Abstract
De cuatro a seis semanas de edad, ratas Wistar machos fueron usados para producir modelos animales de fibrosis hepática. El proceso requiere cuatro semanas de la administración de 10 mg / kg dimetilnitrosamina (DMN), dada por vía intraperitoneal durante tres días consecutivos por semana. Las inyecciones intraperitoneales se realizaron en la campana de humos como DMN es una hepatoxin conocida y carcinógeno. El modelo tiene varias ventajas. En primer lugar, cambios en el hígado pueden ser estudiadas de forma secuencial o en etapas particulares de interés. En segundo lugar, la etapa de la enfermedad hepática se puede controlar mediante la medición de aminotransferasa en suero de alanina (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) enzimas. En tercer lugar, la gravedad del daño hepático en diferentes etapas puede ser confirmada por el sacrificio de los animales en puntos de tiempo designados, seguido por el examen histológico de los tejidos del hígado Trichome manchadas de Masson. Después de cuatro semanas de administración de DMN, la puntuación de la fibrosis típica es de 5 a 6 en la escala de Ishak. El modelo puede ser reproducida de manera consistente y ha sidoampliamente utilizado para evaluar la eficacia de los posibles agentes anti-fibróticos.
Introduction
DMN es una toxina específica potente hígado. Su metabolismo, distribución en los tejidos, y la capacidad de causar lesiones en los hígados de ratas se informó por Magee 1, y el mecanismo de daño de hepatocitos y la muerte celular por apoptosis fue descrito por Pritchard y Butler 2. Se informó de administración intermitente de este compuesto para inducir la fibrosis hepática en perros y ratas 3,4.
Los mecanismos y los cambios morfológicos de la fibrosis hepática se han investigado ampliamente el uso de este modelo. En los primeros estudios que utilizan la rata, el tratamiento de 3 semanas con DMN produce necrosis hemorrágica centrolobulillar seguido de cirrosis micronodular sin esteatosis 5. Se demostró que en la fibrosis temprana, el colágeno formado era más reticulado con el tipo III es más prominente que tipo I 6. En común con otras causas, cambios fibróticos DMN inducida se asociaron con un aumento en las células de Kupffer; macrófagos hepáticos que residen in los sinusoides. Estas células se transforman en miofibroblastos y producen cantidades excesivas de matriz extracelular que es el principal problema en la fibrosis 7.
En términos de la señalización celular, Nakamura et al. Demostró que el TGF-β juega un papel crítico en la progresión de la fibrosis hepática 8. Utilizaron un adenovirus que expresa un receptor TGF-β truncado de tipo II, para inhibir específicamente la señalización de TGF-β. La fibrosis hepática en estas ratas se detuvo espectacularmente durante el tratamiento DMN en comparación con grupos de control. Otros estudios han confirmado que la supresión de TGF-β conduce a la reducción de la del desarrollo de la fibrosis hepática 9,10. El modelo también se utilizó en un estudio global perfiles de genes para identificar otros marcadores de fibrosis y proteínas que podrían ser utilizados como dianas de fármacos para la terapia anti-fibrótico 11.
Otros agentes químicos utilizados para inducir la fibrosis del hígado son: tioacetamida (TAA) yctetracloruro de Arbon (CCl4). TAA fue utilizado por primera vez en ratas y luego en ratones 12. Las ventajas de este modelo incluyen: facilidad de administración químico en el agua, la reproducibilidad del modelo con característica cirrosis micronodular y cambios bioquímicos potable. Las desventajas incluyen: el largo período de tiempo de 3 meses para la fibrosis hepática para desarrollar y la falta de comprensión del mecanismo molecular para la inducción de la fibrosis hepática. En cuanto a la CCL 4, su uso ha disminuido por las siguientes razones: que no imita la enfermedad de hígado humano, tienen efectos nocivos sobre la capa de ozono, causa dolor y angustia a los animales, es muy tóxica para los seres humanos y requiere precauciones adicionales en su manejo y eliminación 13,14.
Prolongada obstrucción del conducto biliar (por la intervención quirúrgica) como modelo experimental para la cirrosis hepática se informó por primera vez por Kountouras et al. 15. Este método no es tóxico para los seres humanos y animales. MARIDOin embargo, el tiempo requerido para la fibrosis hepática de desarrollar varía. Una revisión de 30 informes por Marques et al. 16, encontró que se necesitaba de siete días a cuatro semanas después de la cirugía para la fibrosis hepática se desarrolle. Los cambios patológicos descritos son similares a los de la fibrosis biliar crónica humana y el modelo serían más adecuados para los investigadores interesados en esta área.
En resumen, la administración intermitente de una dosis constante de DMN en la rata durante 4 semanas produce la fibrosis hepática que imita la enfermedad humana. Las ratas que recibieron muestran el desarrollo progresivo del daño hepático y la fibrosis del parénquima 4,17. La progresión y la gravedad de la enfermedad pueden ser controlados a través de muestras de sangre o sacrificio de los animales en puntos específicos de tiempo y el efecto es altamente reproducible 18. Así, el modelo se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de la fibrosis hepática y la cirrosis así como para la detección de potenciales agentes anti-fibróticos 10,19,20.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de cuidado y uso de animales de la Facultad de Ciencias Aplicadas, Temasek Polytechnic.
1. Preparación de DMN
- Pipetear 200 l de DMN (1 g / ml de solución madre) y añadir 19,8 ml de PBS para preparar la solución de DMN 10 mg / ml para la inyección.
Nota: DMN es cancerígeno. Utilizar una campana de extracción para preparar el DMN y realizar las inyecciones de animales.
2. inyección intraperitoneal de DMN
- Usar ratas Wistar macho con un peso promedio de 150 a 200 g. Aclimatar ratas para 4 - 7 días antes del inicio del experimento.
- Mantener las ratas a temperatura ambiente de 22 ± 1 ° C, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad ciclos. Proporcionar comida para ratas y agua ad libitum.
- Medir la ingesta diaria de alimentos y agua. Medir el peso corporal semanal.
- Calcular la cantidad de DMN para cada rata basado en una dosis de 10 mg / kg de peso. Utilice una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 25 to dibujar el volumen calculado de la solución de DMN en la jeringa.
- Frenar la rata de inyección intraperitoneal 21.
- Con la rata correctamente sujetos, introducir la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen, retroceder el émbolo de la jeringa (nada debe ser aspirado) para comprobar la correcta colocación de la aguja dentro de la cavidad abdominal e inyecte lentamente solución DMN.
- Cuando se ha administrado la dosis de DMN, retirar lentamente la aguja y disponer en el contenedor de objetos punzantes.
- Llevar a cabo las inyecciones intraperitoneales de DMN durante 3 días consecutivos por semana durante 4 semanas. Administrar las inyecciones en la misma hora cada día. Re-calcular la dosis basándose en el peso corporal al comienzo de cada semana de inyecciones.
- Recoger la sangre de la vena de la cola semanalmente para medir parámetros bioquímicos: alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) 22.
- Medida de la ALT sérica y AST usando un veterinario comercialPrueba del aparato Química.
3. El examen macroscópico y cosecha de hígado
- La eutanasia a las ratas por inyección intraperitoneal de pentobarbital en una dosis de 100 mg / kg de peso. Asegurar la muerte mediante la comprobación de la falta de latido del corazón.
- Prepararse para el post-mortem y evaluar la condición del animal como se describe por el Parkinson et al. 23 Place ratas muertas a bordo de la disección en decúbito dorsal con el abdomen hacia arriba.
- Desinfectar y humedecer la piel con etanol al 70%.
- Con unas tijeras, haga una incisión en la piel de toda la longitud de la zona ventral desde el ano hasta la barbilla, y reflejan la piel. Con las tijeras, una incisión en la pared abdominal desde el ano hasta el cartílago xifoides, para exponer las vísceras abdominales.
- Examinar los órganos abdominales in situ para verificar cualquier anomalía. Tenga en cuenta los cambios en el color, el tamaño, la ubicación de los órganos y la presencia de líquido en la cavidad peritoneal. Examinarla consistencia de los órganos y tenga en cuenta la presencia de cualquier olor.
- El uso de tijeras y pinzas, diseccionar todo el hígado libre de sus ligamentos y los archivos adjuntos.
- Comience en el hilio donde se une a la membrana y trabajar para liberar a todos los lóbulos del hígado de los archivos adjuntos. Corte con cuidado todos los ligamentos y los vasos sanguíneos.
- Transferir el hígado en una placa de petri y se pesa el hígado.
- El uso de un bisturí, cortar 2 - 5 mm de espesor secciones de lóbulos hepáticos. Por coherencia, siempre tomar muestras de la misma lóbulo hepático. Tome una cuña de 5 mm de diámetro de grosor, desde el lóbulo lateral derecho 24 de aproximadamente 1 cm desde el borde del lugar lobe.Immediately en 10% de formalina tamponada para la fijación. Asegúrese de que el tejido al volumen de formalina es de 1:10 o más.
- Cosecha e inmediatamente congelar porciones (utilizando nitrógeno líquido) de los lóbulos del hígado en este punto, si es necesario para otros estudios. En cuanto a (3,8), muestra del mismo lóbulo hepático para la consistencia.
- Fijar las muestras de hígado en 10% de formalina tamponada durante un mínimo de 24 hr.
- Después de la fijación, recortar el hígado, colocar en casetes y cargarlos en el cesto del procesador automatizado de tejidos.
- Coloque la cesta con cintas en la primera estación, que contiene 10% de formalina tamponada. Asegúrese de que los casetes están completamente sumergidos. Pueden permanecer en esta cámara durante un máximo de 12 horas hasta que comience el ciclo.
- Programar el procesador de tejidos para girar las cassettes para 1 hr cada uno, a través de estaciones sucesivas que contienen las siguientes soluciones: etanol a concentraciones de 50%, 70%, 90%, 100% (2 estaciones), xileno (2 estaciones) y parafina líquida ( 2 estaciones).
- La transferencia de las muestras de hígado en el baño de cera de la estación de incrustación. Asegúrese de que la máquina de incrustación se conecta al menos una hora antes.
- Utilizando unas pinzas pre-calentado (65 ° C), retire cada cassette de la wBaño de hacha y lugar sobre la placa caliente (65 ° C) de la máquina de incrustación. Dispense cantidad suficiente de parafina líquida en el molde base de acero inoxidable (pre-calentado a 65 ° C) hasta la mitad. La transferencia de la sección del hígado de la casete en el molde. Asegúrese de que la muestra se coloca con la superficie de corte (que se examinaron microscópicamente) plana en la parte inferior del molde.
- Llenar el molde por completo con parafina líquida, montar el casete vacía en la parte superior y colocar el molde sobre la placa 4 ° C de la máquina de incrustación que se enfríe durante al menos 30 minutos.
- Compruebe que la cera se haya enfriado y solidificado, y retire el bloque de parafina del molde. El bloque debe salir fácilmente y no se adhieren o se romperá. Si esto sucede, derretir el bloque y repetir este paso. El bloque de parafina puede ser seccionado, una vez que se solidifica. Los bloques pueden ser almacenados a temperatura ambiente durante muchos años.
- Coloque el bloque de parafina en el microtomo y la sección a las 10 micras de espesor hasta que la capa de cerase retira suficientemente para que el tejido hepático incorporado para ser visible.
- Cambie el ajuste en el micrótomo para cortar a las 5 micras de espesor. Con unas pinzas, recoger una sección bien cortado tomándolo por el borde y flotar con cuidado la sección en el baño de agua a una temperatura de 40 ° C.
- Con cuidado, coloque un portaobjetos de vidrio limpio en la sección flotante y levantarlo sobre la superficie de la lámina de vidrio. Colocar el portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 37 ° C durante la noche.
5. Masson Trichrome tinción
- Antes de aplicar las manchas, el tratamiento de las diapositivas para eliminar la cera y rehidratar los tejidos de la siguiente manera:
- Sumergir las secciones en xileno durante 5 min. Repetir 2x.
- Sumergir las secciones en 100% de etanol durante 3 min. Repita 1x.
- Sumergir las secciones durante 1 min cada uno en las siguientes soluciones de etanol: 90%, 80% y 70%.
- Enjuague el portaobjetos bajo el agua del grifo para eliminar todo el etanol existentes en la diapositiva.
- Sumergir los portaobjetos en hierro hematoxilina durante 10 min para teñir el núcleo.
- Enjuagar los portaobjetos con agua para eliminar el exceso de tinte de la diapositiva.
- Sumergir los portaobjetos en Biebrich Scarlet-fucsina ácida durante 2 minutos para teñir el citoplasma.
- Enjuague los portaobjetos con agua.
- Colocar los portaobjetos en solución de ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico durante 10 minutos para promover la absorción de Azul de anilina. Cambie la solución de ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico después de 2 rondas de uso.
- Colocar los portaobjetos en solución de azul de anilina de 10 min para teñir las fibras de colágeno.
- Enjuague el exceso de colorante con agua y colocar los portaobjetos en la solución de ácido acético al 1% durante 1 min para permitir la diferenciación se lleve a cabo para hacer que el color de la corredera más delicado y transparente.
- Enjuague los portaobjetos con agua y proceder a deshidratar los cortes de tejido. Las etapas de deshidratación son los siguientes:
- Sumergir los portaobjetos sucesivamente durante 10 s cada vez, en el siguiente concentrations de etanol: 70%, 80%, 95% y 100%.
- Sumergir los portaobjetos durante 30 seg en 100% de etanol. Repita 1x.
- Enjuagar los portaobjetos a través de 3 estaciones de xileno durante 5 minutos cada uno para eliminar el etanol.
- Montar una hoja de cubierta de vidrio sobre la muestra con medio de montaje (por ejemplo, medio de montaje DPX) y dejar secar.
Nota: DPX es una resina sintética que se seca rápidamente, conserva mancha y protege la sección de tejido.
6. La fibrosis que alcanzaron en las secciones Trichome manchadas de Masson de Hígado
- Tener un patólogo veterinario evaluar la gravedad de la fibrosis de acuerdo con la fibrosis puntos 25. Sería óptimo si la puntuación de la fibrosis se realiza por dos o tres patólogos de forma independiente en una forma ciega. En tal escenario, obtener una puntuación final después de la discusión y el Grupo de Revisión de resolver cualquier diferencia en la puntuación.
| Puntuación | Descripción |
| 0 | sin la fibrosis |
| 1 | expansión fibrosa de algunas áreas del portal, con o sin septos fibrosos corta |
| 2 | expansión fibrosa de la mayoría de las áreas del portal, con o sin septos fibrosos corta |
| 3 | expansión fibrosa de la mayoría de las áreas del portal, portal de vez en cuando al portal (PP) de puente |
| 4 | expansión fibrosa de áreas de portal con marcado de puente (portal a portal (PP), así como portal a la central (PC) |
| 5 | Marcado puente (PP y / o PC) con nódulos ocasionales (cirrosis incompleta) |
| 6 | Cirrosis, probable o definitiva |
Tabla 1: puntuación de Fibrosis utiliza para leer las secciones Trichome manchado hígado del 25 Masson.
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Representative Results
DMN ratas tratadas pierden peso y se vuelven menos vigorosa con la capa del pelo rizado. Hay una pérdida significativa en el peso corporal medio de las ratas tratadas con DMN; primera detectable después de 2 semanas de tratamiento DMN, y esta diferencia se mantiene a través de las semanas 3 y 4 después del tratamiento DMN (Figura 1a). A medida que las ratas reciben DMN sobre sucesivas semanas, daño al hígado hace que se vuelva más pequeño. El índice de hígado; que es el porcentaje de peso del hígado en el peso corporal final fue significativamente menor para las ratas tratadas con DMN (Figura 1B).
Figura 1: a) Los pesos corporales de las ratas tratadas con DMN. Los datos se representan como la media ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 en comparación con el grupo control normal b) Índice de hígado.; por ciento en peso del hígado en el peso corporal final de DMN ratas tratadas después de 4 semanas de tre DMNatment. Los datos se representan como la media ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 en comparación con el grupo control normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En el sacrificio, después de 4 semanas de tratamiento DMN, el hígado es más pequeño y más difícil (Figura 2a) en comparación con los de los animales de control coincidentes en edad (Figura 2b). La fibrina puede estar presente en la superficie del hígado y los lóbulos hepáticos adyacentes se adhieren. Alrededor del 20% de las ratas tienen ascitis.
Figura 2: a) hígado de una rata después de 4 semanas de tratamiento DMN b) de hígado de rata control emparejado edad.. En (a) el hígado es encogido, firme y pálido con un tinte amarillento, en comparación con el hígadode su control emparejado edad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Lesión en el hígado causa un aumento de la permeabilidad de la membrana celular de los hepatocitos. El aumento de ALT y AST en suero son indicadores de daño de los hepatocitos. ALT en suero (Figura 3a) y AST (Figura 3b) del grupo tratado con DMN son significativamente mayores que el grupo de control después de las semanas 2 y 4 de la inyección DMN. los niveles de ALT y AST en suero aumentan típicamente después de cada semana de tratamiento DMN.
Figura 3: a) alanina aminotransferasa (ALT) y b) aspartato aminotransferasa (AST) los niveles de las ratas tratadas con DMN en las semanas 0, 2 y 4 después de la última inyección de DMN. Los datos son represented como el medio ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 en comparación con el grupo control normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El examen histológico de los hígados de ratas tratadas DMN muestran que hay un aumento progresivo y la expansión de septos fibrosos, con pérdida de hepatocitos, con el tiempo en comparación con las ratas de control. tinción de Masson Trichome se utiliza comúnmente para resaltar los depósitos de colágeno en el tejido hepático: éstas se tiñen de color azul.
Figura 4: Las microfotografías de cortes de hígado teñidos con Masson Trichome de: a) la sección del hígado de una rata de control normal, b) sección del hígado de una rata después de recibir de 1 semana de dimethylnitrosamine (DMN); c) la sección de hígado de una rata después de recibir 2 semanas de DMN. Hay expansión fibrosa de la mayoría de las áreas del portal con el portal de vez en cuando a portal puente. D) sección del hígado de una rata después de recibir las 3 semanas de DMN. Tenga en cuenta la expansión fibrosa de áreas de portal con marcada portal a portal, así como portal a e hígado sección central de puente.) De una rata después de recibir 4 semanas de DMN. Hay cirrosis con la formación de nódulos. El hígado de control es de entre el grupo sacrificado junto con las ratas después de 4 semanas de la inyección de DMN. Hay un patrón de aumento progresivo del índice de fibrosis de 0 en (a); 2 en (b); 3 en (c) 4 en (d) a 5/6 en (e). Todas las fotomicrografías se tomaron a un aumento de 40X con 1 unidad de longitud de la barra equivalente a escala de 100 micras. Por favor clamer aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito un método para hacer un modelo animal de fibrosis hepática y para evaluar la severidad de la fibrosis hepática. Es importante aplicar la dosis correcta de DMN y cumplir con el programa de inyecciones intraperitoneales semanales. A medida que avanza el experimento, es crucial sopesar las ratas y volver a calcular la dosis al comienzo de cada semana de inyecciones DMN. Tenga en cuenta que DMN es tóxico y debe ser manejada en el armario de humos. Llevamos a cabo las inyecciones intraperitoneales en el armario de humo también. Con la necesidad de inyecciones repetidas, la sujeción correcta y la técnica de inyección es importante para evitar la introducción de contaminantes y daños en los órganos internos. Rara vez tenemos la mortalidad de las inyecciones intraperitoneales.
Las ratas deben ser monitorizados 2x por día durante todo el período experimental. Durante la última semana de la inyección DMN, los animales deben ser observados con más frecuencia y de cerca para detectar signos moribundas. Esta es la peridesde cuando el daño hepático es más grave y será inapetente ratas afectadas, pierde el peso corporal y el estado. 25 - 40% de las ratas puede resultar gravemente enfermo durante este período y morir si no hay una intervención veterinaria. Por lo tanto, una estrecha vigilancia permite al investigador para evaluar la condición del animal y el plan de finalización apropiada para el experimento con el fin de que los órganos pueden ser recién cosechadas de una rata sacrificados en lugar de perderse para la descomposición de la muerte inesperada.
Hemos encontrado medición semanal de los niveles de ALT y AST ser indicadores útiles de la progresión del daño hepático. También hemos observado que AST es menos específica que la ALT y atribuir esto a su liberación de eritrocitos dañados y el tejido muscular, además de hígado.
Asegúrese de que un volumen suficiente de sangre se recoge para producir el volumen requerido de suero para el análisis. Recopilamos normalmente 200 - 300 l de sangre por rata.
Durante el collection del tejido del hígado para el examen histológico, se recomienda obtener la muestra desde el mismo lóbulo. Esto se hace después de comprobar que los cambios en el hígado son uniformes. DMN causa cambios generalizados en el hígado. En las primeras etapas del estudio, se tomaron muestras de los lóbulos lateral y medial izquierdo, así como el lóbulo medio derecho. No se observó ninguna diferencia en los cambios microscópicos entre estos lóbulos.
secciones de hígado deben ser fijadas en 10% formalina tamponada durante al menos 24 horas y se procesan poco después. La inmersión prolongada más allá de una semana puede resultar en que el tejido se vuelva quebradizo y difícil de sección después de la inclusión en parafina. Cortar 5 micras secciones delgadas adecuadas requiere práctica y paciencia. Las secciones que son evaluados para ser adecuados con el ojo desnudo (Paso 4.11) se pueden examinar con el microscopio para comprobar que no tienen defectos como pliegues o roturas dentro de la sección. El procedimiento de tinción se ha completado mejor de acuerdo to los períodos de tiempo para la inmersión de diapositivas en cada paso sin pausas de descanso. Durante el proceso de tinción, aseguran que las secciones se mantienen húmedos en todo momento y transferidos de una solución de tinción a la siguiente, tan pronto como sea posible.
La evaluación de las secciones de Masson Trichome teñidas para el grado de fibrosis requiere la entrada de un patólogo veterinario. Él / Ella es un miembro del equipo cruciales que deben ser parte del estudio desde el principio, ya que él / ella sería capaz de asesorar y participar en la recolección correcta de órganos en todas las fases del experimento. Así, el actual estándar de oro para la puntuación de la fibrosis hepática es la evaluación de las secciones de tejido teñidas apropiadamente por un patólogo. Aunque sería óptimo tener la entrada de más de un patólogo, esto puede no ser posible en las organizaciones más pequeñas. En tales casos, la objetividad se puede mejorar mediante el uso de tecnología de formación de imágenes 26. Hemos encontrado que los resultados de la tecnología de imágenesson comparables a la puntuación patológica (datos no publicados), y recomendar que se puede utilizar como un método adicional de evaluación.
En resumen, el modelo inducido por DMN de la fibrosis hepática tiene muchas ventajas sobre otros modelos animales. Es un modelo relativamente fácil de hacer, ya que no requiere de habilidades quirúrgicas. DMN es ambientalmente más seguro y menos tóxico para los seres humanos y animales que CCl 4 y toma un tiempo más corto para inducir la enfermedad de TAA. En comparación con enfermedad hepática producida por CCl4, TAA, y la ligadura del conducto biliar, DMN produce una representación más cercana de la fibrosis hepática humana. Por estas razones, prevemos que el modelo continuará siendo utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de la fibrosis hepática, así como para la detección de potenciales agentes anti-fibróticos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
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