Introduction
Eiwitten zijn de meest voorkomende macromoleculen in cellen, en zij een essentiële rol in vrijwel alle biologische processen. De biologische activiteit van de meeste eiwitten vereist de vouwen naar en handhaving, de natieve driedimensionale structuren. Eiwitten met afwijkende conformaties niet alleen verliezen hun normale functies, maar ook vaak vormen oplosbare oligomere species of aggregaten die de functies van andere eiwitten verstoren en toxisch zijn voor cellen 1,2. Om eiwitten verkeerd vouwen tegen te gaan, cellen werken zowel moleculaire chaperones, die ongevouwen of gedeeltelijk gevouwen polypeptiden helpen hun natieve conformatie te bereiken, en degradatie paden, die verkeerd gevouwen eiwitten 3 te elimineren. Gezien de complexiteit en stochastische aard van het vouwproces, eiwit misfolding onvermijdelijk, en kan niet worden omgekeerd bij mutaties biosynthetische fouten, en post-translationele schade 1. Daarom cellen uiteindelijk afhankelijk degradation wegen naar hun eiwit kwaliteit te handhaven.
Het belang van cellulaire proteïne kwaliteitscontrole (PQC) systemen wordt onderstreept door het voorkomen van eiwit misfolding ziekten, waaronder kanker, diabetes en vele neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, amyotrofe laterale sclerose, ziekte van Huntington (HD), en spinocerebellaire ataxie (SCA) 4,5. Bijvoorbeeld mutaties in het p53 tumor suppressor is de meest frequent genetische laesie in tumoren geassocieerd met ~ 50-70% van de gevallen 6. Een aanzienlijke fractie van p53 mutaties missense mutaties die de conformatie van p53 te veranderen, wat leidt tot de vorming van aggregaten 7. Bovendien zijn eiwitten met uitgebreid polyQ stukken genetisch en pathologisch geassocieerd met HD en SCA. Deze progressieve en vaak dodelijke ziekten manifesteren wanneer de lengte van de polyQ rek in de betreffende eiwitten boven een bepaalde thresvasthouden en steeds ernstiger als de lengte van de polyQ rek verlengt 8.
Een aantrekkelijke benadering voor het behandelen van deze ziekten therapeutisch versterken PQC cellulaire systemen, met name de afbraakroutes. De betrokken bij de afbraak van defecte eiwitten, met name in zoogdiercellen pathways, blijven slecht begrepen. Hoewel wordt erkend dat het proteasoom een cruciale rol in de afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten, van vitaal belang blijft undefined hoe verkeerd gevouwen eiwitten specifiek herkend en gericht voor afbraak. Ofschoon PQC systemen geïdentificeerd in cellulaire compartimenten inclusief het cytoplasma, het endoplasmatisch reticulum, en de mitochondrion, de PQC systemen in de kern 2 onduidelijk.
Recente studies door onze lab een systeem dat in de kern herkent en degradeert verschillende verkeerd gevouwen eiwitten geïdentificeerdvan zoogdiercellen 9. Dit systeem bestaat uit de promyelocytische eiwit (PML), een nucleair eiwit en een lid van de tripartiete motief-bevattende (TRIM) eiwitfamilie en RNF4 een RING-domein bevattend eiwit. PML, en verscheidene andere TRIM eiwitten bezitten SUMO (kleine ubiquitine-achtige modifier) E3 ligase activiteit, die de specificiteit en efficiëntie van eiwit sumoylation 10 vergemakkelijkt. RNF4 behoort tot een kleine groep van SUMO gerichte ubiquitine ligasen (Stubl), die één of meer sumo interactie motieven (SIM) naast het RING domein dat biedt hen de ubiquitine ligase activiteit 11 bevatten. We vonden dat PML specifiek herkent verkeerd gevouwen eiwitten door middel van discrete substraat erkenning sites die verschillende functies kunnen onderscheiden op verkeerd gevouwen eiwitten. Na binding, PML markeringen verkeerd gevouwen eiwitten met poly-ketens van SUMO2 / 3, twee vrijwel identieke zoogdieren SUMO-eiwitten die poly-ketens door de aanwezigheid van een interne sumoylation site vormen. SUMOylated verkeerd gevouwen eiwitten worden vervolgens herkend door RNF4, wat leidt tot hun ubiquitinatie en proteasomale degradatie. Verder hebben we aangetoond dat de PML-RNF4 systeem is belangrijk voor de bescherming tegen neurodegeneratie, zoals deficiëntie in PML verergert gedrags- en neuropathologische afwijkingen van een muismodel van SCA type 1 (SCA1) 9.
Om afbraak van eiwitten te onderscheiden van andere cellulaire mechanismen die proteïne niveaus kunnen reguleren, de tarieven van de omzet eiwit werd gemeten 9. Een van de meest gebruikte methoden om de omzet eiwit te bepalen zijn pulse chase en cycloheximide (CHX) chase. Deze twee methoden worden onderzocht in de tijd, respectievelijk het radioisotoop gemerkte eiwitten van belang in translatie-bekwame cellen en totaal reeds bestaande eiwitten van belang in translatie geremd cellen. Echter een grote uitdaging voor de studie van pathogene en misvouwing gevoelige eiwitten is dat de halfwaardetijd van deze eiwitten zeer lo kanng. Bijvoorbeeld, ataxine-1, ataxine-7, huntingtine, α-synucleïne en TDP-43 hebben halfwaardetijden van meer dan 12 tot 24 uur 9,12-16. De trage omzet tarieven van deze eiwitten beletsel voor het gebruik van de CHX chase analyse, omdat de cellen die deze eiwitten langdurige vertaling remming niet kan overleven, vooral omdat het verkeerd gevouwen eiwitten zelf kunnen zeer giftig voor de cellen. De puls-chase analyse met isotopische labeling kan ook een uitdaging voor eiwitten die zeer aggregatie-gevoelig bent. Meest pulse-chase assays afhankelijk immunoprecipitatie het eiwit van belang te scheiden van alle andere eiwitten die ook radioactief gelabeld. Deze procedure omvat doorgaans lang immunoprecipitatie en wassen procedures, waarbij SDS-onoplosbare aggregaten kunnen vormen, waardoor de analyse met SDS-PAGE elektroforese onnauwkeurig.
Hier een protocol om de nucleaire verkeerd gevouwen eiwitten te analyseren met een lage omloopsnelheid is beschreven 9. Een pathogene vorm van ataxine-1 (Atxn1) dat een gedeelte van 82 glutaminen (Atxn1 82Q) bevat wordt gebruikt voor dit doel 8. Uitgedrukt in cellen, een versterkt groen fluorescent eiwit (GFP) fusie van Atxn1 82Q vormen microscopisch zichtbare insluitsels in de nucleus (figuur 1A). Pulse chase analyse blijkt dat de halfwaardetijd van Ataxn1 82Q is meer dan 18 uur 9. Atxn1 82Q bestaat uit soorten met verkeerd gevouwen conformaties van verschillende kenmerken, alsook soorten met natieve conformatie. Het is waarschijnlijk dat deze soorten worden afgebroken met verschillende snelheden, en moeten derhalve apart worden geanalyseerd. Lysaten van Atxn1 82Q-GFP tot expressie cellen worden gefractioneerd in NP-40-oplosbare (oplosbaar of NS, waarschijnlijk vertegenwoordigen natieve eiwitten of verkeerd gevouwen monomeer / oligomere eiwitten) en NP-40-onoplosbaar (NI, geaggregeerd / misfolded) porties. De laatste kan verder worden onderverdeeld in SDS-oplosbare (SS; waarschijnlijk wanordelijke aggregaten) of SDS-resistente (SR, waarschijnlijk amyloïde fibrillen) Fracties (Figuur 1B). NS en SS fracties kunnen worden geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door Western blotting, terwijl de fractie van SR filter retardatie assays gevolgd door immunoblotting kan worden gedetecteerd. CHX chase wordt gecombineerd met het detergens fractioneringsmethode, en ontdekten dat de halfwaardetijd van SS Atxn1 82Q is veel korter dan die van NS Atxn1 82Q en totale Atxn1 82Q (Figuur 2A), wat aangeeft dat de SS fractie gemakkelijk kan worden herkend en afgebroken 9 in cellen. Zo, deze methode biedt een krachtig instrument om de dynamiek van verkeerd gevouwen eiwitten te bestuderen en om hun degradatie patroon te vergelijken.
We beschrijven ook een werkwijze die geschikt is voor high throughput screening voor het identificeren van macromoleculen of kleine verbindingen die de afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten kan moduleren. Deze methode is gebaseerd op een conformationeel gedestabiliseerd mutant van vuurvlieg luciferase (LucDM) 17, een model chaperonne substraat. We hebben zekeringd LucDM een nucleair lokalisatiesignaal (NLS) naar de PQC systemen in dit cellulaire compartiment probe en GFP (NLS-GFP-LucDM) voor het gemak van detectie. NLS-GFP-LucDM vormen microscopisch zichtbare nucleaire aggregaten in een klein percentage cellen (Figuur 3A). Net als bij Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-maar niet de wild-type tegenhanger NLS-LucWT-GFP-wordt gewijzigd door SUMO2 / 3 en gereguleerd door de PML-RNF4 route 9. NLS-GFP-LucDM vormt tevens SS en SR species, hoewel de relatieve hoeveelheden van SS en SR soorten minimaal vergeleken NS met de onder protocol 3 beschreven omstandigheden. Om de analyse te vereenvoudigen we analyseren alleen SDS oplosbare LucDM (zowel NS en SS fracties) door SDS-PAGE en Western blot. Belangrijker CHX chase analyse toonde aan dat de halfwaardetijd van SDS-oplosbare NLS-LucDM-GFP is veel korter dan die van de wildtype tegenhanger (figuur 3B), wat suggereert dat LucDM is een specifiek substraat voor het systeem herkent en degradeertverkeerd gevouwen eiwitten.
De afbraak van LucDM-GFP veroorzaakt een significante vermindering van het totale fluorescentiesignaal. Daarom hebben we ook een protocol ontwikkeld voor real-time detectie van cellulaire LucDM-GFP behulp microplaat fluorescentie-gebaseerde test. Veel high-throughput screen (HTS) systemen zijn ontwikkeld voor drugs of genen modificeren van cellulaire aggregaten en cellulaire levensvatbaarheid veroorzaakt door afwijkende eiwitten 18-20. Echter, weinig HTSs speciaal voor het richten afbraak in zoogdiercellen. Dit protocol dient als een robuust systeem voor snelle en grootschalige analyse van de effecten van eiwitexpressie knockdown en behandeling met geneesmiddelen op mobiele misfolded eiwitafbraak. HeLa-cellen gebruikt zoals bijvoorbeeld hieronder beschrijven we de protocollen voor de analyse van deze twee verkeerd gevouwen eiwitten. De assays kunnen ook worden toegepast op andere cellijnen, hoewel transfectie omstandigheden en tijdsduur moet worden geoptimaliseerd voor individuele cellijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagens
- Bereid cellysis buffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Supplement 2 mM DTT, 1x volledige protease cocktail en 250 IU / ml benzonase vóór gebruik.
- Bereid pellet buffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplement 2 mM DTT, 1x volledige protease cocktail en 250 IU / ml benzonase voor gebruik.
- Bereid 3x kokende buffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT vóór gebruik.
- Bereid low-fluorescentie DMEM medium voor assays met behulp van fluorescentie microplaat reader. Meng 25 mM glucose, 0,4 mM glycine, 0,4 mM arginine, 0,2 mM cysteïne, 4,0 mM glutamine, 0,2 mM histidine, 0,8 mM isoleucine, 0,8 mM leucine, 0,8 mM lysine, 0,2 mM methionine, 0,4 mM fenylalanine, 0,4 mM serine, 0,8 mM threonine, 0,078 mM tryptofaan, tyrosine 0,4 mM, 0,8 mM valine, 1,8 mM CaCl2, 0,81 mM MgSO 4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO 3, 110 mM NaCl, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Stel de pH van de oplossing met HCl of NaOH tot pH 7,4. Steriliseer het medium door filtratie.
LET OP: Dit medium bevat onderdelen van de standaard DMEM medium met een hoog glucosegehalte, behalve dat Fe (NO 3) 3, vitamines en Fenol Red weggelaten. Fenolrood, riboflavine en pyridoxal regelmatig DMEM cultuurmedium significant interfereren met de detectie van fluorescentiesignaal 21. Kweekmedium zonder deze componenten is van cruciaal belang voor een succesvolle live-cell imaging GFP. Het medium is stabiel gedurende 12 maanden indien koel bewaard.
2. Degradatie Assay van Atxn1 82Q GFP
- Plaat ongeveer 3 x 10 5 HeLa-cellen in 35 mm platen met DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), zodat na O / N kweken van cellen groeien tot een samenvloeiing van 40-60% op het moment van transfectie.
Opmerking: Het aantal platen nodig is gebaseerd op het aantal tijdstippen en behandelingen dHieronder escribed. - HeLa-cellen te transfecteren met 0,3 ug Atxn1 82Q-GFP / pRK5 plasmide in elk putje middels transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant 9. Maak een meester transfectie mix die DNA en transfectiereagens en aliquot het voor elk putje.
- 4-5 uur na transfectie, onderzoekt de levende cellen onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop voor GFP expressie met excitatie golflengte 450-490 nm. Terug cellen terug naar incubator na beeldvorming.
LET OP: Let op zowel diffuus GFP signalen en kleine spikkels van GFP signalen in de kern op dit moment. - Verwijder het medium door afzuigen in vacuo en voeg 2 ml vers DMEM bevattende 50 ug / ml CHX. Behandel cellen voor 0, 4, 8, 12 en 16 uur met CHX voor de oogst. Om proteasomale degradatie onderzocht bevatten proteasoom inhibitor MG132 (10 uM) in een plaat behandeld gedurende 16 uur als controle.
- Oogst een bord van de cellen op elk tijdstip. Verwijder het medium door afzuigen in vacuo eend tweemaal wassen van de platen met 3 ml ijskoude 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Snap-bevriezing van de plaat op droog ijs.
- Na het laatste tijdstip (16 uur), schrapen de bevroren cellen (van alle tijdstippen) in 150 pl ijskoude cellysis buffer en geïncubeerd op ijs gedurende 30 min.
- Centrifugeer de cellysaten in een benchtop centrifuge bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Breng de supernatant, die NP-40-oplosbare (NS) eiwitten bevat, naar een andere buis met een pipet.
OPMERKING: Gebruik bovenstaande vloeistoffen voor het meten van eiwit-concentraties door Bradford assay indien nodig. - Spoel de pellets door voorzichtig toevoegen van ongeveer 200 pl 1x PBS aan de buizen zonder de pellets te verstoren. Verwijder PBS voorzichtig door middel van vacuüm aspiratie of pipet. Resuspendeer ze in 150 ul ijskoude celpellet buffer, gevolgd door 15-30 min incubatie op ijs.
NB: De geresuspendeerde fractie pellet bevat NP-40 onoplosbaar (NI) eiwitten. Zie Figuur 1B een diagram van detergent fractionering. - Voeg 75 pl 3x kokende buffer in NS fracties en NP-40 onoplosbare (NI) fracties uit de pellets geresuspendeerd. Verwarm de monsters bij 95 ° C op een verwarmingsblok gedurende 5 min.
LET OP: Massa in de NP-40 onoplosbare fracties worden opgelost na verhitting en samples zal duidelijk worden. - Voeg SDS-gel laadbuffer om een portie gekookte NS en NI. Belasting gelijk volume van monsters van alle tijdstippen aan SDS-PAGE gel. Het volume geladen overeen met ongeveer 20 ug van NS monster verzameld op tijd 0. OPMERKING: NS, en SDS-oplosbare (SS) eiwit van NI fractie, kan worden opgelost door SDS gel scheiden. Daarentegen worden SDS-resistente (SR) aggregaten NI fractie vast in de gel laadhouders (Figuur 1B). Om western blot detectie te verbeteren, kan dubbele volume van NI worden geladen.
- Detect NS en SS Atxn1 82Q-GFP door western blot met behulp van anti-GFP antilichaam en verbeterde chemiluminescentie (ECL).
OPMERKING: Atxn1 82Q in de SS fractie algemeen minder in vergelijking met de NS breuk bij gebruik van dit protocol. ECL langere belichting nodig voor optimale signalen. - Onderzoek SR Atxn1 82Q van de pellet-fractie door filter retardatie testen met behulp van een dot-blot apparaat (Figuur 1B). In het kort, het opzetten van een dot-blot apparaat met een 0,2 um celluloseacetaat membraan. Belasting 80-120 pl gekookte NI in elk putje van de dot-blot inrichting.
OPMERKING: Aangezien slechts kleine hoeveelheden SR aggregaten worden gevormd in cellen, de dot blot assay, laadt een volume van de SR fractie die ongeveer 10-15 maal het volume van de fractie NS gebruikt voor western blot analyse.- Na affiltreren van de monsters door het membraan door een vacuüm, kan Atxn1 82Q-GFP aggregaten vast op het membraan worden gedetecteerd door anti-GFP immunoblotting 9,12,22.
OPMERKING: Zie eerdere rapporten 9,12,22 voor een gedetailleerde beschrijving van de filter retardatie assay. Deze stap is optioneelomdat SR Atxn1 82Q is minimaal in vergelijking met SS en NS fracties na de korte transfectie beschreven in dit protocol. Bovendien, het niveau van SR Atxn1 82Q grotendeels hetzelfde blijven dan CHX chase (figuur 2B). Het is echter nog steeds van cruciaal belang om te onderzoeken of de bedragen van de SS Atxn1 82Q worden beïnvloed in de tijd voor een behandeling met geneesmiddelen of genexpressie in eerste experimenten. SS eiwitsoort verblijven in SDS-PAGE-gel laadhouders kan worden gedetecteerd door western blot. Deze methode is minder gevoelig genereert meer variabele resultaten (Figuur 1B).
- Na affiltreren van de monsters door het membraan door een vacuüm, kan Atxn1 82Q-GFP aggregaten vast op het membraan worden gedetecteerd door anti-GFP immunoblotting 9,12,22.
3. Assay Afbraak van NLS-luciferase-GFP gebruik SDS-PAGE en Western Blot
- Plaat ongeveer 3 x 10 5 HeLa-cellen in 35 mm platen met DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Na O / N kweek wordt een samenvloeiing van 40-60% bereikt op het moment van transfectie. Het aantal platen nodig is gebaseerd op het aantal time punten en behandelingen hieronder beschreven.
- HeLa-cellen te transfecteren met 1,0 ug NLS-luciferase-GFP / pRK5 plasmide in elk putje middels transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant 9. Maak een meester transfectie mix met DNA en transfectiereagens voor de hoeveelheid van elk putje.
- Na O / N transfectie (rond 15 uur), onderzoekt de levende cellen onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop voor GFP expressie met excitatie golflengte 450-490 nm. Terug cellen terug naar incubator na beeldvorming.
OPMERKING: Diffuus nucleaire GFP signaal kan worden waargenomen in de meeste cellen (70%). Een klein deel (5%) van cellen nucleaire aggregaten. - Verwijder het medium door afzuigen in vacuo en voeg 2 ml vers DMEM bevattende 50 ug / ml CHX. Behandel cellen voor 0, 1,5, 3, 4,5 en 6 uur met CHX voor de oogst. Om proteasomale degradatie onderzocht, omvatten additionele proteasoom inhibitor MG132 (10 uM) in een plaat behandeld gedurende 6 uur als controle.
- Oogst een bord van de cellen op elk tijdstip. Verwijder het medium door afzuigen in vacuo en was de platen tweemaal met 3 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Snap-bevriezing van de plaat op droog ijs.
- Na de laatste tijdpunt (6 uur) keert cellen bevroren op alle tijdstippen worden afgeschraapt in 150 ul ijskoude cellysis buffer en geïncubeerd op ijs gedurende 30 min.
- Add SDS gel-laadbuffer om hele cellysaten voor een uiteindelijke concentratie van 2% SDS en 50 mM DTT. Incubeer monsters op een verwarmingsblok bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Analyseer NLS-luciferase-GFP door SDS-PAGE en Western blot onder toepassing van anti-GFP antilichaam. Belasting gelijk volume van monsters van alle tijdstippen aan SDS-PAGE gel. Het volume geladen overeen met ongeveer 20 ug van lysaten van gehele cellen van monster verzameld op tijd 0.
4. Real-time Degradatie Test van NLS-luciferase-GFP Met behulp van fluorescentie Microplate Reader
- Seed ongeveer 1 x 10 4HeLa cellen in zwarte 96-well weefselkweek platen met transparante bodem. Na O / N kweek wordt een samenvloeiing van 50-70% bereikt op het moment van transfectie.
LET OP: 60 pl medium dat volledig geschorst HeLa-cellen worden direct goed gezaaid in elk. Geen extra medium of rock plaat heen en weer toe te voegen na het zaaien, anders cellen kunnen worden ongelijk verdeeld. - HeLa-cellen te transfecteren met 0,05-0,1 ug NLS-luciferase-GFP / pRK5-plasmide 9 in elke well middels transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant. Maak een meester transfectie mix die DNA en transfectiereagens en aliquot het voor elk putje. Drie putjes met cellen niet getransfecteerd met DNA, die dient als controle voor de achtergrond fluorescentie signaal voor elke behandeling aandoening.
Opmerking: Een alternatieve manier om transfectie variatie te verminderen is transfecteren van cellen voor het zaaien. Een groot gedeelte van de cellen getransfecteerd met verkeerd gevouwen eiwits niet te bevestigen of te tonen verminderde levensvatbaarheid met deze methode. Het is waarschijnlijk dat sommige cellen de stress veroorzaakt door trypsine digestie wanneer expressie toxisch verkeerd gevouwen eiwitten niet kan staan. Hierdoor wordt de totale fluorescentiesignaal aanzienlijk verminderd. - 20-24 uur na transfectie, onderzoekt de levende cellen onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop voor GFP expressie met excitatie golflengte 450-490 nm.
- Verwijder het medium door afzuigen in vacuo. Voeg ongeveer 200 ul 1 x PBS aan elk putje en zuig het naar resthoeveelheid DMEM medium te verwijderen.
- Voeg 60 ul van laag fluorescentie DMEM-medium met 5% FBS en 50 ug / ml CHX. Om proteasomale degradatie te onderzoeken, onder meer extra proteasoom inhibitor MG132 (10 uM) in een set van monsters. Set drievoud putten voor elke behandeling / conditie.
LET OP: MG132 behandeling is opgenomen als controles voor proteasomale degradatie, want het is van cruciaal belang om uit te sluiten andere factoren die druppel fluo kan veroorzakencerend signaal, met inbegrip van celdood en fluorescentie blussen. - Meet de fluorescentie-signaal van GFP onmiddellijk op een fluorescerende plaat lezer na het toevoegen van CHX.
OPMERKING: De software meetinstelling zijn in tabel 1. - Lees de plaat elk uur gedurende 8-10 uur. Na het lezen, de terugkeer van de plaat terug naar celkweek incubator.
- Exporteer de gegevens als spreadsheet-bestand. Met gemiddelde waarde van multi-bed voor elk putje fluorescentie intensiteit. Normaliseren waarden van elk gegevenspunt op de gemiddelde waarden van tijd 0 in de respectieve groepen. Zet de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit in de tijd zoals getoond in figuur 4A en 4B en figuur 5, rechter panelen.
- Voer statistische analyse van afbraaksnelheden tussen twee omstandigheden met behulp van twee-weg ANOVA met herhaalde metingen 23.
LET OP: In deze analyse, "fluorescentie-intensiteit" is de afhankelijke variabele terwijl "treatmdities "en" tijd "zijn de twee factoren. In plaats van het vergelijken van gegevens op afzonderlijke tijdstippen tweeweg ANOVA met herhaalde metingen analyseert het verschil tussen de twee behandelingsgroepen gedurende de gehele tijdsverloop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een steady state analyse kan microscopisch zichtbare Atxn1 82Q-GFP nucleaire aggregaten waargenomen in 30-50% van HeLa-cellen 20 uur na transfectie (Figuur 1A). Western blot analyse van NS en SS fracties met behulp van anti-GFP-antilichaam toont een duidelijke band van Atxn1 82Q-GFP tussen 100 kDa en 150 kDa markers, die overeenkomt met het molecuulgewicht van het eiwit (Figuur 1B). Atxn1 82Q-GFP in de SR fractie kan worden gedetecteerd hetzij filter retardatie assay of door SDS-PAGE en Western blot als soorten aan de top van de stacking gel (Figuur 1B). Voor half-life analyse met behulp van protocol hierboven beschreven, CHX achtervolging begint 4-5 uur na aanvankelijke transfectie voordat een grote nucleaire aggregaten worden gevormd. De halfwaardetijd van Atxn1 82Q-GFP in de SS fractie ongeveer 5 uur, in tegenstelling tot een lichte of geen afname van Atxn1 82Q-GFP in de NS fractie boven 16 h (figuur 2A). de Degraling van Atxn1 82Q-GFP wordt gedeeltelijk geremd door behandeling van cellen met MG132 (Figuur 2A). We toonden eerder aan dat PML stimuleert de afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten door het bevorderen van hun sumoylation. Hier gebruiken we PML knockdown als voorbeeld van veranderde afbraakroute. PML siRNA behandeling verlengde de halfwaardetijd van Atxn1 82Q-GFP in de SS fractie (Figuur 2A). Geen duidelijke veranderingen in de SR Atxn1 82Q-GFP worden gedetecteerd in een van beide controle of PML siRNA-behandelde cellen (Figuur 2B en 2C).
Twintig uur na transfectie NLS-GFP-aggregaten LucDM worden microscopisch zichtbaar in 5-15% van HeLa-cellen, maar dit kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid DNA die zijn getransfecteerd (Figuur 3A). De halfwaardetijd van SDS oplosbare NLS-GFP-LucDM is 2-3 uur (Figuur 3B en 3C). De fluorescentie intensiteit van getransfecteerde cellen vermindert ook viatijde op CHX behandeling (Figuur 4A en 4B). Zes uur na CHX behandeling, de fluorescentie-intensiteit bereikt een stabiele fase en stopt daalt (figuur 4A en 4B). Op hetzelfde tijdstip, oplosbare NLS-LucDM-GFP hoofdzakelijk afgebroken (Figuur 3B en 3C), wat suggereert dat de resterende fluorescentie wordt gegenereerd geaggregeerd soorten moeilijk afbreekbaar zijn. Consequent, geaggregeerd, maar niet verspreid, GFP blijft in de cellen 9 uur na CHX behandeling (Figuur 4C). Interessant, transfectie met behulp van een hoger bedrag van de NLS-LucDM-GFP plasmide genereert meer nucleaire aggregaten alsmede hogere intensiteit van de resterende fluorescentie, hoewel de afbraaksnelheid niet wordt beïnvloed (Figuur 4A en 4B). Met behulp van SDS-PAGE gevolgd door Western blot of fluorescentie lezen, kunnen wij de remming van NLS-GFP-LucDM afbraak detecteren met MG132 behandeling of PML siRNA (figuur 3C, 4A, 4B en 5).
Figuur 1. Detectie van Atxn1 82Q-GFP door fluorescentie microscopie en detergent fractionering. (A) HeLa-cellen werden getransfecteerd met Atxn1 82Q-GFP en gekleurd met DAPI. Individueel en samengevoegde beelden worden getoond. Schaal bar = 10 micrometer. (B) Een diagram dat de detergent fractionering van Atxn1-82Q tot expressie brengen, zoals beschreven in protocol 2. Molecuulgewichtsmerkers zijn aangegeven aan de linkerkant van western blot beelden van Atxn1-Atxn 82Q. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
66 / 54266fig2.jpg "/>
. Figuur 2. Afbraak assay van Atxn1 82Q-GFP met afwasmiddel fractionering HeLa-cellen werden vooraf behandeld met controle (-) of PML siRNA (A en C) of onbehandeld (B). Cellen werden getransfecteerd met Atxn1 82Q-GFP en behandeld met CHX in afwezigheid of aanwezigheid van MG132. Cellysaat fracties werden geanalyseerd door SDS-PAGE, gevolgd door western blot (A, voor de NS en SS fracties) of filter retardatie assay (B en C, voor SR fractie) met behulp van anti-GFP antilichaam. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Figuur 3. Analyse van de NLS-LucDM-GFP degradatie door fluorescentie MICRoscopy en western blot. (A) HeLa-cellen die met NLS-LucDM-GFP werden gekleurd met DAPI. Individueel en samengevoegde beelden worden getoond. Schaal bar = 25 pm. Pijlpunt wijst op een cel met nucleaire aggregaten. (B en C) HeLa-cellen werden getransfecteerd met NLS-LucDM-GFP en het wildtype luciferase fusie-eiwit NLS-LucWT-GFP (B) of getransfecteerd met controle of PML siRNA, gevolgd door transfectie met NLS-LucDM-GFP ( C). Cellen werden behandeld met CHX en MG132 aangegeven. Hele cellysaten werden geanalyseerd met western blot onder toepassing van anti-GFP antilichaam. Het beeld is gewijzigd ten opzichte van de vorige publicatie met toestemming 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Fluorescerende microplaat test voor NLS-GFP LucDM-afbraak. HeLa-cellen gezaaid op 96-putjesplaten werden getransfecteerd met 0,05 ug (A) of 0,1 ug (B en C) NLS-GFP-LucDM en behandeld met CHX in de aanwezigheid of afwezigheid van MG132. (A en B) Fluorescentie intensiteiten putjes werden gemeten op de aangegeven tijdstippen (gemiddelde waarden ± standaarddeviatie, n = 3). Panelen links de originele fluorescentie lezen, terwijl de panelen aan de rechterkant tonen de waarden genormaliseerd naar waarden op tijdstip 0 in de respectieve behandelingsgroepen. Het verschil tussen de groepen behandeld met en zonder MG132 werd geanalyseerd door tweeweg ANOVA met herhaalde metingen. P-waarden tussen de twee behandelingsgroepen zijn aangegeven. (C) De putjes werden onderzocht vóór of na 9 uur CHX behandeling, of na CHX en MG132 behandeling door fluorescentiemicroscoop. Om beide cellen met heldere geaggregeerde NLC-LucDM-GFP en mensen met een zwak diffuus eiwit beter te laten zien, gamma-waarde van 1,5 werd toegepast op alle beelden. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Een verlaagde afbraaksnelheid van NLS-GFP-LucDM in PML knockdown cellen. HeLa cellen vooraf behandeld met controle-siRNA of PML werden uitgezet in 96 putjes. Afbraak van NLS-LucDM-GFP werd geanalyseerd zoals beschreven in figuur 4 (two-way ANOVA; p <0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
54.266 / 54266fig6.jpg "/>
Figuur 6. Fluorescentie van Atxn1 82Q-GFP blijft onveranderd CHX achtervolging. HeLa-cellen werden met Atxn1 82Q-GFP. 24 uur na transfectie, afbraak van Atxn1 82Q-GFP werd geanalyseerd zoals beschreven in figuur 4. De figuur toont de originele fluorescentie lezen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Fluorescerende microplaat assay voor afbraak van cytoplasmatische LucDM-GFP. HeLa-cellen gezaaid op 96-putjesplaten werden getransfecteerd met 0,1 ug LucDM-GFP behandeld met CHX in aanwezigheid of afwezigheid van MG132. De resultaten werden geanalyseerd zoals beschreven in figuur 4 (twee-weg ANOVA, p <0,0001).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1 .: Meetinstelling op fluorescentie microplaat reader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mechanismen die de afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten reguleren zijn essentieel voor het behoud van de homeostase van cellulaire eiwitten, en ze waarschijnlijk een waardevolle drug targets voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen en andere eiwit-misfolding ziekten. Hier, assays die de afbraak van verkeerd gevouwen proteïnen onderzocht worden beschreven, onder toepassing van een pathogeen Atxn1 eiwit (Atxn1 82Q) en een nucleair gelokaliseerde mutant luciferase (NLS-LucDM) als voorbeeld.
De afbraak Atxn1 82Q, die een halfwaardetijd heeft dan 18 uur onderzocht, hebben we een nieuwe werkwijze combineert Celfractionering klassieke CHX 9. Deze methode bleek een veel snellere goedkeuring van de verkeerd gevouwen soorten Atxn1 82Q in de tijd. Bovendien, de invoering van LucDM een model misfolded substraat algemene degradatie van verkeerd gevouwen eiwitten te bestuderen. De noodzaak van een HTS aan te pakken voor het detecteren misgevouwen eiwitafbraak bij zoogdiercels, ontwikkelden we een snelle degradatie test voor LucDM behulp van fluorescentie microplaat reader. Het systeem dient als een krachtig hulpmiddel voor chemische en genetische screens.
De Atxn1 82Q eiwit aanwezig in NS, SS en SR fracties van cellysaten. De SR fracties steeds overwegend bij langdurig kweken na transfectie, wat suggereert dat het in een vorm die moeilijk te worden gerespecteerd of afgebroken, bijvoorbeeld de amyloïde fibrillen. Generatie van toxische verkeerd gevouwen soorten of aggregaten die niet gemakkelijk kan worden afgebroken kan eiwitafbraak wegen te blokkeren, belemmeren de analyse van endogene cellulaire machinerie beheersen van afwijkende eiwitten 24, 25,26. Vorming van een grote hoeveelheid SR voorkomen, beginnen we CHX chase 4-5 uur na initiële transfectie. Wij hebben gevonden dat dit essentieel is voor de analyse van cellulaire aandoeningen die de afbraak van de SS fractie kan vertragen. Naast transfectie tijd, is het ook belangrijk niet te overWhelm cellen door expressie Atxn1 82Q eiwit op hoog niveau. Indien geen of een zeer langzame afbraak wordt waargenomen voor alle fracties, moeten minder hoeveelheid Atxn1 82Q plasmide gebruikt voor transfectie. Idealiter moet de test worden voltooid binnen 12 uur als apoptotische cellen worden gemerkt na dit tijdstip. In figuur 2A is de hoeveelheid SS Atxn1 82 in controlecellen opvallend verschilt van die in PML siRNA behandelde cellen zo kort 8 uur. Voorzichtigheid moet worden als een verschil in de behandelde groep slechts waargenomen na 12 uur, zoals kan worden veroorzaakt door andere factoren die cellevensvatbaarheid plaats eiwitafbraak beïnvloeden.
Vergeleken met NS Atxn1 82Q, Atxn1 82Q in de SS fractie wordt snel, wat aangeeft dat het vertegenwoordigt een verkeerd gevouwen species die gemakkelijk kan worden afgebroken door het proteasoom (Figuur 2A). In tegenstelling, de niveaus van SR Atxn1 82Q blijven ongewijzigd hetzelfde tijdsverloop (figuur 2B), bevestigtdat het een niet-afbreekbaar species. Toch moet de analyse van de SR fractie belangrijk voor het analyseren van mechanismen die direct verwijdert cytoplasmatische aggregaten (bijvoorbeeld autophagy) of invloed op de vorming van deze aggregaten. Opvallend MG132 blijkt minder effectief in het voorkomen Atxn1 82Q afname SS fractie zijn. Dit kan worden veroorzaakt door verhoging van de ROS levels op proteasoomremming 27, die de aggregatie van Atxn1 82Q kan bevorderen.
Een groot voordeel van LucDM-GFP assay is dat het kan worden aangepast aan HTS analyse met fluorescentie plaatlezer. We in eerste instantie geprobeerd om een HTS-systeem voor Atxn1 82Q ontwikkelen. Echter, omdat slechts een kleine fractie van de totale Atxn1 82Q eiwit wordt afgebroken in de tijd, de fluorescentie van cellen die GFP-Atxn1 82Q grotendeels onveranderd in de loop van CHX chase (figuur 6). Andere verkeerd gevouwen eiwitten met totale lange halfwaardetijd zou soortgelijke problemen met real-time fluor hebbenescent assay. Daarentegen wordt een duidelijke afname van de totale NLS-lucDM-GFP eiwit waargenomen (figuren 3 en 4). Dit kenmerk, samen met de korte halfwaardetijd (2-3 uur), maakt dit model chaperone substraat gemakkelijk worden gedetecteerd door fluorescentie spectroscopie. In vorige studies, GFPu, GFP-eiwit gefuseerd aan een constructieve afbraak signaal (CL-1), is op grote schaal gebruikt als een reporter voor de functionaliteit van het ubiquitine-proteasoom 28,29. Het is ook een belangrijke surrogaat verkeerd gevouwen eiwitten in cel- en diermodellen 30. Vergeleken met GFPu, een voordeel van de degradatie assay beschreven is dat verkeerd gevouwen luciferase is een veel gebruikt model chaperon substraat. Door het onderzoeken luciferaseactiviteit, kan men gemakkelijk de natieve, gedenatureerd en opnieuw gevouwen conformaties van luciferase beoordelen vitro en in vivo. Zo, ons systeem dient als een zeer nuttig platform voor eiwitbinding en vouwen assays te verbinden metcellulaire degradatie systeem met hetzelfde substraat 9.
Met realtime fluorescentiemeting de volgende waarden worden verkregen: Uitgegaan fluorescentie-intensiteit, stabiel bleven fluorescentie intensiteit, en de halfwaardetijd van het eiwit. Deze waarden zijn respectievelijk gecorreleerd met de totale hoeveelheid eiwit voor achtervolging, hoeveelheid eiwitten moeilijk afbreekbaar en de omloopsnelheid eiwit. Daarom is het mogelijk om real-time fluorescentie assay om een uitgebreide analyse van de niveaus en dynamiek van verschillende verkeerd gevouwen eiwit species maken. Soms is een relatief grote variatie van het uitgangsmateriaal fluorescentie van replicaat waargenomen (bijvoorbeeld Figuur 5, linkerpaneel). Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door variabiliteit in cel zaaien of transfectie. Ondanks het verschil in fluorescentie-intensiteit begint, het signaal van alle replicaten druppels rond hetzelfde tempo. Normalisering van de signalen weerm elke keer punten om de intensiteit op tijdstip 0 kunnen de well-to-well variatie te verminderen en nauwkeuriger weerspiegelt de afbraak tarieven (Figuur 4A, 4B en figuur 5, links versus rechts panelen).
Naast de nucleaire vorm, analyseerden wij ook cytoplasmatische LucDM-GFP. Cytoplasmatische LucDM-GFP een soortgelijk afbraakpatroon uitzondering hoger percentage resterende fluorescentie waargenomen wanneer dezelfde experimentele procedure werd toegepast als beschreven in protocol 4 (Figuur 7). De afbraak kan volledig worden geremd MG132, hetgeen aanwijst dat deze assay kan worden gebruikt om cytoplasmatisch proteïne kwaliteitscontrole door de proteasomale afbraak wordt gevolgd. Voor toekomstige studies zou het interessant zijn om te onderzoeken of LucDM-GFP kan worden toegepast op andere cellulaire compartimenten, bijvoorbeeld mitochondria of endoplasmatisch reticulum, wanneer gefuseerd aan specifieke cellulaire compartiment lokalisatiesignalen.
Zoals vermeld in het protocol voor fluorescerende gebaseerde test, is het cruciaal om low-fluorescerende medium gebruiken om fluorescerende achtergrond te verminderen en de master mix van DNA en transfectiereagens gebruiken om well-to-well transfectie variatie te verminderen. De versterkingsregeling kan worden ingesteld op een aantal fluorescentieplaat lezer. Het is belangrijk om de versterking handmatig plaats van geoptimaliseerde instellen en dezelfde waarde gedurende de gehele test (Tabel 1). De waarde van de versterking kan worden aangepast aan de lezing van de cellulaire GFP fluorescentie te maximaliseren zolang de meting niet verder dan de detectiegrens.
In het huidige stadium, zijn we nog steeds vertrouwen op transfectie om LucDM uiten. Variatie te verminderen en de test voor HTS vereenvoudigen toekomst doel is om een stabiele cellijn met induceerbare expressie van LucDM stellen. Zoals microplaat en kweekmedium beide achtergrondfluorescentie is het cruciaal om GFP signaal significant hoger dan de achtergrond hebben. unforMaar gelukkig, de stabiele lijnen die we onlangs hebben allemaal een lage expressie van LucDM. Zo zal de ontwikkeling van een stabiele lijn met hogere eiwitexpressie aanzienlijke verbetering van de onderzoeksefficiency.
De afbraak assays hier beschreven kunnen ook worden toegepast op andere verkeerd gevouwen eiwitten. Door de dynamische eigenschap van verkeerd gevouwen proteïnen, moeten deze assays worden gecombineerd met andere analyse om de grondige mechanismen van eiwit kwaliteitscontroles ontdekken. Deze analyses omvatten het meten van de steady state niveaus van eenheden en hun wanden in verschillende celfracties (figuur 1) en het analyseren van eiwitten vouwen of aggregatie met gezuiverd recombinant eiwitten. Deze tests zullen helpen om directe of indirecte effecten van drugs of genexpressie op eiwitafbraak of aggregatie te onderscheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
