Introduction
החלבונים הם מקרומולקולות הנפוצים ביותר בתאים, והם ממלאים תפקיד חיוני בכל התהליכים הביולוגיים כמעט. הפעילות הביולוגית של רוב החלבונים דורש המתקפלים שלהם לתוך, ושמירה, המבנים תלת מימדי הילידים. חלבונים עם תצורות סוטות לא רק לאבד פונקציות הרגילות שלהם, אלא גם לעתים קרובות מהווים מיני oligomeric מסיסים או אגרגטים הפוגעים פונקציות של חלבונים אחרים רעילים 1,2 תאים. כדי לנטרל misfolding חלבון, תאים להעסיק שני מלווים מולקולריים, אשר מסייעים פוליפפטידים פרשו או חלקית מקופל להגיע קונפורמציה האם שלהם, מסלולים שפלים, המבטלים חלבוני misfolded 3. בהתחשב במורכבות והטבע סטוכסטיים של תהליך הקיפול, misfolding חלבון הוא בלתי נמנע, זה לא יכול להיות הפוך במקרה של מוטציות, שגיאות biosynthetic, ופוסט translational נזקים 1. לפיכך, התאים בסופו של דבר להסתמך על degradatמסלולי יון כדי לשמור על איכות החלבון שלהם.
חשיבותה של בקרת איכות חלבון הסלולר (PQC) מערכות מודגשת על ידי שכיחות המחלות misfolding-חלבון, כולל סרטן, סוכרת, הפרעות ניווניות רבות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, מחלת הנטינגטון (HD), ו ataxias spinocerebellar (SCA) 4,5. לדוגמא, מוטציות p53 המדכאים גידולים הוא הנגע היחיד ביותר הגנטי לעתים קרובות בגידולים, הקשורים ~ 50-70% מכלל המקרה 6. חלק ניכר של מוטציות p53 הם מוטציות missense המשנים את הקונפורמציה של p53, המוביל להיווצרות של אגרגטים 7. יתר על כן, חלבונים עם מתיחות polyQ המתרחבות גנטית פתולוגית הקשורה HD ו SCA. מחלות פרוגרסיבי ולעתים אף קטלניות אלה מניפסט כאשר אורכו של קטע polyQ בחלבונים הפגועים עולה על thres מסויםלהחזיק, ואז הוא הופך יותר ויותר קשה ככל שהאורך של מתיחת polyQ מאריך 8.
גישה אטרקטיבית לטיפול במחלות אלה היא לחזק טיפולי מערכות PQC הסלולר, במיוחד את המסלולים השפלים. עם זאת, את המסלולים המעורבים פירוק של חלבונים פגומים, במיוחד אלה בתאי יונקים, להישאר ממעטים להבין. למרות שזה הוכר כי הפרוטאזום יש חשיבות קריטית עבור הפירוק של חלבוני misfolded, סוגיה חיונית נשארה בלתי מוגדרת: איך misfolded חלבונים מוכרים במיוחד וממוקד שפלה. יתר על כן, למרות מערכות PQC זוהו תאים סלולריים כולל הציטופלסמה, הרטיקולום endoplasmic, ואת מיטוכונדריון, מערכות PQC בגרעין עדיין אינן ברורות 2.
מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי המעבדה שלנו זיהו מערכת שתופש מדרדרת מגוון של חלבונים misfolded בגרעיןשל יונקים תאים 9. מערכת זו מורכבת של חלבון פרומיילוציטית (PML), חלבון גרעיני חבר מוטיב המכילים המשולשת (TRIM) המשפחה חלבון, RNF4, תחום-RING המכיל חלבון. PML, וכמה חלבונים TRIM אחרים, להחזיק SUMO (המשתנה 'היוביקוויטין דמוי קטן) פעילות האנזים E3, אשר הופך לפשוט את הספציפיות והיעילות של חלבון SUMOylation 10. RNF4 שייך לקבוצה קטנה של ליגאזות היוביקוויטין SUMO במיקוד (STUbL), אשר מכילים מוטיבים סומו אינטראקציה אחד או יותר (SIMS) בנוסף תחום RING שמקנה להם את פעילות האנזים היוביקוויטין 11. מצאנו כי PML במיוחד מזהה חלבוני misfolded דרך אתרי הכרת מצע דיסקרטיים שיכול להבחין ייחודיות על חלבוני misfolded. עם מחייב, תגי PML misfolded חלבונים עם פולי-שרשראות של SUMO2 / 3, שני חלבונים SUMO יונקים כמעט זהה כי יכול להיווצר פולי-שרשראות בשל קיומו של אתר SUMOylation פנימי. Sחלבונים misfolded UMOylated מוכרים ולאחר מכן על ידי RNF4, אשר מוביל לזילות ubiquitination ו proteasomal שלהם. בנוסף, אנו הראו כי מערכת PML-RNF4 חשוב להגנה מפני ניוון מוחיים, כמו מחסור PML מחריף הפגמים התנהגותיות נוירו של במודל של עכברים של SCA סוג 1 (SCA1) 9.
כדי להבחין פירוק חלבונים מן המנגנונים תאיים אחרים שעשויים לווסת את רמות חלבון, ושיעור עזיבת חלבון נמדד 9. בין השיטות הנפוצות ביותר כדי לקבוע מחזור חלבון הם מרדף דופק cycloheximide (chx) מרדף. שתי שיטות אלו בודקות לאורך זמן, בהתאמה, את החלבונים שכותרתו רדיואיזוטופיים של ריבית בתאי תרגום-בקיא וחלבונים קיימים מראש כולל של ריבית בתאים-עכבות תרגום. עם זאת, אתגר גדול ללימוד חלבונים פתוגניים misfolding נוטה הוא כי זמן מחצית החיים של חלבונים אלה יכולים להיות מאוד long. לדוגמה, Ataxin-1, Ataxin-7, huntingtin, α-synuclein, ו TDP-43 כל זמן מחצית חיים של יותר מ 12 עד 24 שעות 9,12-16. שיעורי התחלופה האיטיים של החלבונים האלה להוציא את השימוש בניתוח מרדף chx כיוון שתא מחסה חלבונים אלה לא יכול לשרוד עיכוב תרגום ממושך, במיוחד משום שחלבוני misfolded עצמם יכולים להיות רעילים לתאים. הניתוח הדופק מרדף עם תיוג איזוטופי עשוי גם להיות מאתגר עבור חלבונים כי הם מאוד צבירה נוטה. רוב מבחני הדופק מרדף להסתמך על immunoprecipitation להפריד את החלבון של עניין מכל חלבונים אחרים אשר גם מסומנים רדיואקטיבית. הליך זה בדרך כלל כולל נהלי immunoprecipitation לשטוף ממושך, שבמהלכו SDS-מסיסי אגרגטים יכולים ליצור, מה שהופך את הניתוח עם SDS-PAGE אלקטרופורזה מדויק.
הנה פרוטוקול לנתח חלבוני misfolded גרעין עם תחלופה איטית מתוארת 9. צורה פתוגניים של Ataxin-1 (Atxn1) שמכיל מתיחה של 82 glutamines (Atxn1 82Q) משמש למטרה זו 8. כאשר לידי ביטוי בתאים, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (GFP) היתוך של צורות Atxn1 82Q תכלילים גלוי מיקרוסקופית בגרעין (איור 1 א). ניתוח מרדף דופק מגלה כי זמן מחצית החיים של Ataxn1 82Q הוא מעל 18 שעות 9. Atxn1 82Q מורכב מינים עם תצורות misfolded של מאפיינים שונים, כמו גם מינים עם קונפורמציה הילידים. סביר להניח כי מינים אלה מפורקים בשיעורים שונים, ובכך יש לנתח בנפרד. Lysates מ 82Q-GFP להביע תאי Atxn1 הם מופרדים לתוך NP-40-מסיס (מסיס או NS, מייצג חלבוני ילידים סביר או חלבוני monomeric misfolded / oligomeric) ו- NP-40-מסיסים (NI, מצטבר / misfolded) חלקים. השלב האחרון ניתן לחלוקה נוספת לתוך SDS-מסיסים (SS; אגרגטים סדר סביר) או SDS-עמיד (SR; סיבי עמילואיד סבירשברים) (איור 1 ב). שברי NS האס יכולים להיות מנותחים על ידי SDS-PAGE ואחריו מערבי סופג, ואילו חלק SR יכול להיות מזוהה על ידי מבחני פיגור המסנן ואחריו immunoblotting. מרדף chx בשילוב עם שיטת חלוקת חומרי הניקוי, וגילה כי זמן מחצית החיים של SS Atxn1 82Q הוא הרבה יותר קצר מזה של NS Atxn1 82Q והמוחלט Atxn1 82Q (איור 2 א), המציין כי חלק SS ניתן להכיר בקלות והשפיל בתאים 9. לכן, שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה של חלבונים misfolded ולהשוות דפוס השפלה שלהם.
כמו כן, אנו מתארים שיטה כי הוא מתאים להקרנת תפוקה גבוהה לזיהוי מולקולות או תרכובות קטנות שיכול להשפיע על הפירוק של חלבוני misfolded. שיטה זו מבוססת על מוטצית ערער conformationally של בלוציפראז גחלילית (LucDM) 17, מצע מלווה מודל. יש לנו פתילד LucDM לאות לוקליזציה גרעיני (NLS), שנועד לבחון את מערכות PQC בתא הסלולרי הזה, ו- GFP (NLS-LucDM-GFP) לנוחות זיהוי. צורות NLS-LucDM-GFP אגרגטים גרעיניים גלויים מיקרוסקופי אצל אחוז קטן של תאים (איור 3 א). בדומה Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-אבל לא עמיתו wild-type שלה NLS-LucWT-GFP-הוא שונה על ידי SUMO2 / 3 ומוסדר על ידי מסלול PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP מהווה גם SS ומינים SR, למרות הכמויות היחסיות של SS ומינים SR הן מינימליות לעומת NS, באמצעות התנאים המתוארים בפרוטוקול 3 להלן. כדי לפשט את assay, אנחנו רק לנתח SDS LucDM המסיס (כולל הוא את NS ושברי SS) על ידי SDS-PAGE ומערב כתם. חשוב לציין, assay מרדף chx הראה כי זמן מחצית החיים של SDS-מסיס NLS-LucDM-GFP הוא הרבה יותר קצר מזה של עמיתו wild-type שלה (איור 3), דבר המצביע על כך LucDM הוא מצע ספציפי עבור מערכת שתופש מדרדרתחלבוני misfolded.
השפלתו של LucDM-GFP גורמת לירידה משמעותית אותות קרינה כוללים. לכן, פיתחנו גם פרוטוקול זיהוי בזמן אמת של microplate הסלולר LucDM-GFP באמצעות assay הקרינה מבוססי. רבי מסך תפוקה גבוהה (HTS) מערכות מפותחות עבור תרופות או גני שינוי אגרגטים הסלולר ואת הכדאיות הסלולר נגרם על ידי חלבונים סוטים 18-20. עם זאת, מעט מאוד HTSs נועד במיוחד למיקוד שפל בתאי יונקים. פרוטוקול זה משמש כמערכת חזקה לניתוח בקנה מידה הגדולה המהירה של התופעות של ביטוי חלבון, מציאה, וטיפול תרופתי על פירוק חלבונים הסלולר misfolded. שימוש בתאי הלה כמו למשל, נתאר את הפרוטוקולים לניתוח שני חלבונים misfolded אלה. המבחנים יכולים להיות מיושם גם שורות תאים אחרות, אם כי תנאי transfection ומהלכים זמן ייתכן שיהיו צורך מותאם שורות תאים בודדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת המגיב
- הכן חיץ תמוגה התא (50 מ"מ טריס, 8.8 pH, 100 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl 2, 0.5% NP-40). מוסף 2 מ"מ DTT, קוקטייל פרוטאז השלם 1x, ו -250 IU / ml benzonase לפני השימוש.
- הכן חיץ גלולה (20 מ"מ טריס, 8.0 pH, 15 מ"מ MgCl 2). מוסף 2 מ"מ DTT, קוקטייל פרוטאז השלם 1x ו -250 IU / ml benzonase לפני השימוש.
- הכן חיץ רתיחה 3x (6% SDS, 20 מ"מ טריס, pH 8.0). מוסף 150 מ"מ DTT לפני השימוש.
- כן בינוני DMEM נמוך קרינה עבור מבחנים באמצעות קורא קרינת microplate. מערבבים 25 גלוקוז מ"מ, 0.4 גליצין מ"מ, 0.4 ארגינין מ"מ, 0.2 מ"מ ציסטאין, 4.0 גלוטמין מ"מ, 0.2 היסטידין מ"מ, 0.8 isoleucine מ"מ, 0.8 מ"מ לאוצין, 0.8 מ"מ ליזין, 0.2 מ"מ מתיונין, 0.4 פנילאלנין מ"מ, 0.4 סרין מ"מ, 0.8 תראונין מ"מ, 0.078 טריפטופן מ"מ, 0.4 מ"מ טירוזין, 0.8 ולין מ"מ, 1.8 מ"מ CaCl 2, 0.81 מ"מ MgSO 4, 5.33 מ"מ KCl, 44.0 מ"מ NaHCO 3, 110 מ"מ NaCl, 0.9 מ"מלאא 2 PO 4. התאם את ה- pH של הפתרון באמצעות HCl או NaOH ל- pH 7.4. לעקר את המדיום באמצעות סינון.
הערה: בינוני זה מכיל רכיבים של מדיום DMEM הרגיל עם גלוקוז גבוה חוץ מזה פה (NO 3) 3, ויטמיני פנול אדום מושמטים. פנול אדום, ריבופלאבין ו pyridoxal במדיום תרבות קבוע DMEM להתערב באופן משמעותי עם זיהוי של אותות הקרינה 21. בינוני תרבות ללא רכיבים אלה הוא קריטי עבור הדמיה לחיות תאים GFP מוצלח. המדיום הוא יציב במשך 12 חודשים, כאשר הם מאוחסנים בקירור.
Assay הביזוי 2. GFP Atxn1 82Q
- פלייט כ 3 x 10 5 תאים הלה לתוך 35 צלחות מ"מ עם המדיום DMEM בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS), כך שלאחר O / N תאים culturing לגדול משילוב של גידול 40-60% בזמן transfection.
הערה: מספר הצלחות הדרושות מבוסס על מספר נקודות זמן והטיפולים דescribed להלן. - Transfect הלה התאים עם 0.3 מיקרוגרם של Atxn1 82Q-GFP / pRK5 פלסמיד לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן 9. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל מגיב דנ"א transfection ו aliquot זה עבור כל טוב.
- 4-5 transfection פוסט hr, לבחון תאים חיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490. חזרו תאים בחזרה חממה לאחר הדמיה.
הערה: בדוק את שני אותות GFP מתפזרת כתמים קטנים של אותות ה- GFP בגרעין בשלב זה. - הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום ולהוסיף 2 מ"ל DMEM טרי המכיל chx 50 מיקרוגרם / מ"ל. פנקו את התאים עבור 0, 4, 8, 12 ו -16 שעות עם chx לפני הקטיף. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום (10 מיקרומטר) בצלחת אחת שטופלה במשך 16 שעות כביקורת.
- קציר צלחת אחת של תאים בכל נקודת זמן. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקוםד לשטוף את הצלחות פעמיים עם 3 מ"ל בופר פוספט 1x קר כקרח (PBS). הצמד להקפיא את הצלחת על קרח יבש.
- לאחר שהנקודה בפעם האחרונה (16 שעות), לגרד את התאים קפואים (מכל המועדים לפי השעון) לתוך 150 μl של חיץ תמוגה תא קר כקרח וטופח על קרח למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה lysates תא בצנטריפוגה benchtop על 17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C..
- מעבירים את supernatant, המכיל NP-40-מסיסים (NS) חלבונים, כדי צינור אחר בעזרת פיפטה.
הערה: השתמש supernatants למדידת ריכוזי חלבון ידי assay ברדפורד במידת הצורך. - יש לשטוף את הכדורים על ידי ההוספה בעדינות כ 200 μl 1x PBS על הצינורות מבלי להפריע את הכדורים. מוציאים בזהירות PBS על ידי שאיפה ואקום או טפטפת. Re- להשעות אותם 150 חיץ גלול μl קר כקרח תא, ואחריו דגירת 15-30 דקות על קרח.
הערה: חלק גלולה מושעים מכיל NP-40 חלבונים מסיסים (NI). ראה איור 1B עבור תרשיםאיל חלוקת חומר ניקוי. - הוסף 75 μl של חיץ רותחים 3x לשברירי NS ו- NP-40 שברים מסיסים (NI) resuspended מכדורי. מחמם את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס על גוש חום למשך 5 דקות.
הערה: גושים של השברים המסיסים NP-40, נמוגים לאחר החימום ודוגמאות תתבהרנה. - הוסף חוצץ טעינת SDS-ג'ל aliquot של NS המבושל NI. טען נפח שווה של דגימות שנאספו מכל נקודות זמן ג'ל SDS-PAGE. המקבילה טעונה בנפח של כ 20 מיקרוגרם של NS ממדגם שנאספה הערת זמן 0.: NS, וכן SDS-מסיס (SS) חלבון מסיעתו NI, ניתן לפתור על ידי ג'ל מפריד SDS. לעומת זאת, SDS-עמיד (SR) אגרגטים מן השבר NI תקועים בארות טעינת ג'ל (איור 1B). כדי לשפר את זיהוי כתם המערבי, נפח כפול של NI ניתן לטעון.
- זיהוי NS ו SS Atxn1 82Q-GFP על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי- GFP ו chemiluminescence משופרת (ECL).
הערה: Atxn1 82Q בשבריר SS מושווה פחות בדרך כלל לשבר NS בעת שימוש בפרוטוקול זה. חשיפת ECL ארוכה דרושה אותות אופטימליים. - בדוק SR Atxn1 82Q מן השבר גלולה ידי מבחני פיגור מסנן באמצעות מנגנון dot-כתם (איור 1B). בקצרה, להקים מנגנון dot-כתם מחזיק קרום אצטט תאית 0.2 מיקרומטר. μl טען 80-120 של NI המבושל לבאר כל מנגנון dot-הכתם.
הערה: ככל כמויות קטנות בלבד של אגרגטים SR נוצרות בתאים, עבור assay כתם נקודה, לטעון נפח של השבר SR כי הוא כ 10-15 פעמים מהיקף השבר NS להשתמש לצורך ניתוח כתם המערבי.- לאחר סינון דגימות דרך הממברנה על ידי ואקום, אגרגטים Atxn1 82Q-GFP תקוע על הממברנה ניתן לאתרם באמצעות immunoblotting אנטי GFP 9,12,22.
הערה: ראה דיווחים קודמים 9,12,22 תיאור מפורט של assay פיגור מסנן. שלב זה הוא אופציונליבגלל SR Atxn1 82Q היא מזערית לעומת שברי ס"ס NS בעקבות transfection הקצר מתואר בפרוטוקול זה. בנוסף, הרמות של SR Atxn1 82Q בעיקר להישאר זהה לאורך מרדף chx (איור 2 ב). עם זאת, הוא עדיין חיוני כדי לבחון האם סכומי SS Atxn1 82Q מושפעים לאורך זמן עבור כל טיפול תרופתי או ביטוי גני ניסויים ראשוניים. מיני חלבון SS להישאר בבארות טעינת ג'ל SDS-PAGE יכולים להיות מזוהים על ידי כתם מערבי. עם זאת, שיטה זו היא פחות רגישה ומייצרת יותר תוצאות משתנות (איור 1B).
- לאחר סינון דגימות דרך הממברנה על ידי ואקום, אגרגטים Atxn1 82Q-GFP תקוע על הממברנה ניתן לאתרם באמצעות immunoblotting אנטי GFP 9,12,22.
Assay הביזוי 3. NLS-בלוציפראז-GFP שימוש SDS-PAGE ומערב כתם
- פלייט כ 3 x 10 5 תאים הלה לתוך 35 צלחות מ"מ עם המדיום DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). לאחר culturing O / N, מפגש של 40-60% הוא הגיע בזמן transfection. מספר הצלחות הדרושות מבוסס על מספר tנקודות וטיפולים IME כמתואר להלן.
- Transfect הלה התאים עם 1.0 מיקרוגרם NLS-בלוציפראז-GFP / pRK5 פלסמיד לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן 9. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל דנ"א מגיב transfection עבור aliquot של כל טוב.
- לאחר O / transfection N (כ -15 שעות), לבדוק תאים חיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490. חזרו תאים בחזרה חממה לאחר הדמיה.
הערה: אות ה- GFP הגרעינית מתפזרת ניתן להבחין ברוב של התאים (70%). אחוז קטן (5%) של תאים יש אגרגטים גרעיניים. - הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום ולהוסיף 2 מ"ל DMEM טרי המכיל chx 50 מיקרוגרם / מ"ל. פנקו את התאים עבור 0, 1.5, 3, 4.5 ו -6 שעות עם chx לפני הקטיף. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום נוסף (10 מיקרומטר) בצלחת אחת שטופלה במשך 6 שעות כמו שליטה.
- קציר צלחת אחת של תאים בכל נקודת זמן. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום לשטוף את הצלחות פעמיים עם 3 מ"ל בופר פוספט קר כקרח (PBS). הצמד להקפיא את הצלחת על קרח יבש.
- לאחר שהנקודה בפעם האחרונה (6 שעות) מסתיים, תאים קפוא ב כל זמני נקודות התחככו 150 μl של חיץ תמוגה תא קר כקרח וטופחו על קרח למשך 30 דקות.
- הוסף חוצץ טעינת ג'ל SDS כדי lysates התא כולו ריכוז סופי של SDS 2% ו -50 מ"מ DTT. דגירת דגימות על גוש חום 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לנתח NLS-בלוציפראז-GFP על ידי SDS-PAGE ומערב כתם באמצעות נוגדן אנטי GFP. טען נפח שווה של דגימות שנאספו מכל נקודות זמן ג'ל SDS-PAGE. היקף טעון מקבילה כ 20 מיקרוגרם של lysates התא כולו מן המדגם נאספו בזמן 0.
4. Assay הביזוי בזמן אמת של NLS-בלוציפראז-GFP שימוש קורא microplate פלואורסצנטי
- זרע כ 1 x 10 4תאי הלה לתוך צלחות תרבית רקמת 96, גם שחורות עם תחתית שקופה. לאחר culturing O / N, מפגש של 50-70% הוא הגיע בזמן transfection.
הערה: 60 μl של מדיום המכיל מושעה לחלוטין תאי הלה הם זורעים ישירות לתוך כל אחד. אל תוסיף צלחת בינונית או סלע נוסף קדימה ואחורה לאחר זריעה, אחרת תאים עשויים להיות מופצים באופן לא אחיד. - Transfect הלה תאים עם 0.05-0.1 מיקרוגרם של NLS-בלוציפראז-GFP / pRK5 פלסמיד 9 לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל מגיב דנ"א transfection ו aliquot זה עבור כל טוב. שלוש בארות עם תאים אינן transfected עם DNA, אשר ממשמש בקרת אותות קרינת רקע עבור כל תנאי טיפול.
הערה: דרך חלופית כדי להפחית וריאציה transfection היא transfect תאים לפני זריעה. עם זאת, חלק גדול של תאים transfected עם חלבון misfoldedהים להיכשל לצרף או להראות כדאיות מופחתת תוך שימוש בשיטה זו. סביר להניח כי חלק מן התאים לא יכול לסבול את הלחץ שנגרם על ידי עיכול טריפסין כאשר לבטא חלבונים misfolded רעילים. כתוצאה מכך, אות ניאון הכוללת מצטמצם משמעותי. - 20-24 שעות לאחר transfection, לבחון תאי החיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490.
- הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום. להוסיף כ 200 μl 1x PBS היטב כל ולאחר מכן לשאוב אותו כדי להסיר הסכום השיורי של מדיום DMEM.
- הוסף 60 μl של DMEM בינוני נמוך הקרינה עם FBS 5% ו -50 מיקרוגרם / מ"ל chx. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום נוסף (10 מיקרומטר) קבוצה אחת של דגימות. הגדר בשלושה עותקים של בארות עבור כל / מצב הטיפול.
הערה: טיפול MG132 כלול שולטת עבור השפלה proteasomal כי זה חיוני כדי לשלול גורמים אחרים שיכולים לגרום לירידה של fluoאות rescence, כולל מוות של תאים מרווה הקרינה. - מדוד את אותות הקרינה של ה- GFP מייד על קורא צלחת ניאון לאחר הוספת chx.
הערה: הגדרות מדידת תוכנה מוצגות בלוח 1. - קראו את הצלחת בכל שעה עד 8-10 שעות. לאחר הקריאה, להחזיר את הצלחת בחזרה חממת תרבית תאים.
- לייצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני. השתמש בערך ממוצע של רב קורא לכל גם עוצמת הקרינה. לנרמל הערכים של כל הנתונים מצביעים על הערכים הממוצעים של זמן 0 בקבוצות בהתאמה. מגרש את עוצמת הקרינה המנורמלת לאורך זמן כפי שמוצג באיור 4 א ו -4, ואיור 5, לוחות מימין.
- ביצוע ניתוח סטטיסטי של שיעורי השפלה בין שני תנאים באמצעות ANOVA דו סטרי עם מדידות חוזרות 23.
הערה: בניתוח זה, "עוצמת הקרינה" הוא המשתנה התלוי ואילו "treatmהתנאים אף אוזן גרון "ו-" זמן "הם שני הגורמים. במקום להשוות נתונים בנקודות זמן בודדים, דו כיוונית ANOVA עם מדידות חוזרות מנתח את ההבדל בין שתי קבוצות הטיפול שני במשך כל הזמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניתוח מצב יציב, גלויים מיקרוסקופי Atxn1 אגרגטים גרעיניים 82Q-GFP ניתן לצפות 30 - 50% של תאים הלה 20 שעות לאחר transfection (איור 1 א). ניתוח כתם המערבי של שברי NS ו SS באמצעות נוגדן אנטי GFP מציג להקה ברורה של Atxn1 82Q-GFP בין 100 kDa ו -150 סמני kDa, התואם את המשקל המולקולרי של החלבון (איור 1 ב). 82Q-GFP Atxn1 בשבריר SR ניתן לאתר באמצעות assay פיגור מסנן, או על ידי SDS-PAGE ומערב כתם כמינים בראש הג'ל לערום (איור 1B). לניתוח זמן מחצית חיים באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל, מרדף chx מתחיל 4-5 שעות לאחר transfection הראשונית לפני כל אגרגטים גרעיניים גדולים נוצרים. זמן מחצית החיים של Atxn1 82Q-GFP בשבריר SS הוא סביב 5 שעות, בניגוד קלה או ללא ירידה של Atxn1 82Q-GFP בשבריר NS מעל 16 שעות (איור 2 א). degradation של Atxn1 82Q-GFP מעוכב חלקית על ידי טיפול בתאים עם MG132 (איור 2 א). הראינו בעבר כי PML מגרה את ההשפלה של חלבון misfolded באמצעות קידום SUMOylation שלהם. כאן אנו משתמשים מציאת PML כדוגמא מסלול שפלה שינה. טיפול PML siRNA מאריך את זמן מחצית החיים של Atxn1 82Q-GFP בשבריר SS (איור 2 א). לא היו שינויים ברורים SR Atxn1 82Q-GFP מזוהים או שליטה או PML תאים siRNA שטופלו (איור 2B ו 2C).
עשרים שעות לאחר transfection, אגרגטים NLS-LucDM-GFP להיות גלויים מיקרוסקופי 5 - 15% של תאי הלה, אבל זה יכול להשתנות בהתאם לסכומים של דנ"א הם transfected (איור 3 א). זמן מחצית החיים של SDS המסיס NLS-LucDM-GFP הוא 2 - 3 שעות (איור 3 ב ו -3 ג). עוצמת הקרינה של תאי transfected גם פוחתת עםזמן על טיפול chx (איור 4 א ו -4). שש שעות לאחר טיפול chx, את עוצמת הקרינה מגיעה לשלב יציבה מפסיקה ירידה (איור 4 א ו -4). באותו נקודת זמן, מסיס NLS-LucDM-GFP נפגעת במידה רבה (איור 3 ב ו -3 ג), דבר המצביע על כך הקרינה הנותרים מופק מצטברים מינים עמידים השפלה. באופן עקבי, מצטברים, אבל לא מתפזרת, GFP ונשאר בתאי 9 שעות לאחר הטיפול chx (איור 4C). מעניין, transfection באמצעות סכום גבוה יותר של פלסמיד NLS-LucDM-GFP מייצר אגרגטים גרעיניים יותר, כמו גם בעצמה גבוהה יותר של קרינה נותרת, אם כי קצב ההידרדרות אינו מושפע (איור 4 א ו -4). שימוש באחת SDS-PAGE ואחריו קריאה כתם או קרינה מערביות, אנו מסוגלים לזהות את העיכוב של שפלת NLS-LucDM-GFP על ידי טיפול MG132 או PML siRNA (3C הדמוי, 4A, 4B, ו -5).
באיור 1. איתור של Atxn1 82Q-GFP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי חלוקה חומר ניקוי. (א) תאים הלה היו transfected עם Atxn1 82Q-GFP ו מגואלות DAPI. תמונות פרט ממוזגות מוצגות. בר סולם = 10 מיקרומטר. (ב) תרשים המציג את החלוקה של חומרי הניקוי, Atxn1-82Q לבטא בתאים כמתואר בפרוטוקול 2. סמני משקל מולקולריים מסומנים בצד השמאל של תמונות כתם המערביות של Atxn1-Atxn 82Q. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
66 / 54266fig2.jpg "/>
. Assay השפלה איור 2. Atxn1 82Q-GFP באמצעות חלוקה דטרגנט תאים הלה טופלו בעבר עם שליטה (-) או PML siRNA (A ו- C) או שטופלו האו"ם (B). התאים היו transfected עם Atxn1 82Q-GFP ומטופל עם chx בהעדר או בנוכחות MG132. שברים lysate תא נותחו על ידי SDS-PAGE ואחריו כתם המערבי (A, עבור NS ו SS שברים) או assay פיגור מסנן (B ו- C, עבור חלק SR) באמצעות נוגדן אנטי GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3. ניתוח של השפלה NLS-LucDM-GFP על ידי הקרינה microscopy ומערב כתם. (א) תאים הלה transfected עם NLS-LucDM-GFP הוכתמו DAPI. תמונות פרט ממוזגות מוצגות. בר סולם = 25 מיקרומטר. ראש החץ מצביע על תא עם אגרגטים גרעיניים. (B ו- C) הלה התאים היו transfected עם NLS-LucDM-GFP ואת היתוך בלוציפראז wild-type חלבון NLS-LucWT-GFP (B), או transfected עם שליטה או PML siRNA, ואחריו transfection עם NLS-LucDM-GFP ( C). תאים שטופלו עם chx ו MG132 כמצוין. lysates שלמות התא נותחו על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי- GFP. תמונה שונה מן הפרסום קודם עם רשות 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Assay פלורסנט איור 4. מבוססי microplate השפלה NLS-LucDM-GFP. תאים הלה זורעים על 96 צלחות גם היו transfected עם 0.05 מיקרוגרם (א) או 0.1 מיקרוגרם (B ו- C) NLS-LucDM-GFP ומטופל עם chx ב קיומו או אי קיומו של MG132. (A ו- B) בעוצמות של בארות קרינה שנמדדו בנקודות הזמן המצוינות (ממוצע הערכים ± סטיות תקן, n = 3). לוחות בצד שמאל להראות את קריאת הקרינה המקורית, ואילו הלוחות מהימין להראות את הערכים מנורמלים קריאות בזמן 0 בקבוצות הטיפול בהתאמה. ההבדל בין הקבוצות שטופלו וללא MG132 נותח על ידי דו כיוונית ANOVA עם מדידות חוזרות. ערכי P בין שתי קבוצות הטיפול מסומנים. (C) וולס נבדקו לפני או אחרי 9 טיפול hr chx, או לאחר טיפול chx ו MG132, על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להציג שני התאים טובים יותר עם NLC-LucDM-GFP מצטבר בהיר ובעלי חלבון מתפזר עמום, ערך גמא של 1.5 יושם לכל התמונות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. מופחת קצב הידרדרות של NLS-LucDM-GFP בתאי מציאת PML. תאי הלה שטופלו בעבר עם שליטה או PML siRNA היו זורעים לתוך 96 צלחות היטב. הביזוי של NLS-LucDM-GFP נותח כמתואר באיור 4 (דו כיוונית ANOVA, p <0.0001). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
54,266 / 54266fig6.jpg "/>
קרינת איור 6. Atxn1 82Q-GFP נותרת ללא שינוי על מרדף chx. תאי הלה היו transfected עם Atxn1 82Q-GFP. 24 שעות שלאחר transfection, שפלה של Atxn1 82Q-GFP נותח כמתואר באיור 4. האיור מציג את קריאת הקרינה המקורית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. assay microplate מבוססי פלורסנט השפלה של ציטופלסמית LucDM-GFP. תאים הלה זורעים על 96 צלחות גם היו transfected עם 0.1 מיקרוגרם LucDM-GFP שטופלו chx בנוכחות או בהעדר MG132. התוצאות נותחו כמתואר באיור 4 (דו כיוונית ANOVA, p <0.0001).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1 .: הגדרות מדידה על הקורא microplate פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מנגנונים מווסתים הפירוק של חלבוני misfolded חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס של חלבונים תאיים, והם ככל הנראה מייצגים מטרות תרופה יקרות לטיפול בהפרעות ניווניות ומחלות misfolding-חלבון אחרות. כאן, מבחני הבוחנים את הפירוק של החלבונים misfolded מתוארים, באמצעות חלבון Atxn1 פתוגניים (Atxn1 82Q) ו מוטציה בלוציפראז מקומי גרעיני (NLS-LucDM) כדוגמאות.
כדי לבחון את השפלה Atxn1 82Q, אשר יש זמן מחצית חיים יותר מ 18 שעות, הצגנו שיטה חדשה על ידי שילוב של חלוקת תא עם קלאסית chx 9. שיטה זו חשפה אישור הרבה יותר מהר ממיני misfolded של Atxn1 82Q לאורך זמן. בנוסף, כניסתה של LucDM מספקת מצע misfolded מודל ללמוד מנגנוני שפלה כלליים של חלבוני misfolded. כדי לענות על הצורך של מערכת HTS לאיתור פירוק חלבוני misfolded בתא יונקהים, פתחנו assay שפלה מהירה לשימוש LucDM קורא microplate פלואורסצנטי. המערכת משרתת ככלי רב עצמה עבור מסכים כימיים וגנטיים.
חלבון Atxn1 82Q שוהה NS, SS, ושברי SR של lysates תא. שברי SR הפכו נפוצים יותר ויותר במהלך התרבות הממושכת לאחר transfection, דבר המצביעים על כך זה בצורה שקשה להיות נערצים או מושפל, למשל, את סיבי עמילואיד. דור של מיני misfolded רעילים או אגרגטים כי לא יכול להיות מושפל בקלות עלול לחסום נתיבי פירוק חלבונים, שהקשה על הניתוח של מנגנון התאי אנדוגני שליטת 24 חלבונים סוטים, 25,26. כדי למנוע היווצרות של כמות גדולה של SR, אנחנו מתחילים chx מרדף 4-5 שעות לאחר transfection הראשונית. מצאנו כי זה הוא קריטי לניתוח תנאים הסלולר שעשויות לעכב את הפירוק של שבר SS. בנוסף זמן transfection, הוא גם חיוני לא מעלwhelm התאים על ידי לבטא חלבון Atxn1 82Q ברמות גבוהות מאוד. אם שפלה לא או מאוד איטי הוא ציין עבור כל השברים, פחות סכום של פלסמיד Atxn1 82Q אמור לשמש עבור transfection. באופן אידיאלי, assay צריך להסתיים בתוך 12 שעות כמו תאים אפופטוטיים הם הבחינו מעבר לנקודה הפעם. באיור 2 א, כמות SS Atxn1 82 בתאים שליטים היא שונה לחלוטין מזו PML siRNA שטופל בתאים קצרים ככל 8 שעות. זהירות צריכה להילקח אם הבדל בקבוצה שטופלה הוא ציין רק מעבר 12 שעות, כפי שהוא עשוי להיגרם על ידי גורמים אחרים המשפיעים על כדאיויות תא ולא פירוק חלבונים.
לעומת NS Atxn1 82Q, Atxn1 82Q בשבריר SS מסולק במהירות כדי לציין שהיא מייצגת זן misfolded שיכול להיות מושפל בקלות על ידי הפרוטאזום (איור 2 א). לעומת זאת, רמות של SR Atxn1 82Q נשארים ללא שינוי על פני אותה כמובן זמן (איור 2 ב), המאשרשזה מין בלתי-מתכלה. ובכל זאת, הניתוח של שבר SR צריך להיות חשוב לניתוח מנגנוני מסיר אגרגטים ציטופלסמית ישירות (למשל, autophagy) או להשפיע על ההיווצרות של אגרגטים אלה. ניכרת, MG132 נראה פחות יעיל במניעת Atxn1 82Q ירידה שבריר SS. זו עלולה להיגרם על ידי העלאת רמות ROS על עיכוב הפרוטאזום 27, אשר יכול לקדם את ההצטברות של Atxn1 82Q.
יתרון גדול של assay LucDM-GFP הוא שזה יכול להיות מותאם ניתוח HTS באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. אנחנו בתחילה ניסינו לפתח מערכת HTS עבור Atxn1 82Q. עם זאת, כי רק חלק קטן של החלבון הכולל Atxn1 82Q הוא מושפל לאורך זמן, הקרינה של תאים המבטאים GFP-Atxn1 82Q נותר ללא שינוי מהותי במהלך מרדף chx (איור 6). חלבוני misfolded אחרים עם זמן מחצית חיים ארוכים הכוללים יצטרכו בעיות דומות עם פלואוריד בזמן האמתassay escent. לעומת זאת, ירידה ניכרת של חלבון הכוללת NLS-lucDM-GFP הוא ציין (איורים 3 ו -4). תכונה זו, יחד עם זמן מחצית החיים הקצר שלה (2-3 שעות), מאפשרת מצע מלווה במודל זה כדי להתגלות בקלות על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי. במחקרים קודמים, GFPu, חלבון ה- GFP התמזגו אות השפלה בונה (CL-1), הועסק נרחב ככתב את הפונקציונליות של מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום 28,29. בה בעת הוא גם חלבון misfolded פונדקאי בולט מודלי תא חי 30. לעומת GFPu, אחד היתרונות של assay השפלה המתוארת כאן היא כי בלוציפראז misfolded הוא מצע המלווה מודל בשימוש נרחב. על ידי בחינת הפעילות בלוציפראז, ניתן בקלות להעריך את הילידים, מפוגל, וקיפלתי תצורות של בלוציפראז במבחנה in vivo. לפיכך, המערכת שלנו משמשת כפלטפורמה שימושית מאוד להתחבר חלבון מחייב וקיפול מבחנים עםמערכת השפלה הסלולר באמצעות אותו המצע 9.
באמצעות מדידת קרינה בזמן אמת את הערכים הבאים ניתן להשיג: עוצמת הקרינה החל, עוצמת קרינת יציבות, ואת מחצית חי חלבון. ערכים אלה מתואמים בהתאמה עם כמות החלבון הכולל לפני המרדף, כמות החלבונים עמידים שפל, ושיעור מחזור חלבון. לכן, ניתן להשתמש assay הקרינה בזמן אמת לבצע ניתוח מקיף של רמות ודינמיקה של מינים חלבון misfolded שונים. לפעמים, וריאציה גדולה יחסית של הקרינה החל בין משכפל הוא ציין (למשל, איור 5, בחלונית הימנית). זה עשוי להיגרם על ידי השתנות זריעת תאים או transfection. עם זאת, למרות ההבדל בעוצמת הקרינה החל, האות של כל משכפל טיפות בקצב מאוד דומה. נורמליזציה של אותות הלוך ושובמ 'כל אחד מועדים לפי שעון לעוצמת בזמן 0 יכול להפחית את הווריאציה גם ל-חיל ויותר משקף נאמנה את שיעורי השפלה (איור 4 א, 4 ב ואיור 5, עזב לעומת לוחות מימין).
בנוסף בצורה גרעינית, גם ניתחנו LucDM-GFP cytoplasmic. יש cytoplasmic LucDM-GFP דפוס השפלה דומה למעט אחוז גבוה יותר של קרינה נותרת נצפה כשאותו הליך הניסוי יושם כמתואר בפרוטוקול 4 (איור 7). השפלתו אפשר לבלום לחלוטין MG132, המציין assay זה יכול לשמש כדי לפקח על בקרת איכות חלבון cytoplasmic דרך השפלה proteasomal. למחקרים עתידיים, זה יהיה מעניין לבדוק אם LucDM-GFP יכול להיות מיושם על תאים סלולריים אחרים, למשל, המיטוכונדריה או reticulum endoplasmic, כאשר התמזגו אותות לוקליזציה תא תאי ספציפיים.
כפי שצוין בפרוטוקול עבור assay ניאון מבוססי, חשוב להשתמש בינוני נמוך ניאון כדי להפחית את הרקע פלורסנט להשתמש תערובת אמן של מגיב דנ"א transfection להפחית גם ל-גם וריאציה transfection. שליטת הרווח יכולה להיות מותאמת על קוראי צלחת ניאון כמה. חשוב להגדיר את רווח לידני במקום אופטימיזציה ולהשתמש אותו ערך ברחבי assay כולו (טבלה 1). שווי הרווח יכול להיות מותאם על מנת למקסם את הקריאה מן קרינת GFP הסלולר עוד הקריאה לא לחרוג מהגבול העליון של זיהוי.
בשלב הנוכחי, אנחנו עדיין מסתמכים על transfection להביע LucDM. כדי להפחית וריאציה ולפשט את assay עבור HTS, מטרה בעתיד היא להקים שורת תאים יציבה עם ביטוי מושרה של LucDM. עם זאת, כפי microplate ובינוני תרבות לשניהם קרינת רקע, זה חיוני שתהיה אות ה- GFP גבוהה משמעותי משיעור ברקע. Unforלמרבה, קווי היציבה הקמנו לכולם יש לאחרונה ביטוי נמוך של LucDM. לפיכך, הפיתוח של קו יציב עם ביטוי חלבון גבוה יותר ישפר את יעילות ההקרנה באופן משמעותי.
מבחני השפלה המתוארים כאן יכולים להיות מיושמים גם חלבוני misfolded אחרים. בשל התכונה הדינמית של חלבוני misfolded, מבחנים אלה צריכים להיות בשילוב עם ניתוח אחר כדי לחשוף את מנגנוני המעמיק של בקרת איכות חלבון. ניתוחים אלה כוללים מדידת רמות המצב היציבה של אגרגטים המחיצות שלהם שברי תאים שונים (איור 1) וניתוח חלבונים מתקפלים או צבירה באמצעות חלבונים רקומביננטיים מטוהרים. מבחנים אלה יסייעו להבחין משפעות ישירות או עקיפות של ביטוי סמים או הגן על פירוק חלבונים או צבירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
