liposomi / sospensione siRNA incapsulato con 50 kDa filtri centrifughe. Centrifugare a 1000 xg per 20 min.
- Misurare la concentrazione disiRNA non incapsulata nel filtrato e la concentrazione dei incapsulato siRNA nel retentato utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm.
3. L'iniezione di topi con LSPCs o PALETS
- Esporre i topi per 5-10 minuti ad una lampada di calore per dilatare vascolare.
- Anestetizzare mouse con un isofluorano / ossigeno 2-3% fluire 5-10 minuti prima dell'iniezione, e durante l'iniezione. Confermare anestesia quando animale non è più ambulatoriale e respirazioni hanno rallentato facendo un pizzico dito del piede. Posizionare il mouse sulla sua schiena o di lato per accedere alla vena della coda. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi del topo per evitare l'essiccazione mentre sotto anestesia.
- Pulire / spruzzare la coda con il 70% EtOH e iniettare 300 ml di LSPCs o PALETS sulla vena della coda del mouse utilizzando una siringa da 26 G di insulina. Inizia iniettando distalmente nella vena della coda e spostare prossimale se la vena collassa o rotture.
- Posizionare il mouse in una gabbia pulita fino mantiene decubito sternale. Non posizionare moutilizzare con altri compagni di gabbia fino a quando non ha pienamente recuperato. I topi dovrebbero recuperare in 5 a 15 min. Essi possono essere collocati su una piastra elettrica o sotto una lampada di calore per mantenere la temperatura corporea se il recupero richiede più tempo. I topi devono essere monitorati attentamente per salvaguardare contro il surriscaldamento.
- Monitorare le diverse ore dopo l'iniezione di animali al fine di garantire l'anestesia svanisce, e non ci sono effetti negativi del trattamento. Lasciare le LSPCs o PALETS di circolare per almeno 24 ore.
4. Analisi dell'espressione proteica tramite citometria a flusso
- Euthanize topi con una portata di 20% di CO 2 per 15 min.
- Sezionare la metà un emisfero del cervello, tagliando via la pelle e il cranio del mouse con le forbici. Peel via metà un emisfero cerebrale distanza dal cranio con pinze o la fine di un paio di forbici.
- Press mezzo emisfero del cervello di ogni mouse attraverso un colino 40 micron cella mesh con 2,5 ml di tampone FACS (1x, PBS, 1% di siero fetale bovino, 10 mM EDTA) in una capsula di Petri con lo stantuffo di una siringa.
- Risciacquare il filtro cellulare e piastra di Petri con un ulteriore 2,5 ml di tampone FACS. Mettere la sospensione singola cellula in una provetta conica da 15 ml su ghiaccio.
- Pipettare 100 ml di sospensione di cellule singole 5 ml in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare per 5 min a 350 x g. Eliminare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 1 ml di tampone FACS. Spin a 350 g per 5 min. Ripetere con un altro 1 ml di tampone FACS. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
- Incubare le cellule in 100 microlitri di diluizione 1: 100 di 0,5 mg / ml di ratto blocco anti-topo Fc in tampone FACS per 30-60 min in ghiaccio. Pellet e lavare le cellule come al punto 4.5. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
- Incubare le cellule in 100 microlitri di una / anticorpo 20 mg ml fluorescente contro topo PrP C in 7% siero di topo in tampone FACS in ghiaccio per 30-60 min. Pellet e lavare le cellule come al punto 4.5. Mantenere la sospensione cellularesul ghiaccio.
- Pellet e risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi RBC (1x PBS, 155 mm NH 4 Cl, 12 mm NaHCO 3, 0.1 mM EDTA) per 1 min. Pellet come al punto 4.5 e risospendere le cellule in 1 ml di tampone FACS. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
- Analizzare l'espressione PrP C utilizzando un citofluorimetro come descritto in precedenza 10. Porta di vivere le cellule dalla popolazione cellulare totale. Porta PrP C + cellule dalla popolazione di cellule in diretta per determinare MFI (intensità di fluorescenza mediana).
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Representative Results
Per aumentare l'efficienza di siRNA incapsulamento all'interno PALETS anionici, il siRNA è stato mescolato con protamina. Per determinare la migliore concentrazione protamina per la siRNA, il siRNA è stato mescolato con diverse concentrazioni di protamina, da 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). C'era una efficienza di incapsulamento siRNA 60-65% in liposomi anionici senza l'uso di protamina. I campioni con protamina: siRNA rapporti molari da 1: 1 a 1,5: 1 (133-266 nM) avevano 80-90% siRNA incapsulamento. rapporti molari superiori a 1,5: 1 provocato precipitazione di siRNA complessi / protamina. Questi complessi precipitate non sono state incapsulate in liposomi anionici. Dopo l'aggiunta di protamina alla siRNA c'era una leggera diminuzione della concentrazione del siRNA, causa della diluizione; Tuttavia, la concentrazione è rimasta stabile dopo l'aggiunta di protamina (Figura 3B). Dopo aver filtrato i liposomi con 50 filtri kDa, il 90-95% del siRNAè stato associato con il retentato liposomi, mentre il 5-10% del siRNA è 'libero' nel filtrato. No siRNA è stata rilevata nel protamina o liposomi solo i campioni (Figura 3C).
Per determinare l'effetto di LSPCs in vivo, topi di tipo selvatico sono stati trattati con LSPCs per 24 hr. PrP C livelli di espressione di tipo selvatico topo trattati con LSPCs sono stati confrontati con topi trattati con PBS 1x e knockout PrP (PrP KO) topi (Figura 4). Flusso citometria di PrP C nel cervello dei topi trattati con LSPCs ha mostrato una diminuzione dei livelli di PrP C (Figura 4A e 4B). In un esperimento, tutti i topi avevano riduzione del 80-90% dei livelli di PrP C, vicino ai livelli di PrP C che sono stati osservati nei topi PrP KO (figura 4A). I topi trattati con LSPCs in due esperimenti indipendenti più mostrato una riduzione 40-80% di PrP C </ sup> livelli (Figura 4B). Su un totale LSPCs topi trattati (n = 14), c'era solo un mouse non ha avuto risposta alle LSPCs.
Figura 1:. Panoramica del protocollo per generare pallets / LSPCs and Deliver siRNA per via endovenosa al sistema nervoso centrale di topi I liposomi sono stati generati tramite il metodo di idratazione film lipidico sottile. La PrP C siRNA stato poi attaccato ai liposomi sia attraverso una interazione elettrostatica o incapsulamento. I PALETS o LSPCs sono stati completati con l'aggiunta del sistema nervoso centrale mira peptide RVG-9r. Dopo il montaggio, i PALETS / LSPCs sono state iniettate nelle vene coda di topi, e 24 ore dopo il trattamento PrP C espressione è stata valutata mediante citometria a flusso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Protocollo del lipide Thin Film idratazione metodo per generare DSPE liposomi per la consegna PALETS Veicolo I lipidi sono stati sciolti e mescolati in un cloroformio. Soluzione metanolica, che è stata evaporata a generare un film lipidico secca. Il film lipidico secco è stato risospeso in PBS 1x per creare vescicole multilamellari (MLV). MLV sono stati poi uniformemente dimensionata utilizzando un estrusore per generare luvs. I luvs possono quindi essere utilizzati in sospensione, o liofilizzato in singole aliquote d'uso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: incapsulamento efficienza di siRNA in DSPE PALETS u sing solfato di protamina. (A) Circa 60-65% del siRNA stato incapsulato senza aggiunta di protamina. Con l'aggiunta di protamina, c'era una efficienza di incapsulamento 90% tra 1: 1 e 1,5: 1 protamina: rapporto siRNA. (B) Dopo filtrando i liposomi da qualsiasi siRNA libero il 90% del siRNA è stato trovato nella frazione liposomiale, considerando che il 5-10% di siRNA unencapsulated stato trovato nel filtrato. (C) di protamina e liposomi solo soluzioni sono privi di incapsulato siRNA. Circa 60-65% di siRNA è incapsulato all'interno di liposomi DSPE senza l'uso di protamina. Con l'uso di protamina ad una concentrazione di 186,2 nM, circa il 90% del siRNA stato incapsulato nei liposomi DSPE. Le barre di errore indicano SEM. **** Indica P <0,0001. * Indica P <0,01. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Rappresentante citometria a flusso Analisi del cervello cellule Sospensioni 24 ore dopo il trattamento con LSPCs LSPCs sono state iniettate nelle vene coda di topi di tipo selvatico e il cervello sono state raccolte 24 ore più tardi. PBS è stato utilizzato come controllo trattamento e un mouse PrP KO è stato usato come controllo per i livelli PrP C. (A) topi trattati con LSPCs hanno mostrato una significativa diminuzione dei livelli di PrP C rispetto al controllo PBS, che mostra di tipo selvatico livelli di PrP C. I LSPCs topi trattati hanno mostrato livelli di PrP C vicino a quello di un topo PrP KO. (B) i dati cumulativi dal tre esperimenti indipendenti che utilizzano lo stesso protocollo di trattamento hr 24 hanno mostrato la quantità relativa di PrP C in PBS tipo selvatico e LSPCs topi trattati. Attraverso i tre esperimenti, i topi trattati con LSPCs shosposare diminuzioni significative dei livelli di PrP C rispetto ai controlli di tipo selvatico PBS. Le barre di errore indicano SEM. *** Indica P <0.0003. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo rapporto descrive un protocollo per creare due sistemi di somministrazione mirata che trasporta in modo efficiente siRNA al sistema nervoso centrale. Precedenti metodi di somministrazione siRNA al SNC inclusi l'iniezione di vettori siRNA / shRNA direttamente nel cervello, iniezione endovenosa di mirati siRNA, o iniezione endovenosa di complessi liposomi-siRNA non mirati. L'iniezione di siRNA / shRNA vettori nel sistema nervoso centrale non provoca una diminuzione dei livelli di espressione della proteina bersaglio. Tuttavia, il siRNA / shRNA non diffonde liberamente attraverso il CNS. Inoltre, queste iniezioni provocare danni alla adiacente 6-9 tessuto nervoso. L'iniezione endovenosa di siRNA mirati comporta anche la riduzione della proteina bersaglio. Tuttavia, la maggior parte del siRNA è degradata con proteine del siero 20. Infine, l'iniezione endovenosa di non mirati liposomi-siRNA complessi comporta l'intrappolamento del siRNA all'interno del fegato e la degradazione da parte del sistema reticoloendoteliale 21. La consegna di siRNAveicoli di cui sopra, LSPCs e paletti, forniscono un sistema di consegna più sicura, più efficace ed efficiente rispetto ai metodi precedenti, fornendo siRNA direttamente al sistema nervoso centrale. I LSPCs ei PALETS sono anche in grado di trasportare altri farmaci piccola molecola al SNC.
PALETS o LSPCs devono essere utilizzati entro poche ore dopo il montaggio. In caso contrario, c'è il rischio di siRNA diventare non funzionali / degradata. L'altro punto fondamentale che non può essere fermato / interrotta è la preparazione e la gestione della sospensione cellulare per citometria a flusso. È importante eseguire citofluorimetria lo stesso giorno che la sospensione cellulare viene preparato, in quanto la sospensione contiene cellule vive che devono essere vivo per l'analisi.
Ci sono alcuni passaggi all'interno del protocollo che può essere modificata a seconda che le LSPCs o PALETS saranno utilizzati in vitro o in vivo, su quale farmaco piccolo molecola è caricato nei LSPCs o PALETS, e sul lavoropreferenza Atory. In primo luogo, i rapporti molari dei lipidi delle LSPCs e paletti possono essere ottimizzati per altre applicazioni. Tuttavia, fosfatidiletanolammina (PE in DSPE) idrata male quando viene utilizzato in un peso / peso 60% o superiore. Quando viene utilizzato a queste concentrazioni più elevate, molecole DSPE saranno aggregare tra loro e formare una massa insolubile di lipidi. Questa massa di lipidi non è in grado di incapsulare siRNA. Se N 2 gas non è disponibile, la miscela lipidica può essere essiccato mediante evaporazione. L'evaporazione avviene circa 3 giorni, e dovrebbe essere eseguita in una cappa aspirante dovute all'uso di metanolo e cloroformio. In questo protocollo, il sottile film lipidico è stato risospeso con PBS 1x, ma può anche essere risospeso con altri buffer di idratazione. Altri tamponi includono acqua, 10% di saccarosio, o qualsiasi altro tampone acquoso. La scelta di tampone reidratazione dipende dalla destinazione d'uso dei liposomi e l'agente di essere incapsulato all'interno del liposoma 22,23. Il buffer idratazione dovrebbe essere mantenuto sopra il gel-liqtemperatura di transizione cristallo UID (Tc o Tm) dei lipidi o liposomi non reidratare correttamente. Nel protocollo descritto, i liposomi sono stati sospesi uniformemente dimensionati utilizzando un estrusore. Tuttavia, i liposomi possono essere dimensionati con filtri per siringa o sonicazione. Gli stessi filtri di dimensioni dei pori utilizzati per dell'estrusore possono essere utilizzati come filtri per siringa. Inoltre, la sospensione di liposomi può essere ridimensionato dopo idratazione con la soluzione siRNA. Tuttavia, abbiamo osservato una perdita di siRNA da liposomi quando dimensionato dall'estrusore dopo la fase di idratazione (dati non pubblicati).
Poiché il ruolo biologico della PrP C non è ancora compreso 5, è possibile che ci potrebbero essere alcuni effetti deleteri prodotti riducendo i livelli di PrP C. Tuttavia, a causa della proteina prionica topi deficienti sviluppano, comportarsi, e l'età normalmente 24, è probabile che questi effetti deleteri dovrebbero o essere minori o meno visibilmente apparente. Inoltre, siRNA atterramento di PrP <sup> espressione C non abolire del tutto l'espressione di proteine ed è completamente reversibile, senza possibilità di oncogenesi virale, a differenza lentivector RNAi 23.
Limitazioni con i sistemi di erogazione comprendono la riduzione assorbimento di PALETS anionici nelle membrane biologiche, e l'immunogenicità di LSPCs a causa dei lipidi cationici. Se si osserva immunogenicità dei LSPCs, PALETS possono essere utilizzati in alternativa. assorbimento ridotto di PALETS anionici nelle membrane biologiche anionici può essere superato utilizzando PALETS cationici, o riformulando PALETS anionici con una miscela di lipidi cationici e anionici.
In questo rapporto, la riduzione della PrPC varia ampiamente da mouse per il mouse. Questa variazione può essere dovuto a una serie di fattori: variazione tra topi, il piccolo diametro delle vene nei topi, o la degradazione di siRNA. L'uso di topi inbred dovrebbe eliminare gran parte della variabilità tra i topi, ma la variazione è sempre possibile anchecon i topi inbred. Inoltre, i topi hanno vene molto piccole rispetto ad altri modelli animali. Quindi, l'iniezione di un grande volume nelle vene di topi può essere problematico. Si consiglia di praticare iniezioni prima di tentare di iniettare PALETS o LSPCs. Tuttavia, anche con la pratica, a volte ci vuole ancora un paio di iniezioni per ottenere tutto il volume di Palets / LSPCs nel mouse, e la vena può crollare in uno qualsiasi di questi iniezioni. Quindi, un mouse potrebbe ricevere tutte le quantità di pallets / LSPCs, mentre un altro mouse potrebbe ricevere solo il 75-90% del volume di pallets / LSPCs.
Altre possibili fonti di variazione includono tempo di circolazione e il degrado del siRNA per le proteine del siero. I pallets / LSPCS potrebbero circolare lungo prima di raggiungere il cervello in un topo rispetto ad un altro, il che potrebbe spiegare la variazione. Abbiamo solo permesso LSPCs di circolare per 24 ore prima di eutanasia topi nell'esperimento sopra. Se il tempo di circolazione sta causando la variazione, quindi aumentando il circultempo zione al di là di 24 ore dovrebbe ridurre qualche variazione. Anche se abbiamo pacchetto del siRNA con i pallets / LSPCs, c'è sempre la possibilità di degradazione del siRNA e / o dei veicoli di consegna. Come accennato in precedenza, i lipidi cationici sono leggermente immunogenico. Quindi, se le cellule immunitarie all'interno del flusso sanguigno stanno attaccando i veicoli, allora sarebbe necessario più tempo per i veicoli da consegnare al cervello o dei veicoli potrebbe diventare degradato. Il passaggio da lipidi cationici ai tensioattivi anionici PALETS potrebbe contribuire a ridurre il tempo di circolazione lenta o degrado quando si utilizza lipidi cationici.
Il peptide RVG-9r trasporta le LSPCs e paletti a qualsiasi cella all'interno del sistema nervoso centrale che contiene recettori nicotinici. Questo include sia le cellule neuronali cellule della microglia e astrociti 26. Per PALETS o LSPCs ad essere un trattamento efficace per le malattie da prioni è importante per indirizzare tutte le cellule che contribuiscono alla patogenesi prione. Cellule neuronali contengono la più PrP C 27,28. Targeting cellule neuronali e riducendo l'espressione delle cellule PrP C potrebbe tradursi in una diminuzione del prione patogenesi. Tuttavia, le cellule neuronali non sono l'unico tipo di cellula che contribuisce alla malattia da prioni. Gli astrociti sono stati implicati nella replicazione dei prioni 29,30. Quindi, non solo è importante per indirizzare le cellule neuronali, ma anche per indirizzare astrociti per ridurre prione patogenesi.
I sistemi di consegna qui descritti sono suscettibili di diverse strategie di ottimizzazione che li rendono adatti per una vasta gamma di applicazioni di malattia. LSPCs e paletti sono in grado di trasportare qualsiasi piccola molecola di droga al sistema nervoso centrale, non solo siRNA, che dà i veicoli la possibilità di trattare più di malattie neurodegenerative solo. PALETS e LSPCs potrebbero essere utilizzati per il trattamento di qualsiasi malattia che colpiscecervello seconda del farmaco piccolo molecole caricate nei veicoli. Inoltre, la modifica del peptide mira potrebbe consentire ai veicoli di consegna per fornire farmaci piccola molecola ad uno specifico sottoinsieme di cellule all'interno del sistema nervoso centrale, al posto di una cella che ha recettori dell'acetilcolina. PALETS e LSPCs rappresentano un romanzo, sistema di consegna più efficiente e flessibile per i farmaci piccola molecola per il trattamento di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
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- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
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