Introduction
Le proteine sono macromolecole più abbondanti nelle cellule, e svolgono un ruolo essenziale in quasi tutti i processi biologici. L'attività biologica della maggior parte delle proteine richiede la loro piegatura in, e mantenendo, i nativi strutture tridimensionali. Proteine con conformazioni aberranti non solo perdono le loro normali funzioni, ma anche spesso formano specie oligomeriche solubili o aggregati che compromettono le funzioni di altre proteine e sono tossici per le cellule 1,2. Per contrastare misfolding, le cellule utilizzano entrambe le chaperon molecolari, che assistono polipeptidi non piegati o parzialmente piegati per raggiungere la loro conformazione nativa, e vie di degradazione, che eliminano le proteine mal ripiegate 3. Data la complessità e la natura stocastica del processo di piegatura, proteine misfolding è inevitabile, e non può essere invertito nel caso di mutazioni, errori biosintetici e danni post-traduzionali 1. Quindi, in ultima analisi, le cellule si basano su degradatpercorsi di ioni per mantenere la qualità delle proteine.
L'importanza del controllo della qualità delle proteine cellulari (PQC) sistemi è sottolineata dalla prevalenza di malattie proteine misfolding, tra cui il cancro, il diabete, e molte malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Huntington (HD), e atassie spinocerebellari (SCA) 4,5. Ad esempio, le mutazioni nel p53 soppressore del tumore è la singola lesione più frequentemente genetico nei tumori, associata a ~ 50-70% di tutti i casi 6. Una frazione sostanziale di p53 mutazioni sono mutazioni missenso che alterano la conformazione di p53, che porta alla formazione di aggregati 7. Inoltre, le proteine con tratti polyQ espanse sono geneticamente e patologicamente associati con HD e SCA. Queste malattie progressive e spesso fatali manifesta quando la lunghezza del tratto polyQ nelle proteine coinvolte supera un certo THREStenere, e diventa sempre più gravi come la lunghezza del tratto polyQ prolunga 8.
Un approccio interessante per il trattamento di queste malattie è quello di rafforzare i sistemi terapeuticamente PQC cellulari, in particolare le vie di degradazione. Tuttavia, i meccanismi coinvolti nella degradazione delle proteine difettose, in particolare quelli in cellule di mammifero, rimangono poco conosciuti. Anche se è stato riconosciuto che il proteasoma è di fondamentale importanza per la degradazione di proteine mal ripiegate, una questione vitale rimane indefinito: come proteine mal ripiegate sono specificamente riconosciuti e mirati per la degradazione. Inoltre, anche se i sistemi PQC sono stati identificati in compartimenti cellulari compreso il citoplasma, il reticolo endoplasmatico, e il mitocondrio, i sistemi PQC nel nucleo rimangono poco chiari 2.
Recenti studi nostro laboratorio hanno identificato un sistema che riconosce e degrada una varietà di proteine mal ripiegate nel nucleocellule di mammiferi 9. Questo sistema è composto da proteine promielocitica (PML), una proteina nucleare e un membro della famiglia di proteine tripartita motivo contenenti (TRIM), e RNF4, un anello di dominio contenenti proteine. PML, e diverse altre proteine TRIM, in possesso di SUMO (piccolo modificatore ubiquitina-simile) E3 ligasi attività, che facilita la specificità e l'efficienza delle proteine SUMOylation 10. RNF4 appartiene a un piccolo gruppo di ubiquitina ligases SUMO mirati (Stübl), che contengono uno o più motivi di sumo-interagenti (SIMS) in aggiunta al dominio anello che consente loro l'attività ubiquitina ligasi 11. Abbiamo scoperto che PML riconosce specificamente proteine mal ripiegate attraverso discrete siti di riconoscimento substrato che può discernere caratteristiche distinte sulle proteine mal ripiegate. In seguito al legame, tag PML misfolded proteine con poli-catene di Sumo2 / 3, due quasi identici proteine SUMO mammiferi che possono formare poli-catene a causa dell'esistenza di un sito SUMOylation interna. Sproteine mal ripiegate UMOylated vengono poi riconosciuti da RNF4, che conduce alla loro degradazione ubiquitination e del proteasoma. Abbiamo inoltre dimostrato che il sistema di PML-RNF4 è importante per la protezione contro la neurodegenerazione, come carenza di PML aggrava i difetti comportamentali e neuropatologici di un modello murino di tipo SCA 1 (SCA1) 9.
Per distinguere la degradazione delle proteine da altri meccanismi cellulari che possono regolare i livelli di proteine, i tassi di turnover proteico è stato misurato 9. Tra i metodi più frequentemente utilizzati per determinare il ricambio proteico sono inseguimento del polso e cicloesimide Chase (CHX). Questi due metodi esaminano nel tempo, rispettivamente, le proteine con radioisotopo di interesse in cellule di traduzione-abile e proteine totali preesistenti di interesse in cellule di traduzione inibito. Tuttavia, una grande sfida per studiare proteine patogeni e misfolding incline è che l'emivita di queste proteine può essere estremamente long. Ad esempio, Ataxin-1, Ataxin-7, huntingtina, α-sinucleina e TDP-43 tutti hanno tempi di dimezzamento di più di 12 a 24 ore 9,12-16. I tassi di turnover lente di queste proteine precludono l'uso dell'analisi CHX chase perché le cellule che ospitano queste proteine non possono sopravvivere inibizione traduzione prolungata, particolarmente perché le proteine mal ripiegate stessi possono essere altamente tossici per le cellule. L'analisi pulse-chase con etichettatura isotopica può anche essere difficile per le proteine che sono altamente aggregazione-prona. La maggior parte dei saggi pulse-chase basano su immunoprecipitazione per separare la proteina di interesse da tutte le altre proteine che sono anche marcato radioattivamente. Questa procedura normalmente include procedure di immunoprecipitazione e di lavaggio lunghi, durante i quali gli aggregati SDS-insolubili possono formare, rendendo l'analisi con SDS-PAGE elettroforesi imprecisa.
Qui un protocollo per analizzare le proteine mal ripiegate nucleari con un tasso di turnover lento è descritto 9. Una forma patogena di Ataxin-1 (ATXN1) che contiene un tratto di 82 glutamines (ATXN1 82Q) viene utilizzato per questo scopo 8. Quando espresso in cellule, una maggiore green fluorescent protein (GFP) fusione di forme ATXN1 82Q microscopiche inclusioni visibili nel nucleo (Figura 1A). Analisi Pulse caccia rivela che il tempo di dimezzamento di Ataxn1 82Q è di oltre 18 ore 9. ATXN1 82Q è composta da specie con conformazioni mal ripiegate di caratteristiche diverse, nonché specie con conformazione nativa. È probabile che queste specie sono degradati a velocità diverse, e pertanto dovrebbe essere analizzato separatamente. Lisati da ATXN1 82Q-GFP-cellule che esprimono sono frazionati in NP-40-solubili (solubile o NS, probabilmente rappresentano proteine native o mal ripiegate proteine monomeriche / oligomerica) e (NI, aggregati / misfolded) porzioni NP-40-insolubile. Quest'ultimo può essere ulteriormente suddiviso in SDS-solubili (SS; probabili aggregati disordinati) o SDS-resistente (SR; probabili fibrille amiloidi) Frazioni (Figura 1B). frazioni NS e SS possono essere analizzati mediante SDS-PAGE seguita da western blotting, mentre la frazione SR può essere rilevato tramite saggi filtro di ritardo seguiti da immunoblotting. CHX chase è combinato con il metodo di frazionamento del detersivo, e ha scoperto che l'emivita di SS ATXN1 82Q è molto più breve di quella di NS ATXN1 82Q e totale ATXN1 82Q (Figura 2A), indicando che la frazione SS può essere facilmente riconosciuto e degradato nelle cellule 9. Così, questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la dinamica di proteine mal ripiegate e per confrontare il loro modello di degrado.
Noi descriviamo anche un metodo che è adatto per screening ad alta per identificare macromolecole o piccoli composti che possono modulare la degradazione delle proteine mal ripiegate. Questo metodo si basa su un mutante conformazionalmente destabilizzata di lucciola luciferasi (LucDM) 17, un substrato modello di chaperone. Abbiamo fusibiled LucDM ad un segnale di localizzazione nucleare (NLS) per sondare il sistema PQC in questo compartimento cellulare, e GFP (NLS-LucDM-GFP) per comodità di rilevamento. Forme NLS-LucDM-GFP microscopicamente aggregati nucleari visibili in una piccola percentuale di cellule (Figura 3A). Simile a ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-ma non la sua wild-type omologo NLS-LucWT-GFP-viene modificato da Sumo2 / 3 e regolamentata dalla via PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP costituisce anche SS e le specie SR, anche se le quantità relative di SS e di specie SR sono minime rispetto a NS, utilizzando le condizioni di cui al protocollo 3. Per semplificare l'analisi, abbiamo solo analizziamo SDS LucDM solubile (compresi sia gli NS e frazioni SS) per SDS-PAGE e Western Blot. Importante, assay chase CHX mostrato che l'emivita di SDS-solubile NLS-LucDM-GFP è molto più breve di quella del suo wild-type controparte (Figura 3B), suggerendo che LucDM è un substrato specifico per il sistema che riconosce e si degradaproteine mal ripiegate.
La degradazione di LucDM-GFP provoca un calo significativo segnale complessivo di fluorescenza. Pertanto, abbiamo anche sviluppato un protocollo per la rilevazione in tempo reale di cellulari LucDM-GFP mediante test a base di fluorescenza micropiastre. Molti sistemi schermo high-throughput (HTS) sono sviluppati per i farmaci o geni modificatori aggregati cellulari e vitalità cellulare causate da proteine aberranti 18-20. Tuttavia, molto pochi HTS sono specificamente progettati per il targeting degrado in cellule di mammifero. Questo protocollo serve come sistema robusto per analisi rapide e su larga scala degli effetti di espressione proteica, l'abbattimento e trattamento farmacologico sulla degradazione di proteine misfolded cellulare. Utilizzando cellule HeLa come ad esempio, di seguito descriviamo i protocolli per l'analisi di queste due proteine mal ripiegate. I saggi possono essere applicati anche ad altre linee cellulari, anche se può essere necessario ottimizzato per singole linee cellulari condizioni di trasfezione e decorso.
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Protocol
1. Preparazione del reagente
- Preparare tampone di lisi cellulare (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 0,5% NP-40). Supplemento 2 mM DTT, 1x completo cocktail proteasi, e 250 UI / ml benzonasi prima dell'uso.
- Preparare tampone per sedimento (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl 2). Supplemento 2 mM DTT, 1x completo cocktail proteasi e 250 UI / ml benzonasi prima dell'uso.
- Preparare tampone di ebollizione 3x (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplemento 150 mM DTT prima dell'uso.
- Preparare terreno DMEM bassa fluorescenza per i test che utilizzano lettore di micropiastre a fluorescenza. Mescolare 25 mM glucosio, 0,4 mm glicina, 0,4 mm arginina, 0,2 mM cisteina, 4,0 mm glutammina, 0,2 mM istidina, 0,8 mm isoleucina, 0,8 mm leucina, 0,8 mm lisina, 0,2 mM metionina, 0,4 mm fenilalanina, 0,4 mm serina, 0,8 mM treonina, triptofano 0,078 mM, 0,4 mm tirosina, valina 0,8 mm, 1,8 mm CaCl 2, 0,81 mM MgSO 4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO 3, 110 mM NaCl, 0,9 mmNaH 2 PO 4. Regolare il pH della soluzione con HCl o NaOH a pH 7,4. Sterilizzare il medium attraverso la filtrazione.
NOTA: Questo terreno contiene componenti del terreno standard DMEM con elevato glucosio, tranne che Fe (NO 3) 3, vitamine e rosso fenolo vengono omessi. Fenolo rosso, riboflavina e pyridoxal a regolare terreno di coltura DMEM significativamente interferisce con il rilevamento del segnale di fluorescenza 21. Terreno di coltura senza quei componenti è fondamentale per il successo di imaging GFP cellule vive. Il mezzo è stabile per 12 mesi se conservato in frigorifero.
2. Il degrado del test di ATXN1 82Q GFP
- Piastra di circa 3 x 10 5 cellule HeLa in piastre da 35 mm con terreno DMEM supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS), in modo che dopo O / N cellule di coltura crescere ad una confluenza del 40-60% al momento della transfezione.
NOTA: Il numero di piatti necessari si basa sul numero di punti di tempo e trattamenti described sotto. - Cellule HeLa trasfezione con 0,3 mg di ATXN1 82Q-GFP / pRK5 plasmide in tutti i pozzetti usando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore 9. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e trasfezione reagente e un'aliquota per ogni pozzetto.
- 4-5 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l'espressione della GFP con eccitazione lunghezza d'onda di 450-490 nm. Rientro cellule torna a incubatrice dopo l'imaging.
NOTA: Osservare entrambi i segnali GFP diffusi e piccole macchie di segnali GFP a nucleo in questo momento. - Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e aggiungere 2 ml di DMEM fresco contenente 50 mg / ml CHX. Trattare cellule per 0, 4, 8, 12 e 16 ore con CHX prima della raccolta. Per esaminare la degradazione proteasoma, includere proteasoma inibitore MG132 (10 mM) in una piastra trattate per 16 ore come controllo.
- Raccolto un piatto di cellule in ogni punto. Rimuovere il supporto dal vuoto di aspirazione di und lavare le piastre due volte con 3 ml ghiacciata 1x tampone fosfato salino (PBS). Snap-congelare la piastra in ghiaccio secco.
- Dopo l'ultimo punto di tempo (16 ore), raschiare le cellule congelate (da tutti i punti di tempo) in 150 ml di tampone di lisi cellulare ghiacciato e incubate in ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare i lisati cellulari in una centrifuga da banco a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante, contenente NP-40-solubili proteine (NS), in un'altra provetta con una pipetta.
NOTA: Utilizzare surnatanti per misurare concentrazioni di proteine da saggio Bradford, se necessario. - Lavare il pellet con l'aggiunta delicatamente circa 200 microlitri 1x PBS per i tubi senza disturbare il pellet. Rimuovere con attenzione PBS mediante aspirazione a vuoto o una pipetta. li Risospendere in 150 microlitri di buffer pellet cellulare ghiacciata, seguito da 15-30 min di incubazione in ghiaccio.
NOTA: La frazione sedimento risospeso contiene NP-40 insolubili proteine (NI). Si veda la Figura 1B per un diagram di detergente frazionamento. - Aggiungere 75 ml di 3x tampone bollente in frazioni NS e 40 NP-insolubili frazioni (NI) risospese dal pellet. Riscaldare i campioni a 95 ° C su un blocco di calore per 5 min.
NOTA: Ciuffi nei NP-40 frazioni insolubili sono sciolti dopo il riscaldamento ed i campioni diventerà chiaro. - Aggiungere tampone di caricamento SDS-gel per una aliquota di NS bollite e NI. Caricare uguale volume di campioni raccolti da tutti i punti di tempo a gel SDS-PAGE. Il volume caricato corrisponda a circa 20 mg di NS dal campione prelevato al tempo 0. NOTA: NS, oltre che di proteine SDS-solubili (SS) da NI fazione, possono essere risolti mediante SDS gel separazione. Al contrario, SDS-resistente (SR) aggregati da frazione NI sono bloccati nei pozzetti di gel di carico (Figura 1B). Per migliorare il rilevamento Western Blot, doppio volume di NI può essere caricato.
- Rileva NS e SS ATXN1 82Q-GFP mediante western blot utilizzando un anticorpo anti-GFP e chemiluminescenza (ECL).
NOTA: ATXN1 82Q nella frazione SS è generalmente inferiore rispetto alla frazione NS quando si utilizza questo protocollo. è necessaria più di esposizione per i segnali ECL ottimali. - Esaminare SR ATXN1 82Q dalla frazione pellet mediante saggi ritardo filtro utilizzando un apparato di dot-blot (Figura 1B). In breve, ha istituito un apparato dot-blot in possesso di una membrana di acetato di cellulosa 0,2 micron. Carico 80-120 microlitri di bollito NI in ogni pozzetto dell'apparato dot-blot.
NOTA: Poiché solo piccole quantità di aggregati SR si formano nelle cellule, per il saggio dot blot, caricare un volume della frazione SR che è circa 10-15 volte del volume della frazione NS usato per analisi western blot.- Dopo filtrazione dei campioni attraverso la membrana dal vuoto, aggregati ATXN1 82Q-GFP bloccato sulla membrana può essere rilevato da anti-GFP immunoblotting 9,12,22.
NOTA: Vedere precedenti relazioni 9,12,22 per la descrizione dettagliata del test del filtro di ritardo. Questo passaggio è facoltativoperché SR ATXN1 82Q è minima rispetto a SS e NS frazioni seguenti breve trasfezione descritto in questo protocollo. Inoltre, i livelli di SR ATXN1 82Q in gran parte rimangono gli stessi nel corso CHX Chase (Figura 2B). Tuttavia, è ancora fondamentale per esaminare se le quantità di SS ATXN1 82Q sono influenzati nel tempo per qualsiasi trattamento farmacologico o espressione genica in esperimenti iniziali. Specie proteina SS rimanere in pozzetti di caricamento del gel SDS-PAGE possono essere rilevati mediante western blot. Tuttavia, questo metodo è meno sensibile e genera risultati variabili più (Figura 1B).
- Dopo filtrazione dei campioni attraverso la membrana dal vuoto, aggregati ATXN1 82Q-GFP bloccato sulla membrana può essere rilevato da anti-GFP immunoblotting 9,12,22.
3. Degradazione Assay di NLS-luciferasi-GFP Utilizzando SDS-PAGE e Western Blot
- Piastra di circa 3 x 10 5 cellule HeLa in piastre da 35 mm con terreno DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS). Dopo O / N coltura, una confluenza del 40-60% viene raggiunta al momento della transfezione. Il numero di piatti necessari si basa sul numero di tpunti IME e trattamenti descritti di seguito.
- Cellule HeLa trasfezione con 1,0 mcg NLS-luciferasi-GFP / pRK5 plasmide in tutti i pozzetti usando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore 9. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e reagenti trasfezione per aliquota di ogni bene.
- Dopo O / N trasfezione (circa 15 ore), esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l'espressione della GFP con eccitazione lunghezza d'onda di 450-490 nm. Rientro cellule torna a incubatrice dopo l'imaging.
NOTA: Diffusa segnale GFP nucleare può essere osservato nella maggior parte delle cellule (70%). Una piccola percentuale (5%) di cellule hanno aggregati nucleari. - Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e aggiungere 2 ml di DMEM fresco contenente 50 mg / ml CHX. Il trattamento di cellule per 0, 1.5, 3, 4,5 e 6 ore con CHX prima della raccolta. Per esaminare la degradazione del proteasoma, includere ulteriori MG132 inibitore del proteasoma (10 micron) in una piastra trattati per 6 ore come controllo.
- Raccolto un piatto di cellule in ogni punto. Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto e lavare due volte le piastre con 3 ml ghiacciata tampone fosfato salino (PBS). Snap-congelare la piastra in ghiaccio secco.
- Dopo l'ultimo punto di tempo (6 ore) è terminata, cellule congelate a tutti i tempi punti vengono raschiati in 150 ml di tampone di lisi cellulare ghiacciato e incubate in ghiaccio per 30 min.
- Aggiungere SDS tampone di gel-loading di lisati cellulari totali per una concentrazione finale del 2% SDS e 50 mM DTT. Incubare i campioni su un blocco di calore a 95 ° C per 5 min.
- Analizzare NLS-luciferasi-GFP mediante SDS-PAGE e Western Blot utilizzando anticorpi anti-GFP. Caricare uguale volume di campioni raccolti da tutti i punti di tempo a gel SDS-PAGE. Il volume caricato corrisponde a circa 20 mg di lisati cellulari intero da campione prelevato al tempo 0.
4. in tempo reale degradazione Assay di NLS-luciferasi-GFP Usando fluorescenza lettore di micropiastre
- Seme di circa 1 x 10 4cellule HeLa in 96 pozzetti piastre di coltura di tessuto nero con fondo trasparente. Dopo O / N coltura, una confluenza del 50-70% viene raggiunta al momento della transfezione.
NOTA: 60 ml di mezzo contenente cellule HeLa completamente in sospensione sono seminati direttamente in tutti i pozzetti. Non aggiungere ulteriore piatto di medie o rock avanti e indietro dopo la semina, in caso contrario le cellule possono essere distribuiti in modo non uniforme. - Cellule HeLa trasfezione con 0,05-0,1 mg di NLS-luciferasi-GFP / pRK5 plasmide 9 in ogni pozzetto utilizzando il reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore. Fare un master mix trasfezione contenente DNA e trasfezione reagente e un'aliquota per ogni pozzetto. Tre pozzetti con cellule non sono trasfettate con DNA, che serve come controllo per il segnale fluorescenza per ogni condizione di trattamento.
NOTA: Un modo alternativo per ridurre le variazioni transfezione è trasfezione le cellule prima della semina. Tuttavia, una grande porzione di cellule trasfettate con la proteina misfoldeds non riescono a collegare o mostrare la vitalità ridotta utilizzando questo metodo. E 'probabile che alcune cellule non possono sopportare lo stress causato dalla tripsina digestione quando esprimono le proteine mal ripiegate tossici. Come risultato, il segnale fluorescente complessiva è significativamente ridotta. - 20-24 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule vive sotto un microscopio a fluorescenza invertito per l'espressione della GFP con eccitazione lunghezza d'onda di 450-490 nm.
- Rimuovere il mezzo con aspirazione a vuoto. Aggiungere circa 200 ml PBS 1X a ciascun bene e poi aspirare per rimuovere quantità residua di terreno DMEM.
- Aggiungere 60 ml di bassa fluorescenza media DMEM con il 5% FBS e 50 ug / ml CHX. Per esaminare la degradazione del proteasoma, includere ulteriori MG132 inibitore del proteasoma (10 micron) in una serie di campioni. Set triplicato di pozzi per ogni trattamento / condizione.
NOTA: il trattamento MG132 è incluso come controlli per la degradazione del proteasoma, perché è fondamentale per escludere altri fattori che possono causare goccia di fluoSegnale rescence, tra cui la morte cellulare e fluorescenza tempra. - Misurare il segnale di fluorescenza di GFP immediatamente su un lettore di piastre a fluorescenza dopo l'aggiunta di CHX.
NOTA: Le impostazioni di misura software sono riportate in Tabella 1. - Leggere la piastra ogni ora per un massimo di 8-10 ore. Dopo aver letto, riportare la piastra posteriore di coltura cellulare incubatore.
- Esportare i dati come file di foglio di calcolo. Utilizzare valore medio di multi-letture per ciascun pozzetto come intensità di fluorescenza. Normalizzare i valori di ciascun punto di dati per i valori medi del Tempo 0 nei rispettivi gruppi. Tracciare l'intensità di fluorescenza normalizzato nel tempo, come mostrato in Figura 4A e 4B, e la figura 5, pannelli a destra.
- Effettuare analisi statistiche delle velocità di degradazione tra due condizioni utilizzando ANOVA a due vie con misure ripetute 23.
NOTA: In questa analisi, "intensità di fluorescenza" è la variabile dipendente, mentre "treatmcondizioni ENT "e" tempo "sono i due fattori. Invece di confrontare dati a singoli punti di tempo, ANOVA a due vie con misure ripetute analizza la differenza tra i due gruppi di trattamento durante l'intero corso del tempo.
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Representative Results
In un'analisi stato stazionario, microscopicamente visibili aggregati nucleari ATXN1 82Q-GFP possono essere osservati in 30 - 50% di cellule HeLa 20 ore dopo la trasfezione (Figura 1A). Analisi Western blot delle frazioni NS e SS con anticorpo anti-GFP mostra una banda distinta ATXN1 82Q-GFP tra 100 kDa e 150 kDa marcatori, corrispondente al peso molecolare della proteina (Figura 1B). ATXN1 82Q-GFP nella frazione SR può essere rilevata mediante saggio ritardo filtro o mediante SDS-PAGE e western blot come specie nella parte superiore del gel di impilamento (Figura 1B). Per l'analisi emivita usando il protocollo descritto sopra, CHX inseguimento inizia 4-5 ore dopo la trasfezione iniziale prima che si formano eventuali grandi aggregati nucleari. L'emivita di ATXN1 82Q-GFP nella frazione SS è di circa 5 ore, in contrasto con una scarsa o nessuna diminuzione di ATXN1 82Q-GFP nella frazione NS oltre 16 ore (Figura 2A). il Degradazione di ATXN1 82Q-GFP è parzialmente inibita trattando le cellule con MG132 (Figura 2A). Abbiamo precedentemente dimostrato che PML stimola la degradazione delle proteine misfolded promuovendo la loro SUMOylation. Qui usiamo PML atterramento come un esempio di percorso di degrado alterato. PML siRNA trattamento prolungato l'emivita di ATXN1 82Q-GFP nella frazione SS (Figura 2A). Nessuna modifica evidenti SR ATXN1 82Q-GFP vengono rilevati sia in controllo o cellule PML siRNA-trattati (Figura 2b e 2c).
Venti ore dopo la trasfezione, aggregati NLS-LucDM-GFP diventano visibili al microscopio a 5 - 15% delle cellule HeLa, ma questo può variare a seconda delle quantità di DNA che vengono transfettate (Figura 3A). L'emivita di SDS solubile NLS-LucDM-GFP è 2 - 3 ore (Figura 3B e 3C). L'intensità di fluorescenza delle cellule trasfettate diminuisce anche oltremomento previo trattamento CHX (Figura 4A e 4B). Sei ore dopo il trattamento CHX, l'intensità di fluorescenza raggiunge uno stadio stabile e smette di diminuire (Figura 4A e 4B). Allo stesso tempo punto, solubile NLS-LucDM-GFP è sostanzialmente degradato (Figura 3B e 3C), suggerendo che la fluorescenza rimanente viene generato da specie aggregate resistenti alla degradazione. Coerentemente, aggregati, ma non diffusa, GFP rimane in cellule 9 ore dopo il trattamento CHX (Figura 4C). È interessante notare, trasfezione utilizzando una maggiore quantità di NLS-LucDM-GFP plasmide genera aggregati più nucleari nonché maggiore intensità di fluorescenza residua, anche se il tasso di degradazione non viene influenzata (Figura 4A e 4B). Utilizzando uno SDS-PAGE seguita da western blot o la lettura della fluorescenza, siamo in grado di rilevare l'inibizione della degradazione NLS-LucDM-GFP mediante trattamento MG132 o PML siRNA (Figure 3C, 4A, 4B e 5).
Figura 1. Individuazione di ATXN1 82Q-GFP mediante microscopia a fluorescenza e detersivo frazionamento. (A) cellule HeLa sono state trasfettate con ATXN1 82Q-GFP e macchiato con DAPI. Le singole immagini e unite sono mostrati. Barra di scala = 10 micron. (B) Un diagramma che mostra il frazionamento detergente Atxn1-82Q cellule che esprimono come descritto nel protocollo 2. marcatori di peso molecolare sono indicati sul lato sinistro di immagini Western Blot di ATXN1-ATXn 82Q. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
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. Figura 2. saggio di degradazione di ATXN1 82Q-GFP usando un detergente frazionamento cellule HeLa sono stati precedentemente trattati con il controllo (-) o PML siRNA (A e C) o non-trattati (B). Le cellule sono state trasfettate con ATXN1 82Q-GFP e trattati con CHX in assenza o presenza di MG132. Frazioni del lisato sono stati analizzati mediante SDS-PAGE seguita da Western Blot (A, per frazioni NS e SS) o dosaggio ritardo del filtro (B e C, per frazione SR) utilizzando un anticorpo anti-GFP. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Analisi del degrado NLS-LucDM-GFP per fluorescenza MICRcellule HeLa (A) oscopy e Western blot. trasfettate con NLS-LucDM-GFP sono state colorate con DAPI. Le singole immagini e unite sono mostrati. Barra di scala = 25 micron. Arrowhead indica una cella con aggregati nucleari. Cellule (B e C) HeLa sono state trasfettate con NLS-LucDM-GFP e la wild-type fusione luciferasi proteina NLS-LucWT-GFP (B), o trasfettate con controllo o PML siRNA, seguito da trasfezione con NLS-LucDM-GFP ( C). Le cellule sono state trattate con CHX e MG132 come indicato. lisati cellulari interi sono stati analizzati mediante western blot utilizzando anticorpi anti-GFP. Immagine viene modificato dal precedente pubblicazione con il permesso 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. fluorescente saggio su micropiastra per degradazione NLS-LucDM-GFP. Cellule HeLa seminate su piastre da 96 pozzetti sono state trasfettate con 0,05 mg (A) o 0.1 mg (B e C) NLS-LucDM-GFP e trattato con CHX nel presenza o assenza di MG132. (A e B) fluorescenza intensità di pozzi sono stati misurati nei punti di tempo indicato (valori medi ± deviazioni standard, n = 3). I pannelli a sinistra mostrano la lettura originale di fluorescenza, mentre i pannelli di destra mostrano i valori normalizzati di letture al tempo 0 nei rispettivi gruppi di trattamento. La differenza tra i gruppi trattati con e senza MG132 è stato analizzato mediante ANOVA a due vie con misure ripetute. valori di P tra i due gruppi di trattamento sono indicati. (C) Wells sono stati esaminati prima o dopo il trattamento CHX 9 ore, o dopo CHX e MG132 trattamento, al microscopio a fluorescenza. Per mostrare meglio entrambe le celle con brillante aggregato NLC-LucDM-GFP e quelli con proteine diffusa fioca, valore gamma di 1,5 è stato applicato a tutte le immagini. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Un tasso di degradazione del NLS-LucDM-GFP ridotta nelle cellule PML atterramento. Cellule HeLa precedentemente trattati con controllo o PML siRNA sono state seminate in piastre da 96 pozzetti. Degradazione di NLS-LucDM-GFP è stato analizzato come descritto nella Figura 4 (ANOVA a due vie; p <0,0001). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 6. fluorescenza di ATXN1 82Q-GFP rimane invariato nel CHX inseguimento. Cellule HeLa sono state trasfettate con ATXN1 82Q-GFP. 24 ore dopo la trasfezione, il degrado di ATXN1 82Q-GFP è stato analizzato come descritto nella Figura 4. La figura mostra la lettura originale di fluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. assay micropiastra fluorescente per la degradazione delle cellule citoplasmatici LucDM-GFP. HeLa seminate su piastre da 96 pozzetti sono state trasfettate con 0,1 ug LucDM-GFP trattati con CHX in presenza o assenza di MG132. I risultati sono stati analizzati come descritto in figura 4 (ANOVA a due vie; p <0,0001).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1 .: Impostazioni della misurazione sul lettore di micropiastre in fluorescenza.
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Discussion
I meccanismi che regolano la degradazione delle proteine misfolded sono essenziali per mantenere l'omeostasi delle proteine cellulari, e che probabilmente rappresentano bersagli farmacologici preziose per trattare malattie neurodegenerative e altre malattie proteine misfolding. Qui, saggi che esaminano la degradazione delle proteine misfolded sono descritti, utilizzando una proteina patogena ATXN1 (ATXN1 82Q) ed un mutante nucleare localizzata luciferasi (NLS-LucDM) come esempi.
Per esaminare la degradazione ATXN1 82Q, che ha un tempo di dimezzamento più di 18 ore, abbiamo introdotto un nuovo metodo, combinando frazionamento cellulare con CHX classica 9. Questo metodo ha rivelato un gioco molto più veloce della specie mal ripiegate di ATXN1 82Q nel corso del tempo. Inoltre, l'introduzione di LucDM fornisce un modello misfolded substrato per studiare i meccanismi di degradazione generali di proteine mal ripiegate. Per affrontare la necessità di un sistema HTS per la rilevazione di degradazione delle proteine misfolded in cellule di mammiferos, abbiamo sviluppato un test rapido degrado per LucDM con lettore di micropiastre a fluorescenza. Il sistema serve come un potente strumento per schermi chimici e genetici.
La proteina ATXN1 82Q è presente in NS, SS, e le frazioni SR di lisati cellulari. Le frazioni SR diventano sempre più frequenti durante cultura prolungata dopo la trasfezione, suggerendo che è in una forma che è difficile essere riverito o degradate, per esempio, le fibrille amiloidi. Generazione di specie misfolded tossiche o aggregati che non possono essere facilmente degradati possono bloccare vie di degradazione della proteina, impedendo l'analisi di macchinario cellulare endogena controllo proteine aberranti 24, 25,26. Per evitare la formazione di una grande quantità di SR, iniziamo CHX chase 4-5 ore dopo la trasfezione iniziale. Abbiamo scoperto che questo è critico per l'analisi delle condizioni cellulari che possono ritardare la degradazione della frazione SS. Oltre al tempo transfezione, è anche fondamentale non sovraWhelm cellule esprimendo la proteina ATXN1 82Q a livelli molto alti. Se non si osservano o molto lento degrado per tutte le frazioni, minore quantità di ATXN1 82Q plasmide deve essere usato per la trasfezione. Idealmente, il dosaggio dovrebbe essere finito entro 12 ore le cellule apoptotiche sono notati al di là di questo punto di tempo. In figura 2A, la quantità di SS ATXN1 82 alle cellule di controllo è sorprendentemente diverso da quello in cellule PML siRNA-trattati più corti 8 ore. Attenzione deve essere presa se un diverso gruppo trattato si osserva solo oltre 12 ore, come può essere causato da altri fattori che influenzano la vitalità cellulare anziché degradazione proteica.
Rispetto al NS ATXN1 82Q, ATXN1 82Q nella frazione SS viene eliminato rapidamente, indicando che essa rappresenta una specie di mal ripiegate che possono essere facilmente degradato dal proteasoma (Figura 2A). Al contrario, i livelli di SR ATXN1 82Q rimangono invariate nel corso stesso tempo (Figura 2B), confermandoche si tratta di una specie non-degradabili. Ancora, l'analisi della frazione SR dovrebbe essere importante per analizzare meccanismi che rimuove direttamente aggregati citoplasmatici (ad esempio, autofagia) o influenzare la formazione di questi aggregati. Notevolmente, MG132 sembra essere meno efficace nel prevenire ATXN1 82Q diminuzione della frazione di SS. Ciò può essere causato da un innalzamento dei livelli di ROS su inibizione del proteasoma 27, che potrebbero promuovere l'aggregazione di ATXN1 82Q.
Un grande vantaggio di dosaggio LucDM-GFP è che può essere adattato per l'analisi HTS utilizzando lettore di piastre a fluorescenza. Inizialmente abbiamo cercato di sviluppare un sistema HTS per ATXN1 82Q. Tuttavia, poiché solo una piccola frazione di proteine complessiva ATXN1 82Q è degradata nel corso del tempo, la fluorescenza delle cellule che esprimono GFP-ATXN1 82Q rimane sostanzialmente invariata nel corso di CHX Chase (Figura 6). Altre proteine mal ripiegate con una lunga emivita nel complesso avrebbero problemi simili con in tempo reale Fluorsaggio escent. Al contrario, si osserva una notevole diminuzione di proteine complessiva NLS-lucDM-GFP (figure 3 e 4). Questa caratteristica, insieme alla sua breve emivita (2-3 ore), consente di questo substrato chaperone modello da essere facilmente rilevato da spettroscopia di fluorescenza. In studi precedenti, proteine GFPu, GFP fusa ad un segnale di degrado costruttiva (CL-1), è stato ampiamente impiegato come reporter per la funzionalità del sistema ubiquitina-proteasoma 28,29. E 'anche un importante proteina misfolded surrogata in modelli cellulari e animali 30. Rispetto a GFPu, un vantaggio del test degradazione qui descritto è che luciferasi misfolded è un substrato modello di chaperone ampiamente utilizzato. Esaminando attività della luciferasi, si può facilmente valutare le conformazioni native, denaturati, e ripiegati di luciferasi in vitro e in vivo. Così, il nostro sistema funge da piattaforma molto utile per collegare legame proteico e pieghevoli saggi consistema di degradazione cellulare utilizzando lo stesso substrato 9.
Attraverso la misurazione in tempo reale della fluorescenza i seguenti valori possono essere ottenuti: L'intensità di fluorescenza di partenza, intensità di fluorescenza rimane stabile e proteine emivita. Questi valori sono correlati, rispettivamente, con la quantità di proteina generale prima chase, quantità di proteine resistenti alla degradazione, e il tasso di turnover proteine. Pertanto, è possibile utilizzare di fluorescenza in tempo reale per fare un'analisi completa dei livelli e dinamiche di diverse specie di proteine mal ripiegate. Occasionalmente, si osserva una relativamente grande variazione della fluorescenza di partenza tra le repliche (ad esempio, figura 5, pannello di sinistra). Questo rischia di essere causato da variabilità di semina cellulare o trasfezione. Tuttavia, nonostante la differenza di intensità di fluorescenza di partenza, il segnale di tutti i replicati scende ad un tasso molto simile. La normalizzazione dei segnali from ogni punti di tempo per l'intensità al tempo 0 possono ridurre la variazione well-to-bene e in modo più accurato riflette i tassi di degradazione (Figura 4A, 4B e Figura 5, a sinistra rispetto a pannelli a destra).
Oltre alla forma nucleare, abbiamo anche analizzato citoplasmatica LucDM-GFP. Cytoplasmic LucDM-GFP ha un modello degrado simile eccezione è stata osservata più alta percentuale di carica residua fluorescenza quando la stessa procedura sperimentale è stato applicato come descritto nel protocollo 4 (figura 7). Il degrado potrebbe essere completamente inibita MG132, indicando questo test può essere utilizzato per monitorare il controllo citoplasmatica qualità delle proteine attraverso la degradazione del proteasoma. Per gli studi futuri, sarebbe interessante per esplorare se LucDM-GFP può essere applicato ad altri compartimenti cellulari, ad esempio, i mitocondri o reticolo endoplasmatico, quando fuso di segnali di localizzazione compartimento cellulare specifici.
Come notato nel protocollo per il test di fluorescenza a base, è fondamentale utilizzare medio bassa fluorescente per ridurre sfondo fluorescente e di utilizzare master mix di DNA e trasfezione reagente per ridurre le variazioni trasfezione well-to-bene. Il controllo del guadagno può essere regolato su alcuni lettori di piastre a fluorescenza. È importante impostare il guadagno manuale anziché ottimizzato e utilizzare lo stesso valore per tutta l'intero test (Tabella 1). Il valore del guadagno può essere regolato per massimizzare la lettura della fluorescenza GFP cellulare finché la lettura non va oltre il limite di rilevazione.
Allo stato attuale, siamo ancora affidamento su trasfezione di esprimere LucDM. Per ridurre la variazione e semplificare il test per HTS, un obiettivo futuro è quello di stabilire una linea cellulare stabile con l'espressione inducibile di LucDM. Tuttavia, come micropiastre e terreno di coltura entrambi hanno fluorescenza di fondo, è fondamentale avere il segnale GFP significativamente superiore a quello di sfondo. Purttunatamente, le linee stabili abbiamo stabilito di recente tutti hanno una bassa espressione di LucDM. Pertanto, lo sviluppo di una linea stabile con l'espressione proteica superiore migliora significativamente l'efficienza di screening.
I saggi di degradazione qui descritti possono essere applicati anche ad altre proteine mal ripiegate. A causa della caratteristica dinamica di proteine mal ripiegate, questi test devono essere accoppiato con altre analisi per scoprire i meccanismi approfondita di controlli di qualità delle proteine. Queste analisi comprendono la misurazione dei livelli allo steady state di aggregati e delle loro partizioni in diverse frazioni cellulari (Figura 1) e l'analisi di proteine pieghevoli o l'aggregazione utilizzando proteine ricombinanti purificate. Questi test aiuteranno a distinguere gli effetti diretti o indiretti di espressione genica farmaco o sulla degradazione delle proteine o aggregazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
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