Introduction
骨髄は造血及び免疫調節に関与する重要な器官です。これは、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）を含む造血成分、および間葉細胞1を生じる非造血前駆細胞を含む間質成分から成ります。造血活性の三分の二は、骨髄細胞2の世代に捧げられています。 1-2×10 11細胞は、正常な成人2日ごとに生成して、特に、好中球の大多数は、骨髄で産生されます。好中球は、微生物感染に対する防御の第一線であり、ストレスが末梢 好中球1,3を補完するために彼らの動員をトリガするまで、主に骨髄に予約されています。それらの抗菌効果に加えて、最近の研究では、形質転換成長によってプロ及び抗腫瘍形成表現型の両方を有する、癌生物学における好中球の重要な役割を示唆しています腫瘍微小環境4,5におけるシグナル伝達因子β（TGF-β）。また、研究では、循環中の好中球は、細胞毒性、抗転移効果8を発揮しながら、原発腫瘍に蓄積する好中球は、T細胞6,7の細胞傷害性機能を抑制することにより、プロ腫瘍形成および転移性効果を発揮することを実証しました。このように、骨髄中の造血細胞の研究、特に好中球は、免疫および腫瘍調節におけるそれらの役割を解明するために重要です。
組織病 理学および完全な末梢血球数を日常骨髄9細胞および構造変化を評価するために使用されます。しかしながら、これらの方法は、異なる細胞集団または組織の微細構造の静的な情報を提供します。長手方向のインビボイメージングは、複数の細胞、血管および間質成分の動力学ならびに細胞からCを評価するための標準的な方法と組み合わせて使用することができます縦の方法でエル相互作用。顕微鏡の分解能10で生きている動物の画像化として定義される生体顕微鏡（IVM）は、必要な実験動物の数を減少させる、同じ試料中の経時動的な細胞プロセスを評価するために特に有用です。 IVMは、多くの場合、数週間から数ヶ月の期間にわたって画像化の対象の臓器にアクセスするために慢性的に移植窓室（WC）と組み合わされます。頭蓋と背皮脂WCのモデルが戻って1990年代半ばにさかのぼる使用の最も長い歴史を持っています。より最近では、このような乳房脂肪パッドおよび様々な腹部の器官のものなどの他の臓器特異的WCモデル11を開発されてきました。
生体内で骨髄を撮像するための典型的なアプローチは、薄くなった骨が最小限の外科的介入12-14と単一細胞の直接可視化を可能にしたマウスの頭蓋冠、の主に関与露出を持っています。しかし、頭蓋冠の骨髄は、bの場合があり電子HSPCs 15の維持・発展を減少示し頭蓋冠でHSPCsと低酸素細胞の低い数、によって示されるように、そのような長い骨のような他の骨、のとは異なります。したがって、長骨内の細胞成分を評価するための代替的なアプローチが研究されてきました。これらは、大腿骨の髄16と背側皮下脂肪WC 17で分割大腿骨の異所性移植の直接のエクスポージャーが含まれます。しかし、前者はより長い期間にわたって、セルラー構造的および機能的変化の追跡を許可しない端末の手順であり、後者の可能性が高いが原因背側皮下脂肪WC内部の異所性サイトへの大腿骨の移植に正常な骨髄機能を妨げます。時間をかけて大腿骨髄の同所シリアルイメージングを可能にするもう一つの方法は、大腿骨にWCを使用することです。一つ前のレポートでは、使用して大腿骨髄中の微小循環の長期的なイメージングを実証しましたマウス18で大腿骨WC。さらに、著者らは、骨髄転移をモニタリングにおけるその有用性を示す、大腿骨における腫瘍細胞の可視化を示しました。しかし、このWCの設計は、それによって作り、その大きなサイズ（1.2センチ直径）と大規模なマウスのみに適した比較的小さな撮影領域（直径4mm）、（26〜34グラム、生後3-6ヶ月）によって制限されていました日常的な使用のための非現実的なアプローチ。
したがって、小さい全体のサイズと大きい内側の撮像領域を持つ新しいWCは、本研究の目的のために設計されました。この研究の目的は、大腿骨の髄内に種々の細胞型を撮像するための方法を提供することでした。大腿骨WCモデルは、社内で開発された3D血管網内の好中球を可視化し、追跡するために使用されました。このモデルを用いて、骨髄のIVMは、40日間に渡って連続的に行うことができます。このアプローチは、免疫調節A、造血のプロセスを解明するための様々な分野に適用することができますND腫瘍発生。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：すべての動物の作業は、大学健康ネットワーク施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの＃2615で行いました。
マウスの1外科の準備
- 手術に先立ち、オートクレーブにより、すべての手術器具や窓室（WC）を滅菌します。 2日前、手術とアモキシシリンの50 mg / kg体重で飲料水を補います。腹腔内に4時間、手術前にブプレノルフィンの0.1 mg / kg体重でマウスを注入します。
- 80ミリグラム/ kgのケタミンおよび13 mgの/ kgのキシラジン（注を含む350〜400μlの生理食塩水の腹腔内注射による無胸腺ヌードマウスを麻酔：これは施設内動物実験委員会によって承認された、と私たちは悪影響の経験がありませんでした）。足の反射をテストすることによって、適切な麻酔を確認してください。手順中の呼吸パターン、粘膜の色と足の反射のために観察し続けます。
- 外科的な広報を行います手術中に無菌状態を維持するための安全キャビネットの下ocedures。手術中の体温を維持するために、外科用ドレープで覆われた電気加熱パッドの上にマウスを置きます。実体顕微鏡下ですべての外科的処置を実行します。
- 手術中に湿った目を保つために眼軟膏を適用します。必要に応じて、外科手術の際に繰り返します。連続して7.5％ポビドンヨード、70％のイソプロピルアルコールおよび10％ポビドンヨードで拭いて、マウスの動作領域を殺菌し、この手順を2回繰り返します。
- 側面から大腿骨に接近し、ブレード（＃15）とメスを用いて10ミリメートル縦皮膚切開を行います。筋肉の機能を確保するために鉗子や止血剤を使用して、鈍的切開により屈筋と伸筋の間の大腿骨を公開します。
- 骨の下でU字型の棒を挿入し、WC（ 図1）をインストールします。 2つのナットを使用してウィンドウでバーを固定し、ためにナットを締めCEPS。歯科用セメントと骨とWCとの間の空間を満たします。
- 骨髄腔への光アクセスを得るために、マイクロドリルで6×2ミリメートル2領域での皮質骨を削ります。
注：この手順を実行しながら、慎重に顕微鏡下皮質骨の菲薄化を検査します。骨の無傷の、ほぼ透明骨膜層を残します。 - ウィンドウ上に8ミリメートルのカバーガラスを配置し、所定の位置にそれを維持するためにスナップリングでカバーガラスを固定します。
- 手術後のその機能を維持するために鉗子を使用して戻って元の場所への屈筋と伸筋の筋組織を再調整します。 5-0縫合糸と針ホルダを使用して、真皮を縫合。
- それは意識があると自由に移動できるようになるまで、回復のためのマウスを監視します。回収されたときに、新しいケージに動物を入れてください。
- 回復後、（セクション2を参照）と同じ日または次の日に動物の画像取得を行います。 physiを監視します毎日マウスのCAL条件。
注：このような四肢、ハンチング、急速または浅い呼吸、後肢の腫脹、自傷、蜂巣および重度の皮膚炎に体重負荷のような物理的な条件を、監視します。 - 3日間のブプレノルフィン/ kg体重を0.1mgの腹腔内注射を与え、術後疼痛及び炎症の治療のための手術後5日間、メロキシカム1mg / kg体重。 5日間アモキシシリンを補充した水を提供し続けます。
- 実験的なエンドポイントで、二次的方法（ 例えば 、頚椎脱臼）、続いてCO 2ナルコーシスにより動物を安楽死させます。
複合多光子共焦点顕微鏡を用いて2画像取得
- 撮影に先立ち、80ミリグラム/ kgのケタミンおよび13 mgの/ kgのキシラジンを含む350〜400μlの生理食塩水の腹腔内注射によってマウスを麻酔。利用可能な場合あるいは、吸入可能麻酔薬を使用しています。眼軟膏を適用します。
- および好中球（アロフィコシアニン（APC） - 抗Ly6G抗体4μgの）（2 MDAフルオレセイン（FITC） - デキストランの0.65 mg）をラベリング血管系のための血管内色素の混合物を注入します。
- 青から赤に励起波長を提供して705から980 nmのから二光子励起のために及ぶ多光子レーザー、ならびに単一光子レーザーを装備した直立組み合わせた多光子共焦点顕微鏡を使用してください。
- 顕微鏡（ 図1B）上にカスタムメイドの撮影台を設定します。ワニ口クリップでWCの2つの端部をクランプすることにより、ステージ上でマウスを固定します。
注：WCを保持するための2つのワニ口クリップ、撮像中にマウスの生理的温度（37℃）を維持するために加熱要素：ステージの重要な構成要素です。 - 二光子レーザーおよび共焦点システムの電源を入れ、「スタートシステム」をクリックすることで、画像取得ソフトウェアを起動します。 4つのタブ付きウィンドウ（見つけて、収集、処理、および保守）が開きます。
- イメージングチャンネルを設定します。取得タブの下に「スマートセットアップ」をクリックして、イメージングのために使用される染料を選択：FITC（488 nm励起、493から588 nmの発光）とAPC（633 nm励起および638から743 nmの発光を）。 「最良の信号」を選択し、「適用」をクリックします。
- 第二高調波発生（SHG）撮像チャネルを手動で追加します。買収タブの「レーザー」ウィンドウの下に二光子レーザーをオンにします。 Channelsウィンドウの下で、トラックを追加するには、「+」記号をクリックしてください。
- SHGトラックを設定します。上下の矢印を使用してChannelsウィンドウの下に840 nmの波長を変更し、スライダバーを使用して「光パス」ウィンドウの下に415から425 nmで検出範囲を選択します。
- 探しタブの下に「接眼レンズオンライン」をクリックします。関心のある領域を表示し、トンを回して手動でピントを調整するためにFITC用のフィルタ設定の下でFITCをクリックします彼は顕微鏡の側につまみを集中します。関心領域が配置されているときに、見つけタブの下に「接眼レンズオフライン」をクリックします。
- 取得]タブをクリックします。 Channelsウィンドウの下にFITCトラックを選択して、5倍の対物レンズを用いてFITCデキストランの画像をプレビューするには、「ライブ」をクリックしてください。必要に応じてフォーカスを調整し、プレビューを停止するには、取得]タブの下で「停止」をクリックします。
- 手動でレンズの上にホイールを動かすことによって、20X水目標に向けます。 20Xの対物レンズを用いてFITCデキストランのために再度画像を表示し、最適な信号とコントラストを達成するために、チャンネル・ウィンドウの下にマスターゲインとピンホールを調整します。 Channelsウィンドウの下にAPCとSHGのトラックを選択することで、他のチャンネルについて、この手順を繰り返します。
- 撮像パラメータを選択します。そのウィンドウを開くには、「取得モード」をクリックします。高品質の画像を得るために、フレーム1,024×1024ピクセルにサイズ、および4Xの平均化を設定します。
- 2Dスナップショットを取得します。チャンネルが勝つの下にすべてのチャンネルを選択しますダウとは、買収のタブの下に「スナップ」をクリックしてください。画像の品質を確認し、必要に応じて撮影パラメータを変更します。
- 2Dタイムラプス画像を取得します。
- 時系列ウィンドウを開くために取得タブで「時系列」をオフに確認してください。間隔の下で0を入力し、時間間隔なしで連続40画像を撮影するためのスキャンの合計数は40。
注：40スキャンは7.5秒/フレームの走査速度及び600μmの×600ミクロンの画像サイズで約5分の長期時系列を生成します。間隔顕微鏡、画像取得の設定、カメラのフレームレートに応じて、スキャンの数を調整します。固定されたインターバル時間（> 0秒）は、異なる時点で取得されたタイムラプス画像を比較するために使用することができます。長いタイムラプスイメージングの期間は、実験条件における好中球の予想平均速度（または関心のある他の細胞）に応じて必要となる場合があります。
- 時系列ウィンドウを開くために取得タブで「時系列」をオフに確認してください。間隔の下で0を入力し、時間間隔なしで連続40画像を撮影するためのスキャンの合計数は40。
- 3D画像を取得します。
- Z-Stack]ウィンドウを開くために取得タブで「Z-スタック」をオフに確認してください。 FITCデキストランのための「ライブ」プレビューモードを開始します。サンプルの上に焦点を当て、「最初の設定」をクリックし、サンプルのもう一方の端に焦点を当ててクリックZスタックウィンドウに「最後のセット」。
- Zスタックウィンドウの下には10μmであると間隔を設定します。前のステップで選択した最初と最後の光学スライスに応じて、これは90から180ミクロンの全体的な光学的厚さで、10月20日のスライスを生成します。
注：zスタック間隔は、光学スライスの厚さを決定するピンホールの大きさに依存します。光学スライスの厚さよりも小さくなるように間隔を設定します。 - 画像の収集を開始するために取得]タブの下の「実験を開始」をクリックします。
- 3Dタイムラプス画像を取得します。
- 時系列を開くために取得タブで「時系列」をオフにチェックし、「Z-スタック」Zスタック窓。
- ステップ2.14と2.15で説明したように時系列およびZ-スタック取得パラメータを設定します。画像の収集を開始するために取得]タブの下の「実験を開始」をクリックします。
- それが安定して無意識であることを確認するために撮像中にマウスを監視します。マウスは、撮影時の不安定および/または意識がある場合は、ステージからマウスを削除し、腹腔内に麻酔液の追加の100-150μLを注入し、撮影を続けます。
注意：不安定性の徴候は、取得した画像にアーチファクトをシフトとして見ることができるマウスの速い呼吸と動きを、含まれています。 - 画像取得後、ステージからマウスを取ると、ケージに戻します。暖かいそれを維持し、それは意識があるまで、マウスを監視するために加熱ランプを使用してください。
3.画像解析と定量化
- 3次元時系列データを分析するために画像解析ソフトウェアを使用。ソフトウェアを開いて、「アリーナ」ビューと呼ばれるオープン画面へドラッグして画像を追加します。それを開くには、画像ファイルをダブルクリックします。画像は「サーパス」ビューの下で開かれます。
- 2D / 3D画像を作成します。
- 右上にある "詳細"バーから、「画面の調整」ウィンドウを開くには、「編集/表示するディスプレイの調整」をクリックします。各チャネルのしきい値を調整することにより、蛍光表示を最適化し、画像を保存するスナップショットを取ります。
- タイムラプス画像を使用してオブジェクトのトラックを生成します。
- ビューを「サーパス」で分析する画像を開きます。 「サーパス」アイコンの下に見つかったオレンジ色のドットの画像とアイコンをクリックします。これは、新しい「スポット」ウィンドウを開きます。
- 「（時間以上）のトラックスポット」をオフにチェックして、次のステップに進むために青色の矢印をクリックしてください。 「ソースチャンネル」の下で追跡するためのオブジェクトを含むチャンネルを選択して、推定されたオブジェクトDIAMETを設定数値を入力して「推定XY直径」の下えー。次のステップに進むために青色の矢印をクリックしてください。
注：好中球の追跡のために、好中球に対するAPCの蛍光を含むチャンネルを選択して、好中球の既知のサイズに基づいて、12ミクロンへのオブジェクトの直径を設定します。 - ウィンドウで、検索し、下矢印をクリックして「品質」フィルタを選択します。ソフトウェアで定義されたスポットを観察し、スポットを含めるか除外するかを手動でしきい値を調整します。しきい値が定義されると、「トラッキング」のステップに行くために青色の矢印をクリックしてください。
- アルゴリズムの下で、下矢印をクリックして「自己回帰モーションアルゴリズム」を見つけ、選択します。 「最大ギャップサイズ」の「最大距離」のための10ミクロンおよび3のタイプは、パラメータの下で見つかりました。オフチェック追跡を開始し、次のステップに行くために青色の矢印をクリックし、「すべての検出されたオブジェクトとのギャップを埋めます」。
注：「自己回帰運動アルゴリズムは「F使用されていますまたはそれは、前の動きから予測位置に基づいて、トラックを生成するので、動きを指示したオブジェクト。 「最大距離」と「最大ギャップサイズは、「予想される寸法と速度追跡されているオブジェクトのと同様に、タイムラプス画像の全体の持続時間に応じて調整することができます。 - フィルタの種類]で、「トラック時間」フィルタを選択します。追跡を終了するには、緑色の矢印をクリックし、生成されたトラックを確認してください。必要に応じて手動でトラックをソートする前のステップに戻ります。
- 生成されたタイムラプス画像ドリフトの場合、翻訳ドリフトの正しいです。
- 鉛筆の画像でアイコンをクリックしてください。これは、「編集トラック」ウィンドウが開き、編集タブです。タイムラプス画像を調べて、すべての画像に移動すべきではないの参照場所を見つけます。
- 画面の左上隅で、「ポインタ」ウィンドウを見つけるとCuをアクティブにする」を選択し、「オフチェックスポットを選択するためのrsor。参照スポットをクリックします。
- 「編集トラック」ウィンドウに「正しいドリフト」をクリックしてください。 「トランスレーショナドリフト」をオフに確認してください。ソフトウェアは自動的に画像の補正後のシリーズを生成します。
- タイムラプス画像内のオブジェクトのトラックによって定義された携帯の動きを測定します。
- 「編集トラック」ウィンドウの下に、「トラック」をオフにチェックし、細胞の動きを表すトラックを選択。選択したトラックは、時系列画像の黄色で強調表示されます。
- 「統計」ウィンドウ（統計]タブ）を開くために、グラフの画像とアイコンをクリックしてください。
- 「選択」の下では、トラックの速度が選択されたトラックのために意味を生成するには、下矢印をクリックして「トラックスピード平均」を選択します。別のトラックを選択し、トラックの速度は関心のあるすべてのセルの平均を測定するためのステップを繰り返します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
マウス大腿骨髄が正常に個々の好中球および血管ネットワークの可視化を可能にするためにWCを使用してアクセスします。1は、WCの楽器を示し、内部の光学アクセスを得るために、大腿骨と皮質骨の菲薄化の露出を伴う外科手術を、説明図骨。手術はマウスで忍容性が良好です。それらは苦痛の無い報告書では、このような5日後に手術のためのWCに後肢の腫脹、非重量は手足にベアリング、自傷、蜂巣や皮膚炎、ならびに損傷などの有害な物理的反応、について評価しました。特に、ウィンドウは介入後の細胞と構造変化の長期的な評価を可能にする、最大40日間IVMのために光学的に透明なままです。
骨髄内の血管系は、FITCデキストランのような血管内の色素によって可視化することができます（ 図2）。コントラスト色素の注入に依存するため、取得された画像は、十分な血流が存在する機能的血管構造を表します。血管系に加えて、好中球は、抗Ly6G抗体を用いてインビボで染色することができる。 図3A及び3Bは 、好中球は、両方の血管内および血管外空間内に見られる種々の時点で観察された骨髄の同じ領域を表します。これらの領域は、血管目印によって特徴付けられました。ローダミン6Gは、 インビボで好中球を染色する抗Ly6Gの代替として使用されてもよいです。しかしながら、それは、非特異的様式で血管外空間における血管系や汚れ単球から拡散します。したがって、抗Ly6Gは、好中球の特異的イメージングを可能にするからである。 図3Cは、主にコラーゲン繊維から構成されて皮質骨の画像化を表すことが好ましいです。達成イメージングのための最大の深さこの実験では180ミクロン（ 図3C）です。
タイムラプス蛍光イメージングは、 生体内での細胞運動の追跡および定量化を容易にする。 図4（a）は、骨髄の血管ニッチに好中球の追跡を示しています。各スキャンの間には、追加の時間間隔でのイメージングは、細胞の正確なトラッキングを可能にします。しかしながら、いくつかのユーザ入力は、さらに、ソフトウェアによって生成されたトラックの精度を向上させることが必要です。スポットの追跡（ すなわち、目的の細胞）は、平均トラックスピード（ 図4B）などの各種パラメータの定量化を可能にします。測定することができる他のパラメータとしては、トラック長、スポットサイズの変化、形状及び強度が、これらに限定されません。このアッセイは、細胞の動きとの相互作用の特性を向上させる各種パラメータの定量化を提供します。
図1：場所で大腿骨を固定するのに役立つU字型のバーでの大腿骨窓室（WC）、撮影台と、外科的処置 （A）カスタムメイドのチタン大腿WC。 WCは、スナップリングによって固定直径8mmのカバーガラスを保持します。 （B）カスタムメイドの撮影台。加熱素子は、撮像時のマウスの生理的温度を維持するために、ステージの下に配置されています。 2ワニ口クリップは、WCを保持するために使用されています。 （C - H）大腿骨のWCをインストールするための外科的処置。 （C）大腿骨は、屈筋と伸筋の間に露出されています。筋肉は、手続き時に削除されません。 （D）U字形のバーは、大腿骨の下に配置され、及び（E）WCがインストールされ、2個のナットを用いて固定されています。 （F）歯科用セメントは、骨との間に印加されますWCは、空間を充填します。 （G）真皮縫合され、（H）カバーガラスは、保持リングで所定の位置に固定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2：in vivoでの 骨髄中の血管網の3D蛍光イメージング骨髄中の血管系の代表的な画像、大腿骨のWCを介して撮像されました。 血管系（緑）2 MDA FITCデキストランの尾静脈注射によって可視化されます。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 4：in vivoでの 骨髄の血管網内の好中球の動きを追跡する血管網内の好中球の（A）トラックパス。トラックは、ソフトウェアの自己回帰内蔵のモーションアルゴリズムを使用して自動的に生成されます。各白色ドット（好中球）が追跡されている粒子の中心点を表しています。 =50μmのスケールバー。 （B）は 。（エラーバー= + SD、*はp = 0.0176、両側t検定を意味する）、好中球の動きに差を示す、血管内および血管外の好中球について測定トラックスピード平均の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
リアルタイムは、骨髄中の動的な細胞プロセスの連続撮影は、そうでなければ、このような組織学および総血球数などの従来の技術を用いて得ることが挑戦されている情報を提供します。ここで説明した大腿骨WCモデルは、時間の経過とともに、骨髄中の細胞と構造変化を調査するためのユニークな機会を提供しています。大腿骨WCモデルは、以前に報告されているが、本発明の新規な設計は、成体マウスでの使用のための多くの互換性のあるビュー小さい全体WCサイズの大きな撮像視野を提供します。大腿骨WCモデルは、免疫および/またはトランスジェニックレポーターマウスなどのマウス系統の様々な使用することができます。
全体の時間とイメージングの品質を決定手術中の重要なステップがあります。大腿骨を露出させた場合、屈筋と伸筋の間の筋肉の唯一の鈍的切開が行われます。これらの筋肉の除去は、マウスとMUSの減少、移動度をもたらし得ますtが回避されます。また、皮質骨の粉砕を慎重に行わなければなりません。大腿血管網の構造的完全性を維持しながら、約50μmの粉砕は光学イメージングに適しています。骨の周りの歯科用セメントの適用は、外科的に露出面積を密封流体の蓄積を防止し、感染のリスクを軽減しながらヶ月以上のための明確な光学イメージングウィンドウを維持するために重要です。歯科用セメントはまた、大腿骨の周りを回転するのWCを防止する、場所にトイレを固定するように作用します。最後に、カバーガラスを保持するために使用されるスナップリングは、水シールを提供し、水浸レンズを使用するのに適しています。接着剤の添加は骨とカバーガラスの間のギャップを増加させる、または撮像面に対してわずかな角度でカバーガラスを配置し、それによってのための達成可能な浸透深さを減少させる可能性があるため、スナップリングは、WCにカバーガラスを取り付けるための接着剤の上をお勧めしますイメージング。さらにカバーガラスを洗浄または変更する必要があるとき、スナップリングが有用です。
外科手術に加えて、骨髄の正常な光学イメージングを達成するには、いくつかの重要なステップがあります。大腿骨のWC内の画像に、WCは、対物レンズの適切浸漬する撮像ステージに水平に配置されています。これは、レンズに対してWCの角度の調整を可能にするようにカスタムメイドのイメージング段は、この目的に適しています。また、WCの設計、U字型のバーの特に大きさは、最適な侵入深さを達成するために可能な限りカバーガラスに近い水平位置に骨を維持しています。撮像中に、呼吸アーチファクトは、蛍光画像において水平線として観察することができます。イメージングステージにWCを固定することに加えて、撮像段階下の加熱エレメントの温度が十分に過度の呼吸を最小限に抑えるために、動物を加温するように調整することができます。ガーゼの薄い層マウスさらに、撮像時の呼吸アーチファクトを軽減するために加熱されたステージとの間に配置されてもよいです。生物学的な撮像対象に応じて、例えば、フレームレート、撮像ボリューム及び撮像期間として取得パラメータはまた、実験的な問題に対処するために十分な画像を収集するように調整することができます。例えば、好中球遊走とクロールの速度は基本条件下常駐好中球/分2.8μmのどこからでも炎症状態19-21の下で好中球は5〜10μm/分の範囲に、様々な実験条件下で異なる場合があります。したがって、in vivoでの好中球の追跡のための適切なイメージング速度と持続時間は、実験条件に基づいて異なるであろう。また、結果から分かるように、脈管構造内の細胞の追跡は、高フレームレート（30フレーム/秒）で高速撮像カメラを必要とするであろう。しかし、標的細胞が血管外空間に居住しているか、または細胞間interactio場合関心のnがよりゆっくりと、画質がよりも優先されるべき撮像速度を生じることが予想されます。
細胞機能に対するin vivoでの細胞染色のために注入された抗体の影響も考慮しなければなりません。私たちの研究では、一般的に循環から好中球を枯渇し、様々な疾患モデルにおけるそれらの役割を研究するために、高用量（150〜250μgの）で使用されている抗Ly6G抗体（1A8クローン）を、使用していました。 YippとKubesは、蛍光色素で標識された抗Ly6G抗体が低い血管内注射用量で白血球動員（1-40μgの）22を破壊しないことを実証しました。しかし、より最近の研究は、蛍光色素は、分子量および化学構造に大きな違いを有する、示差抗Ly6G 23の機能に影響を及ぼし得ることを示唆しています。研究では、FITC標識ことを抗Ly6Gを示したが、PE-ないとAPC標識抗体、効果的に低濃度（30μgの）で、in vivoでの好中球を枯渇させます。私たちの研究では、APC標識抗Ly6Gの4μgのを使用して、好中球枯渇の残業を観察しませんでした。それにもかかわらず、in vivoでの蛍光色素標識抗Ly6G抗体の機能のさらなる特徴は、生体内画像化におけるその使用を検証するために必要とされます。これはまた、細胞間相互作用を変化させる機能的能力を持っている他の抗体に適用されます。 インビボでの代替として抗体を用いた細胞染色、トランスジェニックレポーターマウス24および/ または蛍光標識細胞25は、好中球またはインビボで興味の他の細胞集団を可視化するために使用することができます。
このプロトコルで説明大腿骨WCモデルは、手術後最大40日間イメージングを可能にします。このWCモデルを使用して、長期的なイメージングのための課題のいくつかは、遅延、骨の治癒過程ときれいなガラス窓のメンテナンスが含まれています。注目すべきことに、我々はどのINCLUDだろう、WCの移植後の明らかな骨の治癒の兆候は観察されませんでした骨膜の電子肥厚;これは、骨の治癒過程は、一般的に1 1/2 3ヶ月26,27の後に起こることを考えると、予想外ではありません。クリーンで光学的に透明な窓の維持は、歯科用セメントの適用、および組織としっかり水シールを提供するスナップリングとカバーガラスを使用することによって達成することができます。カバーガラスは、時折ほこり及び破片を除去するために、外部からの綿の先端を用いて洗浄することができます。 WCは、ほぼ以前に発表されたモデル18に、それは優れたなり骨幹領域（約8.4〜8.6ミリメートル28）、全体の長さをカバー、広い撮像視野を持っています。しかしながら、遠位領域にアクセスし、より深い骨髄腔は限られています。具体的には、骨幹の遠位端に位置する小柱リッチ骨幹は、HPSCs 29が豊富であることが知られています。これらの領域は、端末手順と組織学的に、またはIVMによってアクセスすることができます。あるいは、このようなマイクロコンプなどの異なるイメージングモダリティuted断層撮影法は、骨髄の遠位領域は、 インビボ 30 に画像を使用することができます。このような方法は、骨髄内の解剖学的構造および種々の細胞および構造変化との相互作用を評価するための統合的アプローチを提供し、IVMに相補的です。
ここで説明するプロトコルは、セルラー解像度でマウスでの大腿骨の骨髄の長期時空評価のための新しいアプローチを提供しています。同時に骨髄の構造的および機能的情報を得ながら、提示される方法は、生物学的に関連する時間スケール上の単一の細胞または細胞集団の動きを追跡するためにインビボシリアルイメージングに有効。また、定量的な画像解析はさらに、細胞の動きを追跡するように細胞および機能的変化を特徴付けるために実施することができます。特にトランスジェニックレポーターマウス31のマウスの様々な株、この大腿骨WCモデルの適用、さらに、造血に関与するものなど、複数の個別に標識された細胞集団の調査を可能にすることができます。したがって、記載されたプロトコルは、造血、白血病、HPSC移植、免疫調節、骨髄微小環境（ 例えば、低酸素ニッチ）で調査を含む生きたマウス骨髄内の様々な生物学的プロセスに関与する前臨床試験、広い範囲に広く適用可能であると腫瘍の進行および転移に対する免疫細胞の寄与。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者には、競合する金融利害関係を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、WCと撮影台を製造するためのプリンセスマーガレットがんセンターマシンショップから顕微鏡の支援のために大学健康ネットワークで高度な光学顕微鏡施設（www.aomf.caを）感謝したい、と氏はジェイソン・エリスでしょう。また、原稿編集のために博士アイリスKulbatskiに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W.
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
