Introduction
Beenmerg is een belangrijk orgaan betrokken bij hematopoiese en immuun regelgeving. Het bestaat uit een bestanddeel dat hematopoietische stamcellen en hematopoietische progenitorcellen (HSPCs) en een stromale component met niet-hematopoietische stamcellen die aanleiding geven tot mesenchymale cellen 1. Tweederde van hematopoietische activiteit is gewijd aan het genereren van myeloïde cellen 2. Vooral een groot aantal neutrofielen geproduceerd in het beenmerg, met 1-2 x 10 11 cellen per dag gegenereerd in een normaal volwassen mens 2. Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie tegen microbiële infecties en zijn meestal gereserveerd in het beenmerg tot stress-triggers hun mobilisatie van perifere neutrofielen 1,3 vullen. Naast hun antimicrobiële effecten, suggereren recente studies een belangrijke rol van neutrofielen in kankerbiologie heeft zowel pro- als anti-tumorigene fenotype afhankelijk transforming growthfactor beta (TGF-β) signalering in de tumor micro 4,5. Bovendien hebben onderzoeken aangetoond dat neutrofielen die accumuleren in primaire tumoren uitoefenen pro-tumorigene en metastatische effect van onderdrukken van de cytotoxische functie van T-cellen 6,7, terwijl neutrofielen in omloop oefenen een cytotoxische anti-metastatisch effect 8. Als zodanig onderzoek hematopoietische cellen in het beenmerg, met name neutrofielen, is cruciaal voor het ophelderen van hun rol bij immuun en tumor regelgeving.
Histopathologie en volledig perifeer bloedbeeld worden routinematig gebruikt om cellulaire en structurele veranderingen in het beenmerg 9 evalueren. Echter, deze methoden leveren alleen statische informatie van verschillende celpopulaties of weefsel microstructuren. Longitudinale in vivo beeldvorming kan worden gebruikt in combinatie met standaardmethoden om de dynamiek van meerdere cellulaire en vasculaire stromale componenten en beoordeelt cel-Cell interacties in een longitudinale wijze. Intravitale microscopie (IVM), gedefinieerd als beeldvorming van levende dieren bij microscopische resolutie van 10, is met name handig voor de beoordeling van dynamische cellulaire processen in de tijd in hetzelfde monster, vermindering van het aantal proefdieren nodig. IVM wordt vaak gecombineerd met een chronisch getransplanteerde venster kamer (WC) om het betreffende orgaan voor beeldvorming over een periode van weken tot maanden. Cranial en dorsale-huidplooi WC-modellen hebben de langste geschiedenis van gebruik teruggaat tot het midden van de jaren 1990. Meer recent zijn andere orgaanspecifieke WC modellen zoals die van de uiervet pad en verschillende buikorganen ontwikkeld 11.
De typische aanpak voor het afbeelden van het beenmerg in vivo heeft voornamelijk bezig blootstelling van het schedeldak van muizen, waarbij de verdunde bot maakt directe visualisatie van afzonderlijke cellen met een minimale chirurgische ingreep 12-14. Echter de calvarial beenmerg be verschillend van die van andere botten, zoals de lange botten, hetgeen blijkt uit een lager aantal HSPCs en hypoxische cellen calvaria, aanduidt, minder onderhoud en de ontwikkeling van HSPCs 15. Daarom zijn alternatieve werkwijzen om de cellulaire componenten in het pijpbeen onderzocht. Deze omvatten directe blootstelling van de femorale beenmerg 16 en buitenbaarmoederlijke transplantatie van split dijbeen in de dorsale huidplooi WC 17. De eerste is een terminal procedure die niet volgen van cellulaire structurele en functionele veranderingen toelaat gedurende langere perioden, en deze waarschijnlijk verstoort normale beenmergfunctie door de transplantatie van dijbeen een ectopische plaats in het dorsale huidplooi WC. Een andere methode die orthotope seriële beeldvorming van femorale beenmerg maakt de tijd is het gebruik van een toilet in het dijbeen. Een vorige verslag aangetoond op lange termijn beeldvorming van de microcirculatie in het dijbeen beenmerg met behulp van eenfemur WC in muizen 18. Bovendien, de auteurs aangetoond visualisatie van tumorcellen in het dijbeen met vermelding van de bruikbaarheid in controle beenmerg metastase. Dit was echter WC ontwerp beperkt door zijn grote omvang (1,2 cm diameter) en relatief kleine opnamegebied (4 mm diameter), die alleen voor grote muizen (26-34 g, 3-6 maanden oud) werd aldus het benadering onpraktisch voor routinegebruik.
Derhalve een nieuw toilet met een kleinere totale afmeting en grotere binnendiameter opnamegebied is ontworpen voor het doel van deze studie. Het doel van deze studie was om een werkwijze voor het afbeelden van verschillende celtypes in de femorale beenmerg verschaffen. Het dijbeen WC model werd in eigen huis ontwikkeld en werd gebruikt om neutrofielen te visualiseren en te volgen binnen het 3D-vasculaire netwerk. Met behulp van dit model, kan IVM van het beenmerg in serie worden uitgevoerd over 40 dagen. Deze benadering kan worden toegepast op verschillende gebieden voor het ophelderen van de processen van hematopoiese, immuunregulatie eennd de ontwikkeling van tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in het kader van het protocol # 2615 door de Universiteit Health Network Institutional Animal Care en gebruik Comite uitgevoerd.
1. Chirurgische Voorbereiding van de muis
- Voor de ingreep steriliseren alle chirurgische instrumenten en het raam kamer (WC) autoclaaf. Vul het drinkwater bij 50 mg / kg lichaamsgewicht van amoxicilline 2 dagen voor de operatie. Injecteer de muis met 0,1 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneaal buprenorfine 4 uur voorafgaand aan de operatie.
- Verdoven de athymische naakt muis door intraperitoneale injectie van 350-400 pi zoutoplossing die 80 mg / kg ketamine en 13 mg / kg xylazine (Let op: Dit werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care Committee, en er is geen ervaring met nadelige gevolgen heeft gehad ). Bevestig de juiste verdoving door het testen voor voetreflex. Blijven observeren voor ademhalingspatroon, slijmvliezen kleur en voetreflex tijdens de procedure.
- Voer de chirurgische procedures onder een bioveiligheid kast om steriele omstandigheden tijdens de operatie te handhaven. Plaats de muis in een elektrisch verwarmingselement bedekt met een chirurgische doek om lichaamstemperatuur te handhaven tijdens de operatie. Voer alle chirurgische procedures onder de stereomicroscoop.
- Toepassing oogzalf om de ogen vochtig te houden tijdens de operatie. Herhaal dit indien nodig tijdens de chirurgische ingreep. Steriliseer het werkgebied van de muis schoon met 7,5% povidonjood, 70% isopropylalcohol en 10% povidonjood na elkaar, en twee keer herhaal deze procedure.
- Maak een 10 mm longitudinale incisie in de huid met behulp van scalpel met een mes (# 15), het naderen van het dijbeen van de zijkant. Expose het dijbeen tussen de flexor en extensor spieren door stompe dissectie behulp van een tang en hemostats spieren functionaliteit te verzekeren.
- Plaats de U-vormige balk onder het bot, en installeer de wc (figuur 1). Zet de bar met het raam met behulp van twee bouten en draai de moeren vooreekhoorntjesbrood. Vult de ruimte tussen het bot en de WC met tandheelkundig cement.
- Afslijpen het corticale bot in een 6 x 2 mm 2 gebied met een micro-boor optische toegang tot de mergholte krijgen.
Opmerking: Inspecteer zorgvuldig dunner worden van het corticale bot onder de microscoop tijdens het uitvoeren van deze procedure. Laat een intact, bijna doorzichtige periostale laag van het bot. - Plaats de 8 mm dekglaasje op het raam, en zet de dekglaasje met een borgring op zijn plaats te houden.
- Stel de spieren van de flexoren en extensoren terug naar hun oorspronkelijke locaties met behulp van een tang om hun functie te behouden na de operatie. Hecht de dermis met behulp van 5-0 hechtdraad en een naald houder.
- Monitor de muis voor het herstel, totdat hij bij bewustzijn is en in staat is om vrij te bewegen. Zet het dier in een nieuwe kooi wanneer teruggewonnen.
- Na herstel, uit te voeren beeld acquisitie op het dier op dezelfde dag of de volgende dagen (zie punt 2). Bewaken van de fysisccal staat van de muis per dag.
Opmerking: Monitor fysieke omstandigheden, zoals gewicht dragen op lidmaat, hunching, snelle en oppervlakkige ademhaling, achterste ledematen zwelling, zelfverminking, cellulitis en ernstige dermatitis. - Geven intraperitoneale injectie van 0,1 mg / kg lichaamsgewicht van buprenorfine gedurende 3 dagen, en 1 mg / kg lichaamsgewicht van meloxicam gedurende 5 dagen na de operatie voor de behandeling van postoperatieve pijn en ontsteking. Ga door het verstrekken van de-amoxicilline aangevuld water gedurende 5 dagen.
- Bij de experimentele eindpunt, euthanaseren het dier door CO 2 narcose, gevolgd door een secundaire methode (bijvoorbeeld, cervicale dislocatie).
2. Image Acquisition gebruik van Gecombineerd Multi-foton en confocale microscopie
- Voorafgaand aan beeldvorming verdoven de muis door intraperitoneale injectie van een 350-400 pi zoutoplossing die 80 mg / kg ketamine en 13 mg / kg xylazine. U kunt ook gebruik maken van inhaleerbare verdoving, indien beschikbaar.Solliciteer oogzalf.
- Injecteer het mengsel van intravasculaire kleurstoffen voor etikettering vasculatuur (0,65 mg 2 MDa fluoresceïne (FITC) -dextran) en neutrofielen (4 ug Allophycocyanine (APC) -anti-antilichaam Ly6G).
- Gebruik een rechtopstaande gecombineerd multifotonmicroscopie en confocale microscoop uitgerust met een multi-foton laser bereik 705-980 nm twee-foton excitatie, en enkel foton lasers die golflengten voorziet van blauw naar rood.
- Stel een op maat gemaakte imaging podium op de microscoop (Figuur 1B). Zet de muis op het podium door het klemmen van de twee uiteinden van de WC met alligator clips.
Let op: Kritische onderdelen van het podium zijn: twee krokodillenklemmen naar het toilet te houden, en een verwarmingselement tot fysiologische temperatuur (37 ° C) van de muis te behouden tijdens de beeldvorming. - Zet de twee-foton laser en de confocale systeem, en de lancering van het beeld acquisitie software door te klikken op "Start System". Een venster met 4 tabbladen (Locate,Acquisitie, verwerking en Maintain) zal openen.
- Stel de imaging-kanalen. Klik op "Smart Setup" onder het tabblad Verwerving en kies de kleurstoffen die gebruikt zal worden voor de beeldvorming: FITC (488 nm excitatie, 493-588 nm emissie) en APC (633 nm excitatie en 638-743 nm emissie). Kies "Best Signal" en klik op "Apply".
- Voeg de tweede harmonische generatie (SHG) beeldacquisitie kanaal handmatig. Zet de twee-foton laser onder het venster "Laser" in het tabblad Verwerving. Onder het raam Channels, klik op het "+" teken om een nummer toe te voegen.
- Stel de SHG spoor. Verander de golflengte van 840 nm onder Channels venster met behulp van de pijltjes omhoog en omlaag, en kies het detectiebereik tot 415-425 nm onder "lichtpad" venster met behulp van de schuifbalk zijn.
- Klik op "Oculars Online" onder het tabblad Locate. Klik FITC onder het filter plaatsen voor FITC naar de regio van belang te bekijken en de scherpstelling handmatig aanpassen door te draaien thij knop zich aan de zijkant van de microscoop. Wanneer de regio van belang ligt, klikt u op "Oculairs Offline" onder het tabblad Locate.
- Klik op het tabblad Verwerving. Selecteer FITC spoor onder Channels venster en klik op "Live" om een voorbeeld van het beeld van FITC-dextran met 5X doelstelling. Pas de scherpstelling, indien nodig, en klik op "Stop" het tabblad Acquisitie naar de voorvertoning te stoppen.
- Handmatig wenden tot 20x water doelstelling door het verplaatsen van een wiel boven de lenzen. Bekijk de afbeelding weer voor FITC-dextran met behulp van de 20X objectief, en pas Master Gain en Pinhole onder het raam Kanalen om een optimale signaal en contrast te bereiken. Herhaal dit voor andere kanalen door het selecteren van APC en SHG tracks onder het raam Channels.
- Kies de imaging parameters. Klik op "Acquisition Mode" om het venster te openen. Stel de framemaat te zijn 1024 x 1024 pixels, en middeling van 4X naar beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen.
- Het verwerven van een 2D-snapshot. Selecteer alle kanalen onder Kanalen winnendow en klik op "Snap" onder het tabblad Verwerving. De kwaliteit van het beeld en beeldparameters eventueel vervangen.
- 2D-afbeelding time-lapse te verwerven.
- Afvinken "Time Series" in het tabblad Overname om het venster Time Series openen. Typ 0 in het kader van de intervallen en 40 voor het totale aantal scans 40 beelden continu te nemen zonder tijdsinterval.
Let op: 40 scans genereert ongeveer 5 minuten lang-serie met een scansnelheid van 7,5 sec / frame en het beeldformaat van 600 pm x 600 pm. Stel het interval en het aantal scans, afhankelijk van de microscoop, beeldacquisitie instellingen en de framesnelheid van de camera. Een vaste intervaltijd (> 0 sec) kunnen worden gebruikt voor time-lapse beelden verkregen op verschillende tijdstippen te vergelijken. Een langere beeldvorming duur time-lapse kan, afhankelijk van de verwachte gemiddelde snelheid van neutrofielen (of andere cellen van belang) in de experimentele conditie vereist.
- Afvinken "Time Series" in het tabblad Overname om het venster Time Series openen. Typ 0 in het kader van de intervallen en 40 voor het totale aantal scans 40 beelden continu te nemen zonder tijdsinterval.
- Acquire 3D-beeld.
- Afvinken "Z-Stack" op het tabblad Acquisitie naar de Z-Stack venster te openen. Start de "Live" preview-modus voor FITC-dextran. Focus op de top van het monster en klik op "Set First", en zich richten op het andere uiteinde van het monster en klik op "Set Last" in de Z-stack venster.
- Stel het interval tot 10 urn onder de Z-stack raam. Afhankelijk van de eerste en de laatste optische segment geselecteerd in de vorige stap, zal dit 10-20 plakjes genereren, met totale optische dikte van 90-180 urn.
Opmerking: De z-stack interval afhankelijk van de grootte van de pinhole, waarbij de dikte van de optische segment bepaalt. Stel het interval tot minder dan de dikte van de optische segment zijn. - Klik op "Start Experiment" onder het tabblad Overname om te beginnen met het verzamelen van foto's.
- beeld 3D time-lapse te verwerven.
- Afvinken "Time Series" en "Z-stack" in het tabblad Acquisitie naar de Time-serie te openenen de Z-stack ramen.
- Stel de tijdreeksen en Z-stack acquisitie parameters zoals beschreven in stap 2.14 en 2.15. Klik op "Start Experiment" onder het tabblad Overname om te beginnen met het verzamelen van foto's.
- Bewaken van de muis tijdens beeldvorming om ervoor te zorgen dat het stabiel is en onbewust. Als de muis is instabiel en / of bewuste tijdens beeldvorming, verwijder de muis van het podium, injecteer extra 100-150 ul van het anestheticum intraperitoneaal en verder imaging.
Opmerking: tekenen van instabiliteit zijn een snelle ademhaling en beweging van de muis, die kan worden beschouwd als een verschuiving in artefacten verkregen beelden. - Na beeldacquisitie, neemt u de muis van het podium af en terug te sturen naar de kooi. Gebruik een warmtelamp om het warm te houden, en het toezicht op de muis totdat het bewuste.
3. beeldanalyse en kwantificering
- Gebruik beeldanalyse software om de 3D en tijdreeksen gegevens te analyseren. Open de software enfoto's toe te voegen door ze in de open scherm, dat "Arena" view heet slepen. Dubbelklik op een beeldbestand om het te openen; het beeld zal worden geopend in het kader van "Overtref" view.
- Maak een 2D / 3D-beeld.
- Vanaf het "Meer" bar te vinden op de rechter bovenhoek, klik op "Bewerken / Show Display Aanpassing" om het venster 'Display Adjustment "te openen. Optimaliseren van de fluorescentie-display door aanpassing van de drempels voor elk kanaal, en neem een momentopname om het beeld op te slaan.
- Genereer object sporen met behulp van time-lapse beelden.
- Open het beeld te analyseren onder "Overtref" view. Klik op het icoon met een afbeelding van oranje stippen, gevonden onder de "Surpass" icoon. Dit opent een nieuw venster "Spots" te openen.
- Afvinken "Track vlekken (tijd)" en klik op de blauwe pijl om naar de volgende stap. Selecteer het kanaal met de voorwerpen op te sporen onder "Bron Channel", en stel de geschatte object Diameter onder "Geschatte XY Diameter" door het intypen van een getal in. Klik op de blauwe pijl om naar de volgende stap.
Opmerking: Voor neutrofielen tracking, selecteert u het kanaal met APC fluorescentie voor neutrofielen en zet het object met een diameter tot 12 micrometer gebaseerd op de bekende omvang van neutrofielen. - In het venster, vinden en selecteren "Quality" filter door te klikken op het pijltje naar beneden. Let op de plekken die door de software en de drempel handmatig aan te passen op te nemen of uit te sluiten vlekken. Zodra drempel is gedefinieerd, klikt u op de blauwe pijl om naar de "Tracking" stap.
- Onder algoritme, vinden en selecteren "Autoregressieve Motion Algorithm" door te klikken op het pijltje naar beneden. Typ 10 micrometer voor "Max Distance" en 3 voor "Max Gap Size" te vinden onder Parameters. Afvinken "Vul gaten met alle gedetecteerde objecten 'te beginnen met het bijhouden, en klik op de blauwe pijl om naar de volgende stap.
Opmerking: "Autoregressieve beweging algoritme" wordt gebruikt fof voorwerpen die zijn gerichte beweging, omdat het sporen op basis van de voorspelde locatie van de vorige beweging genereert. "Max Distance" en "Max Gap Size" kan worden aangepast, afhankelijk van de verwachte omvang en de snelheid van het object dat wordt gevolgd, evenals de totale duur imago van de time-lapse van. - Onder Filter Type, selecteer de "Tijdsduur" filter. Klik op de groene pijl om af te volgen, en controleer de sporen die werden gegenereerd. Ga terug naar de vorige stap indien nodig om de tracks handmatig sorteren.
- Als de gegenereerde time-lapse afbeelding drifts, juist voor translationeel drift.
- Klik op het icoon met een afbeelding van een potlood. Dit is een tab editing dat "Tracks bewerken" wordt geopend. Onderzoek imago van de time-lapse en vind een verwijzing plek die niet mogen worden bewegen voor alle opnamen.
- In de linker bovenhoek van het scherm, vind venster "Wijzer" en afvinken "Select" om de cu activerenrsor voor een plek selecteren. Klik op de referentie-plek.
- Klik op "Correct Drift" in het venster "Tracks bewerken". Afvinken "Translationeel Drift". De software genereert automatisch de gecorrigeerde reeks beelden.
- Meet cellulaire beweging die door het object tracks in time-lapse beelden.
- Onder het raam "Tracks bewerken", afvinken "Tracks" en selecteer een track die de beweging van een cel vertegenwoordigt. De geselecteerde track wordt gemarkeerd in het geel imago van de tijdreeksen in.
- Klik op het icoon met een afbeelding van een grafiek om de "Statistieken" window (tab statistiek) te openen.
- Onder "Selection", selecteer "Track Speed Mean" door te klikken op de pijl omlaag om het genereren van de baan snelheid betekenen voor de geselecteerde track. Kies verschillende tracks en herhaal de stappen voor het meten van het circuit snelheid betekenen voor alle cellen van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murine femorale beenmerg succesvol opgeroepen met de WC visualisatie van afzonderlijke neutrofielen en vasculaire netwerken te schakelen. Figuur 1 toont de WC instrument en beschrijft de chirurgische procedure, waarbij blootstelling van de femorale bot en dunner worden van corticaal bot omvat om de optische toegang in het krijgen bot. De operatie wordt goed verdragen bij muizen; ze werden beoordeeld op ongewenste fysieke reacties zoals achterste ledematen zwelling, zonder gewichtsbelasting op lidmaat, zelfverminking, cellulitis en dermatitis, en schade aan het WK voor 5 dagen na de operatie, geen verslag van nood. Met name het venster blijft optisch helder voor IVM voor maximaal 40 dagen, die op lange termijn evaluatie van cellulaire en structurele veranderingen na een interventie mogelijk te maken.
Vasculatuur binnen het beenmerg kan worden gevisualiseerd door intraveneuze kleurstoffen zoals FITC-Dextran(Figuur 2). Omdat het contrast afhankelijk van de injectie van de kleurstof, de verkregen beeld vertegenwoordigt functionele vasculatuur bij voldoende bloedstroom. Naast de vasculatuur kan worden gekleurd neutrofielen in vivo met behulp van anti-Ly6G antilichaam. Figuur 3A en 3B vertegenwoordigen hetzelfde gebied van het beenmerg waargenomen op verschillende tijdstippen, waarbij neutrofielen worden gezien zowel in de intravasculaire en extravasculaire ruimte. Deze gebieden werden gekenmerkt door vasculaire oriëntatiepunten. Rhodamine 6G kan worden gebruikt als alternatief voor anti-Ly6G neutrofielen in vivo vlekken; echter diffundeert uit het vaatstelsel en vlekken monocyten in de extravasculaire ruimte een niet-specifieke wijze. Daarom anti-Ly6G de voorkeur omdat het in staat stelt specifieke beeldvorming van neutrofielen. Figuur 3C geeft beeldvorming van het corticale bot, dat hoofdzakelijk bestaat uit collageen vezels. De maximale diepte voor imaging bereiktIn dit experiment is 180 urn (figuur 3C).
Time-lapse fluorescentiebeeldvorming vergemakkelijkt het volgen en kwantificeren van cellulaire beweging in vivo. Figuur 4A toont het volgen van neutrofielen in het beenmerg vasculaire niche. Imaging zonder extra tijdsinterval tussen elke scan een accurate volgen van cellen; echter enkele gebruikersinvoer vereist om de correctheid van sporen die door de software verder te verbeteren. Tracking vlekken (dwz cellen plaats) maakt kwantificering van verscheidene parameters, zoals gemiddelde baansnelheid (figuur 4B). Andere parameters die kunnen worden gemeten omvatten, maar zijn niet beperkt tot, baanlengte, verandering bij plek grootte, vorm en intensiteit. Deze test verschaft kwantificatie van verschillende parameters die het karakteriseren van cellulaire bewegingen en interacties verbeteren.
Figuur 1: dijbeen venster kamer (WC), imaging podium en de chirurgische procedure (A) Naar maat gemaakte titanium dijbeen WC met een U-vormige bar die dient om het dijbeen op zijn plaats te bevestigen.. Het toilet heeft een diameter van 8 mm dekglas, beveiligd met een borgring. (B) Op maat gemaakte imaging podium. Een verwarmingselement is geplaatst op de bodem van de trap naar de fysiologische temperatuur van de muis tijdens beeldvorming handhaven. De twee alligator clips worden gebruikt om het toilet te houden. (C - H) chirurgische procedure voor het installeren van het dijbeen WC. (C) Het dijbeen is blootgesteld tussen de flexor en extensor spieren. Spieren zijn tijdens de procedure niet verwijderd. (D) De U-vormige balk onder het dijbeen geplaatst, en (E) het toilet is geïnstalleerd en vastgezet met twee moeren. (F) Dental cement wordt aangebracht tussen het bot en deWC om de ruimte te vullen. (G) De dermis wordt gehecht en (H) het deksel glas is vastgezet op zijn plaats met de borgring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: 3D fluorescentie beeldvorming van vasculaire netwerk in het beenmerg in vivo Representatieve beeld van vasculatuur in het beenmerg, afgebeeld door de femur WC.. Bloedvaten (groen) wordt gevisualiseerd door staartader injectie van 2 MDa FITC-dextraan. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: 3D beeldvorming van vasculaire netwerk, neutrofielen en botmatrix in vivo afbeeldingen van bloedvaten en neutrofielen in het beenmerg (A) 3 dagen en (b) 10 dagen na de operatie femur WC.. Neutrofielen, gekleurd door staartader injectie van APC-gelabeld Ly6G antilichaam, worden gezien zowel in de intravasculaire en extravasculaire ruimtes. De pijlen wijzen naar de vasculaire structuur te zien op beide dagen en geeft de mogelijkheid om dezelfde locatie in de tijd bij. Schaal bar = 50 micrometer. (C) botmatrix kunnen worden gevisualiseerd met behulp SHG (wit), naast vasculatuur (groen) en neutrofielen (rood). Het beeld werd 40 dagen na het WK operatie verworven. Schaal bar = 70 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Tracking neutrofielen verkeer binnen de vasculaire netwerk van het beenmerg in vivo (A) Track paden van neutrofielen in het vasculaire netwerk.. Tracks worden automatisch gegenereerd met behulp van de software ingebouwde Autoregressieve Motion algoritme. Elke witte stip vertegenwoordigt een middelpunt van een deeltje wordt bijgehouden (neutrofielen). Schaal bar = 50 micrometer. (B) De gemiddelde spoor snelheid gemeten voor intravasculaire en extravasculaire neutrofielen, met vermelding van het verschil in de beweging van neutrofielen (Error bar = gemiddelde + SD, * p = 0,0176, tweezijdige t-test). Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Real-time, seriële beeldvorming van de dynamische cellulaire processen in het beenmerg bevat informatie die anders is een uitdaging voor het verkrijgen van het gebruik van conventionele technieken, zoals histologie en totale bloedbeeld. Het dijbeen WC model hier beschreven biedt unieke mogelijkheden om cellulaire en structurele veranderingen in het beenmerg te onderzoeken in de tijd. Hoewel een femur WC model hiervoor vermeld, ons nieuwe ontwerp dat een grotere imaging gezichtsveld en kleinere totale WC grootte, die meer geschikt voor gebruik bij volwassen muizen. Het dijbeen WC model kan worden gebruikt in verschillende muizenstammen inclusief immunocompetente en / of transgene reporter muizen.
Er zijn kritische stappen tijdens de operatie dat de totale duur en de kwaliteit van de beeldvorming bepalen. Wanneer het blootstellen van het dijbeen, wordt slechts een stompe dissectie van de spieren tussen de flexoren en extensoren uitgevoerd; verwijdering van deze spieren kan tot verminderde mobiliteit van de muis en must worden vermeden. Bovendien malen van het corticale bot moet zorgvuldig worden uitgevoerd. Slijpen ongeveer 50 urn is geschikt voor optische beeldvorming met behoud van de structurele integriteit van de femorale vasculaire netwerk. Toepassing van tandheelkundig cement rond het bot is cruciaal voor het afdichten van het chirurgisch blootgestelde gedeelte zodat vochtophoping en handhaven van een duidelijke optische beeldvorming venster dan een maand, terwijl het risico van infectie. De tandheelkundige cement werkt ook aan het WK in plaats vast te stellen, waardoor het WK roteert rond het dijbeen. Tenslotte de borgveer gebruikt om het dekglaasje te houden is geschikt voor water-immersie lens, die water-afdichting. De borgveer voorkeur boven kleefstoffen aan het dekglaasje hechten aan de WC vanwege toevoeging van kleefstoffen de spleet tussen het bot en het dekglaasje het dekglaasje onder een kleine hoek ten opzichte van het beeldvlak kunnen verhogen, of plaats, waardoor de haalbare indringdiepte verminderen beeldvorming. voorts, De borgring is handig als de dekglaasje moet worden schoongemaakt of gewijzigd.
Naast de operatie, zijn er verschillende kritische stappen succesvolle optische beeldvorming van het beenmerg te bereiken. Om afbeelding in het femur toilet is de WC horizontaal geplaatst op de afbeeldeenheid voor de juiste onderdompeling van de objectieflens. De op maat gemaakte afbeeldeenheid geschikt is voor dit doel als het zorgt voor aanpassing van de hoek van de WC opzichte van de lens. Bovendien is de vormgeving van de WC, met name de afmetingen van de U-vormige balk, handhaaft het been een horizontale positie nabij het dekglaasje mogelijk optimale penetratiediepte bereiken. Tijdens de beeldvorming kan ademen artefacten worden waargenomen als horizontale lijnen in de fluorescentiebeelden. Naast het bevestigen van de WC de afbeeldeenheid, kan de temperatuur van het verwarmingselement onder afbeeldeenheid aangepast voldoende warm de dieren overmatige ademhaling minimaliseren. Een dunne laag gaaskan worden geplaatst tussen de muis en het verwarmde stadium verder te verminderen ademhaling artefacten tijdens de beeldvorming. Afhankelijk van het biologische doelwit beeldvorming, kan opnameparameters zoals framesnelheid beeldvormend volume en duur beeldvorming worden aangepast om voldoende afbeeldingen verzamelen experimentele vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld kan de snelheid van neutrofiel migratie en kruipende verschillen onder verschillende experimentele omstandigheden, van 2,8 um / min gedurende resident neutrofielen onder basale omstandigheden overal variërend 5-10 um / min voor neutrofielen onder ontstekingen 19-21. Zo zou de juiste beeldvorming snelheid en de duur van neutrofielen volgen in vivo ook verschillen op basis van experimentele omstandigheden. Bovendien, zoals blijkt uit de resultaten, het volgen van cellen in de vasculatuur zou een snelle beeldcamera met een hoge framesnelheid (30 frames / sec) vereisen. Indien de doelcellen die in extravasculaire ruimte, of als de cel tot cel interaction van belang wordt naar verwachting langzamer, moet de beeldkwaliteit voorrang boven imaging snelheid optreden.
De invloed van de geïnjecteerde antilichamen in vivo cel kleuring op celfunctie moet worden beschouwd. In ons onderzoek gebruikten we anti-Ly6G antilichaam (kloon 1A8), die doorgaans wordt gebruikt bij hoge doses (150-250 ug) neutrofielen afbreken van circulatie en studie hun rol in diverse ziektemodellen. Yipp en Kubes aangetoond dat fluorochroom-gelabeld anti-Ly6G antilichaam rekrutering van leukocyten niet verstoren bij lage intravasculaire injectie doses (1-40 ug) 22. Echter, een recente studie suggereert dat fluorochromen, die grote verschillen in molecuulgewicht en chemische structuur, kan differentieel beïnvloeden de functie van anti-Ly6G 23. De studie toonde aan dat FITC-gemerkt anti-Ly6G, maar niet PE- en APC-gemerkte antilichamen, effectief put neutrofielen in vivo bij een lage concentratie (30 ug).In ons onderzoek hebben we niet neutrofielen uitputting overuren te observeren met behulp van 4 ug APC-gelabeld anti-Ly6G. Niettemin wordt verdere karakterisatie van de functie van fluorochroom-gemerkt anti-Ly6G antilichaam in vivo vereist het gebruik in intravitale imaging valideren. Dit geldt ook voor andere antilichamen die functionele vermogen om cellulaire interacties te veranderen zijn. Als alternatief voor in vivo cel kleuring met antilichamen, transgene reportermuizen 24 en / of gelabelde fluorescente cellen 25 kan worden gebruikt om neutrofielen of andere celpopulatie in vivo visualiseren.
Het dijbeen WC model beschreven in dit protocol maakt beeldvorming tot 40 dagen na de operatie. Enkele uitdagingen voor langdurige beeldvorming middels dit model WC incl vertraagde bot genezingsproces en onderhouden van een schone glazen raam. Met name, we hebben geen tekenen van kennelijk botgenezing na het WK implantatie observeren, die includ zoue verdikking van periosteum; Dit is niet onverwacht aangezien botgenezing proces vindt gewoonlijk na 1½-3 maanden 26,27. Onderhoud van een schone en optisch helder venster kan worden bereikt door toepassing van de tandheelkundige cement en het gebruik van de borgveer en dekglaasje die een vaste water-afdichting met het weefsel verschaffen. Het dekglaasje kan soms worden gereinigd met wattenstaafjes van buiten om stof en vuil te verwijderen. De WC heeft een breed beeldveld, bijna de gehele lengte van de diafyse gebied (ongeveer 8,4-8,6 mm 28), die superieur is aan de eerder gepubliceerde model 18 maakt. De toegang tot de distale gebieden en diepere mergholte beperkt. In het bijzonder is het trabeculaire-rijke metafyse, gelegen aan het distale uiteinde van de diafyse, bekend rijk in HPSCs 29. Deze gebieden kunnen histologisch worden benaderd, of IVM als een terminal procedure. Als alternatief verschillende beeldvormende technieken zoals micro-compbijge- tomografie kan worden gebruikt om het beeld distale gebieden van het beenmerg in vivo 30. Dergelijke methoden zijn complementair aan IVM, het verstrekken van een geïntegreerde aanpak voor de beoordeling van de anatomie en de verschillende cellulaire en structurele veranderingen en interacties binnen het beenmerg.
De hier beschreven protocol biedt een nieuwe benadering voor langdurige spatio-temporale bepalingen van de femorale beenmerg bij muizen cellulaire resolutie. De gepresenteerde methoden in te schakelen in vivo seriële beeldvorming van de bewegingen van een enkele cel of cellulaire populaties in biologisch relevante tijdschalen te volgen, terwijl tegelijkertijd structurele en functionele informatie van het beenmerg te verkrijgen. Daarnaast kunnen kwantitatieve beeldanalyse worden uitgevoerd om verder te karakteriseren cellulaire en functionele veranderingen, zoals het volgen van cellulaire bewegingen. De toepassing van deze femur WC model in verschillende muizenstammen, met name transgene reportermuizen 31,kan verder in staat onderzoek naar multiple individueel gelabelde celpopulaties zoals die betrokken zijn bij hematopoiese. Daarom is het protocol beschreven is breed toepasbaar op een groot aantal preklinische studies met verschillende biologische processen in de levende muis beenmerg, waaronder onderzoek in hematopoiese, leukemie, HPSC transplantatie, immuunregulatie, het beenmerg micro-omgeving (bijvoorbeeld hypoxische niche) en de bijdrage van immuuncellen aan progressie van de tumor en metastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Advanced Optical Microscopy Facility (www.aomf.ca) van de Universiteit Health Network bedanken voor de hulp bij microscopie, en de heer Jason Ellis van het Princess Margaret Cancer Center Machine Shop voor het vervaardigen van de WC en de imaging podium. We willen ook graag bedanken Dr. Iris Kulbatski voor manuscript bewerken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W.
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
