Abstract
ووصف طريقة حيث الكم نقطة (QD) النانوية يمكن أن تستخدم للدراسات immunocytochemical المترابطة من الأنسجة علم الأمراض البشرية باستخدام widefield مضان المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني انتقال (تيم). للتدليل على بروتوكول قمنا immunolabeled أقسام الايبوكسي سامسونج الورم ورم سوماتوستاتيني البشري باستخدام الأجسام المضادة الأولية لالسوماتوستاتين، تليها الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز والتصور مع streptavidin مترافق 585 نانومتر الكادميوم والسيلينيوم (سيلينيد الكادميوم) نقاط الكم (نقاط الكمية). هي التي شنت المقاطع على تيم شبكة عينة ثم توضع على شريحة زجاجية للمراقبة من قبل widefield المجهر الضوئي مضان. المجهر الضوئي تكشف عن 585 نانومتر QD وضع العلامات، مضان برتقالية زاهية تشكيل نمط محبب داخل سيتوبلازم الخلية السرطانية. في منخفض للتضخم متوسطة المدى بواسطة المجهر الضوئي نمط العلامات يمكن التعرف عليه بسهولة ومستوى وضع العلامات غير محددة أو خلفية تقييمها. هذا هو حرجةخطوة للتفسير لاحق من نمط immunolabeling بواسطة تيم وتقييم سياق الصرفي. ونشف القسم نفسه ثم الجافة وينظر إليها من قبل تيم. وينظر تحقيقات QD لضمها الى مواد غير متبلور الواردة في حبيبات إفرازية الفردية. يتم الحصول على الصور من نفس المنطقة ذات الاهتمام (ROI) التي اطلعت عليها المجهر الضوئي لتحليل مترابط. المقابلة الصور من كل طريقة قد تكون ثم المخلوطة لتراكب البيانات مضان على تيم التركيب الدقيق للمنطقة المقابلة.
Introduction
ضوئية مترابط والمجهر الإلكتروني (كليم) هو طريقة فعالة لتحليل أحداث دينامية عابرة 1، والأحداث النادرة 2 و 3 و معقدة أنظمة 4. هناك العديد من التباديل التقنية المختلفة المتاحة 5 اعتمادا على السؤال المطروح ولكن شرط شيوعا هو أن نفس هيكل في عينة واحدة 6 وتصوير بطرائق المجهر متعددة. وقد وضعت لدينا نهج معين لكليم لدراسة أرشيفية الأنسجة أمراض الإنسان وقضية المستخدمة هنا اتسمت بشكل جيد ونشرت سابقا 7. وكان الهدف أولا، إلى تحقيق أقصى قدر من البيانات التحليلية من خزعة واحدة أو عينة جراحية، وثانيا، لاستخدام ضوء مضان المجهر للمساعدة في توضيح سياق نمط العلامات immunocytochemical ينظر في مستوى التركيبية.
البلورات النانوية نقطة الكم (نقاط الكمية) توفر إمكانات علامة عالمية ABL النظامالبريد ليتم عرضه من قبل كل من، وعلى ضوء مضان المجهر والمجهر الإلكتروني 8 و 9 و 10. هم الهيكل الأساسي البلورية يسمح نقاط الكمية من أحجام مختلفة لتوليد مجموعة واسعة من قمم مضان الانبعاثات عند اثارته ضوء بأطوال موجية بعيدا عن أطياف انبعاثاتها 11. وزنها الذري كافية لانتاج كثافة الإلكترونات التي يمكن كشفها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ، المجهر الإلكتروني النافذ (STEM) أو انبعاث المجال المجهر الإلكتروني. وهي مناسبة بشكل خاص للدراسات immunocytochemical حتى نقاط الكمية واحدة يمكن ملاحظة يعطي حساسية في نهاية المطاف من QD واحد لكل جزيء الهدف 12. وعلاوة على ذلك، اعتمادا على QD استخدامها يمكن أن تمتلك توقيع عنصر الفردية مناسبة لرسم الخرائط.
عينات أمراض الإنسان تقدم فوائد كبيرة للبحوث الطبية الحيوية متعدية. وقدم عينات الأنسجة الجراحية وخزعة بشكل روتيني لالبنوك الحيوية ومع appropالأخلاق riate الموافقات يمكن الوصول للدراسات البحثية. لم يقم الأنسجة البشرية المسائل ذات الصلة أو التفسير الذي يمكن أن يحدث في الحيوان أو في نماذج المختبر من المرض. ومع ذلك، وإعداد عينة من عينات علم الأمراض في كثير من الأحيان ليس الأمثل. يمكن أن يكون هناك تأخير في الأنسجة التي توضع في تثبيتي، استخدم مثبت غير ملائمة مثل الفورمالين بدلا من غلوتارالدهيد لتيم وأخذ العينات غير لائقة. طرق كليم لديها القدرة على تحسين المعلومات التشخيصية والنذير المتاحة من عينة بشرية واحدة. ومع ذلك، بعض النهج المترابطة وضعت حديثا مثل تلك التي تستخدم مصغرة مولد القميص الأوكسجين (miniSOG) ليست متاحة للاستخدام في علم الأمراض بسبب الحاجة للعلامة إلى أن المشفرة وراثيا في الخلية من الفائدة 13. لهذا السبب يتعين علينا استكشاف جدوى وضع العلامات QD الأنسجة تيم أعدت بشكل روتيني للدراسات immunocytochemical المترابطة. تطبيق نقاط الكمية إلى الايبوكسي محفورا أو أقسام راتنج الاكريليك من لىخزعة والأنسجة عينات ghtly ألدهيد ثابتة توفر إمكانية الحصول على مترابط المجهر الضوئي مضان والبيانات تيم من عينة واحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الأنسجة تشريح والتثبيت
- الأنسجة تشريح
- تشريح قطعة نسيج من مقطوعة جراحيا ورم عينة أو خزعة الأنسجة.
ملاحظة: الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة تم إصلاح بشكل روتيني في الفورمالين ولكن أنسجة جديدة هي أيضا مناسبة. اخترنا مساحة أكد وذكرت من قبل الطبيب الشرعي التشريحي لاحتواء الورم ورم سوماتوستاتيني بعد تلطيخ النسيجية الروتيني والمناعية المضادة للالسوماتوستاتين (لا يظهر). - استخدام قطعة نسيج لا يزيد حجمها حوالي 1.0 مم 3.
- تشريح قطعة نسيج من مقطوعة جراحيا ورم عينة أو خزعة الأنسجة.
- إعداد العازلة كاكوديلات
- إعداد محلول منظم الأوراق المالية (1 م) وذلك بإضافة 21.4 غرام من كاكوديلات الصوديوم (انظر قائمة المواد) و 3.0 مل من 1٪ محلول كلوريد الكالسيوم إلى 90 مل من الماء المقطر ثم تتصدر يصل الحل إلى الحجم النهائي من 100 مل. تحريك الحل وترك الأمر للوقوف بين عشية وضحاها بحيث يذوب كاشف البلورية بشكل كامل.
- إعداد تثبيتي، واستخدام
- إضافة واحد 10 مل أمبولة من 50٪ من محلول غلوتارالدهيد إلى 20 مل من الصوديوم محلول المخزون كاكوديلات (1 M). أعلى حتى مع الماء المقطر إلى 190 مل. تحقق من درجة الحموضة والتكيف مع 7.4 عن طريق إضافة 1-4 قطرات من حامض الهيدروكلوريك 3٪ (حمض الهيدروكلوريك) إذا لزم الأمر.
- أعلى حتى مع الماء المقطر لجعل الحجم النهائي من 200 مل.
- تزج الأنسجة في تثبيتي تحتوي على 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 M الصوديوم عازلة كاكوديلات 7.4 درجة الحموضة لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية في أنبوب عينة الزجاج. تجاهل تثبيتي غير مستخدمة بعد 1 أسبوع.
2. معالجة الأنسجة والتضمين
- الأوسيميوم Tetroشي ده تلطيخ
- بعد تثبيت اكتمال، تزج الأنسجة العازلة في كاكوديلات الصوديوم (0.1 م) لمدة 20 دقيقة ثم كرر لمدة 20 دقيقة أخرى.
- إعداد 2٪ الأوسيميوم مائي رباعي أكسيد (أوسو 4) حل العاملة بإضافة 8.0 مل من 5٪ أوسو حل 4 الأوراق المالية إلى 2.0 مل من محلول الصوديوم كاكوديلات المخزونات الاحتياطية (1 M) و 10.0 مل من الماء المقطر لجعل الحجم النهائي لل 20.0 مل.
- إزالة المنطقة العازلة ثم تزج في الأنسجة في 2٪ أوسو 4 في 7.4 درجة الحموضة لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه! توخي الحذر عند الصب وإعداد أوسو 4 الحلول، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والعمل في غطاء الدخان في جميع الأوقات.
- اليورانيل خلات تلطيخ
- بعد المعاملة بالأوزميك الأنسجة كاملة، وإزالة حل أوسو 4 وتزج الأنسجة في 2٪ خلات الصوديوم لمدة 10 دقيقة. إزالة 2٪ خلات الصوديوم ثم تزج في 2٪ خلات اليورانيل لمدة 1 ساعة فيدرجة حرارة الغرفة.
- جفاف
- يذوى الأنسجة من خلال الكحول متدرج. استخدام 50٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 95٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة وتغييرين من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة.
- أداء تغييرين من 100٪ الأسيتون لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
- الراتنج الإشباع وعلاج
- مزيج راتنجات الايبوكسي اللزوجة المنخفضة في كوب البولي ايثيلين المتاح. إضافة 10.0 غرام من ثاني أكسيد الفينيل الهكسين الحلقي (ERL 4221) مونومر الايبوكسي، 6 غرام من diglycidyl الأثير غليكول البولي بروبلين (DER 732) و26،0 غرام من السكسينك nonenyl (NSA). يقلب جيدا باليد باستخدام العصي الخشبية لمدة 2 دقيقة.
- إضافة خمسة عشر قطرات من 2 dimethylaminoethanol مسرع (DMAE) الايبوكسي ويقلب مرة أخرى لمدة 2 دقيقة. احرص على مزيج تماما مكونات ERL، DER وكالة الأمن القومي قبل إضافة مسرع DMAE.
- بدء التشريب راتنج من الأنسجة عن طريق استبدال 100٪ الأسيتون مع 1: 1 الراتنج لالأسيتون لمدة 1 ساعة، ثم استبدل مع 6: 1 الراتنج لالأسيتون لمدة 3 ساعة، وأخيرا 100٪ راتنج بين عشية وضحاها.
- نقل الأنسجة في الراتنج جديدة في 8 micromoulds ملم. علاج على 70 درجة مئوية خلال الليل. وينبغي أن يكون الراتنج الصعب ولكن ليس هش بعد علاج.
3. Ultramicrotomy
- سكين، قطع المعلمات والقسم سمك
- ضع سكينا الماس semithin في مشراح مستدق وقطع المقاطع من الأنسجة في سمك 500 نانومتر.
- تطفو أقسام على حمام مائي وراء حافة السكين. التقاط المقاطع على شريحة زجاجية وتجفيف عليهم لمدة 10 إلى 20 ثانية باستخدام موقد في حوالي 110 درجة مئوية.
- حفر الأقسام مع حل إيثوكسيد الصوديوم لمدة 20 ثانية ثم يغسل مع الإيثانول بنسبة 100٪ الماء ثم المقطر. وصمة عار مع 2٪ الميثيلين الأزرق في 1٪ البوراكس لمدة 20 ثانية على موقد، شطف مع المياه الجارية الصنبور لمدة 5 ثوانى والجافة على موقد لمدة 5 ثوان. ثم STAIن مع بالفوكسين الأساسي 1.5٪ على موقد لمدة 5 ثوان ثم الجاف على موقد لمدة 20 ثانية.
- دراسة من قبل ضوء المجهر مشرق الميدان والتأكد من أن الخلايا السرطانية والمنطقة ذات الاهتمام (ROI) موجودة في القسم.
- تغيير السكين الماس semithin إلى سكين الماس سامسونج وتعيين زاوية سكين والقطع الصحيحة سرعة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة سكين.
- قطع أقسام سامسونج في 90 سمك نانومتر. مراقبة تلوين الذهب من المقاطع عندما تطفو على حمام مائي.
- تمتد وتتسطح الأقسام من خلال التلويح الكلوروفورم بخار من 1 سم 2 قطعة من ورق الترشيح في غضون بضعة ملليمترات من المقاطع. الحرص على عدم إحضار ورقة الكلوروفورم غارقة في اتصال مع سطح الماء.
- سامسونج القسم الشبكة تركيب
- ارفع أقسام سامسونج من سطح الماء باستخدام 300 شبكة رقيقة شريط النيكل تيم الشبكة التي تم غمسها في قسم adhesivحل ه. تحديد المقاطع على الجانب مملة من الشبكة. شبكات لها سطح مملة أو مات على جانب واحد وسطح مصقول أو لامعة على الجانب الآخر. لا يلزم فيلم الدعم. ملاحظة: من الضروري للتعامل مع هذه الشبكات مع ملقط مكافحة المغناطيسي لتجنب شبكات التمسك ملقط.
- إعداد قسم لاصقة من خلال وضع 20 سم من شريط لاصق واضحة في 5 مل قارورة مع 2.0 مل من الأسيتون. كاب ويهز القارورة، اسمحوا الوقوف لمدة 10 دقيقة ثم إزالة الشريط ترك حل لاصقة.
4. Immunolabeling
- مستضد نزع القناع
- إعداد 1 مل من محلول مشبع الحفر metaperiodate الصوديوم النقي في الماء المقطر واستخدامه فورا. مكان قطرات من الحل الحفر على سطح labfilm نظيفة.
- وضع شبكات جافة تماما مع أقسام الخناق على قطرات من الصوديوم محلول metaperiodate في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقل شبكات لدرو الماء المقطرplets لمدة 60 ثانية من الغسيل.
- الأجسام المضادة الحضانة وQD التحقيق وصفها
- تنفيذ كافة حضانات ووضع العلامات على قطرات من محلول وضعت على سطح بارافيلم نظيفة.
- وضع الشبكة على قطرات من 0.05 M الجلايسين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لمنع ألدهيد المتبقية في القسم. إزالة كتلة ألدهيد من النشاف لفترة وجيزة على حافة الشبكة.
- وضع الشبكة على قطرات من 1٪ مصل الماعز العادي (خ ع) و 1٪ BSAC (10٪) في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. إعداد عرقلة الحل من خلال إضافة 10 ميكرولتر من خ ع و 100 ميكرولتر من BSAC إلى 890 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإعطاء الحجم النهائي من 1000 ميكرولتر.
- شرط الأقسام عن طريق وضع على قطرة من مخفف الأجسام المضادة لمدة 10 دقيقة.
- أداء حضانة immunolabeling باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل مكافحة السوماتوستاتين المخفف 01:10 مع الأجسام المضادة مخفف إعطاء تركيز 3.47 جرام / لتر. ملاحظة: يتم حضانة الأجسام المضادة عن طريق وضع شبكات على قطرات لمدة 1 ساعة في غرفة temperatلدى عودتهم في غرفة رطبة.
- إزالة كاشف الأجسام المضادة من الخطوة 4.2.5 من النشاف حافة الشبكة ثم يغسل المقاطع على مخفف لل2 × 5 دقائق.
- احتضان في الضد الثانوية (الماعز البيروكسيديز المضادة للأرنب بولكلونل) المخفف 01:10 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية. يغسل في مخفف ل2 × 5 دقائق.
- احتضان في نقاط الكمية مترافق streptavidin (585 نانومتر) المخفف 01:10 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يغطى بورق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء أثناء الحضانة.
- غسل الشبكات في الماء المقطر النقي لمدة 2 دقيقة. وصمة عار على حواف الشبكة الجافة.
5. الإسفار ضوء المجهر
- مصدر الضوء وتصفية مكعبات
- استخدام 365 نانومتر التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED) الإضاءة لواسعة المجال ضوء مضان المجهر. إدراج مكعب فلتر مع الخصائص التالية: (خر G 365 نانومتر، BS FT 395 و EM LP 420 نانومتر).
ملاحظة: هذا المرشح مكعب ثتسمح سوء أطياف الانبعاثات من جميع نقاط الكمية أحجام أن تصور في وقت واحد تحت نفس الطول الموجي الإثارة.
- استخدام 365 نانومتر التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED) الإضاءة لواسعة المجال ضوء مضان المجهر. إدراج مكعب فلتر مع الخصائص التالية: (خر G 365 نانومتر، BS FT 395 و EM LP 420 نانومتر).
- عرض والتصوير الأقسام
- وضع قسم شبكة immunostained الخناق على شريحة زجاجية في قطرة من الماء، وتغطي مع انزلاق الغطاء الزجاجي (سمك رقم 1.5). استخدام المجهر الضوئي لتقييم نمط وضع العلامات، ومستوى أي وضع العلامات غير محددة ولإثبات أن ضوابط السلبية واضحة لوضع العلامات.
- تحديد العائد على الاستثمار بالنسبة إلى الحانات الشبكة. قد تكون شبكات مكتشف مفيدة في تحديد احداثيات الهياكل الهدف.
- الحصول على صور من العلامات الإيجابية في القسم باستخدام لون كاميرا رقمية كاملة مع وضع الكاميرا في "لون السيارات فلوريدا" و "توازن اللون الأبيض" وضعت في 3،200K. استخدام الكاميرا في وضع "التعرض التلقائي" مع إعداد "غاما" بين 0.45 و 1.00 لتحسين مظهر الصور و"النظير كسب" وضعت في 1X.انقر على أيقونة الكاميرا في البرنامج واجهة زن 2 لايت رسومية ل"لايف"، والتركيز على الصورة ثم انقر فوق "المفاجئة" لالتقاط صورة لframestore.
- حفظ الصور وملفات .tif لتجنب الضغط والبيكسيلاشن أصبح واضحا.
- إعداد الطباعة تبين موقف العائد على الاستثمار فيما يتعلق الحانات الشبكة أو المعالم الأنسجة الأخرى الهامة. وهذه الطبعات تكون مفيدة للملاحة لاحق من هذا الباب ورويس بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (تيم) لتقصي إعادة.
- إزالة الشبكة من الشريحة، ويغسل في الماء المقطر وصمة عار بلطف الحواف الجافة.
ملاحظة: لا تستخدم الإضاءة الشديدة مفرط للحصول على الصور مضان. وصمود للنقاط الكمية يسمح الأوقات التصوير لمدة تصل إلى بضع ثوان ولكن الحرص على عدم تمديد فترة التعرض كما يمكن أن يحدث تبريد للإشارة QD بعد حوالي 1 دقيقة في الماء. يتم الحصول على صمود الموسعة أو دائمة فقط عندما وصفت QD أقسام هي المجففة مع التولوين وجزءا لا يتجزأ من تحت coverslips وفقا لمواصفات الشركات المصنعة. ومع ذلك، فإن هذه العملية ثم يستبعد احتمال وجود فحص مترابط من نفس القسم بواسطة تيم.
6. نقل المجهر
- تيم إعداد وعرض
- نقل الشبكة إلى تيم للفحص باستخدام الجهد تسريع 100 كيلو فولت. استخدام تضخم منخفض حوالي 1،400X للتنقل في أنحاء الشبكة والعثور رويس التي ترتبط مع وجهات نظر المجهر الضوئي. مشاهدة مجموعات من نقاط الكمية في تكبير حول 50،000X.
- مراقبة نقاط الكمية الفردية في 70،000X التكبير أو أعلى. مراقبة نقاط الكمية عن الهياكل البلورية غير النظامية مع كثافة الإلكترونات المعتدلة.
- التصوير
- استخدام كاميرا رقمية للتصوير تيم. وأحادية اللون 1392 س 1040 بكسل الاستشعار كافية.
- الحصول على الصور من خلال النقر على أيقونة "كاميرا" إلى "تشغيل" في ميكرoscope واجهة رسومية للبرامج التصوير، ثم إلى "إيقاف" لتخزين الصورة في framestore. ملاحظة: ستكون هذه العمليات تختلف تبعا لنظام المجهر المستخدمة. استخدام الكاميرا في وضع التعرض التلقائي مع إعداد "غاما" من 1.00.
- حفظ الصور وملفات .tif.
7. كليم التصوير
- تحديد العائد على الاستثمار الإسفار التي كتبها تيم
- استخدام الطباعة من صورة مجهرية ضوئية لتحديد رويس المقابلة التي كتبها تيم. الأنسجة المعالم المعمارية مثل الأوعية الدموية والهياكل اللمعية مفيدة للملاحة حول القسم باستخدام تيم.
- التقاط صورة من العائد على الاستثمار المماثل من تيم.
- كليم تراكب الصور
- تأكد من الموجه الصورة تيم بشكل صحيح مع صورة المجهر الخفيفة وتصحيح توسيع كل ذلك أن هيكل نفسه ينظر في كل طريقة هي نفس الحجم.
- توجيهأكل المجهر الضوئي والصور تيم وعرضها جنبا إلى جنب أو تراكب لتسليط الضوء على ميزات التركيبية من رويس immunolabeled.
- إنشاء تراكب الصور باستخدام برنامج فوتوشوب CS2. أولا، تكبير الصورة مضان لنفس التكبير كصورة منخفضة تيم السلطة. توجيه كل من الصور ومن ثم لصقها جنبا إلى جنب على قماش واحد.
- تسطيح الصورة.
- إنشاء تراكب مضان من هذه الصورة المركبة. انقر على "أداة مستطيلة سرادق"، حدد الصورة مضان، وخلق طبقة مكررة منه.
- ضبط "نمط طبقة / خيارات مزج" إلى 30 - 40٪ الشفافية.
- انقر على "تحريك أداة" واسحب طبقة مضان تراكب عبر صورة تيم المقابلة. محاذاة الصور.
- بعد تحقيق المحاذاة، "تسطيح" طبقات لإنتاج صورة التراكب النهائية.
- استخدام "أداة مستطيلة سرادق" لتحديد صورة التراكب الجديدالثانية نسخه إلى قماش جديد. حفظ هذا كملف TIFF..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عينة ورم سوماتوستاتيني الورم المستخدمة في هذه الدراسة شكلت الخلايا السرطانية تشكيل الهياكل الأقنية مختلطة مع الأنسجة الفغرة الكولاجينية. بواسطة مضان المجهر الضوئي، الخلايا السرطانية الفردية التي تحتوي على حبيبات إفرازية وفيرة وأظهرت العلامات الإيجابية لهرمون السوماتوستاتين. ظهر نوى الثقوب والظلام مع الحد الأدنى من العلامات غير محددة كشفها (الشكل 1). في تكبير منخفضة، وكان ينظر مكثفة بنسب مختلفة مضان حبيبات البرتقال في السيتوبلازم من هذه الخلايا السرطانية تتميز أيضا. تم تحديد اللون البرتقالي من مضان حسب حجم QD المستخدمة. لهذه الدراسة استخدمنا 585 نقاط الكمية نانومتر والتي تنبعث منها إشارة البرتقالي عندما متحمس مع 365 نانومتر الخفيفة.
كان تحليل كليم من نفس الخلية ممكن (الشكل 2). باستخدام نفس الشبكة كما يراها المجهر الضوئي لتيم الفحص سمح رويس لا بد من الاعتراف والتراسل الفوريالذين تتراوح أعمارهم بين في كل من الطرائق. وقد لوحظ في الهندسة المعمارية النسيج نفسه فيما يتعلق الحانات الشبكة كما يراها المجهر الضوئي من قبل تيم وتستخدم للملاحة. تم العثور على العائد على الاستثمار من خلال الإشارة إلى 20X صورة المجهر الضوئي ومشيرا إلى ميزات الأنسجة فيما يتعلق الحانات الشبكة.
أظهر تيم سيتوبلازم خلايا إيجابية السوماتوستاتين لاحتواء حبيبات جولة وفيرة من اختلاف كثافة الإلكترونات. كانت حبيبات من مختلف أقطار موجودة في الخلايا الفردية، وكان QD كثافة immunolabeling على حبيبات متغيرة أيضا. اقترح تغشية البيانات مضان على صور تيم العلامات إيجابي قوي يتفق مع حبيبات تحتوي على باعتدال مادة الكترونية كثيفة داخل غشاء الحويصلة الحد من (الشكل 3).
في أعلى التكبير يمكن أن ينظر إلى حبيبات متوسطة الإلكترون الكثيفة إلى أن immunolabeled بشكل مكثف مع البلورات النانوية QD ( 
الشكل 1: ضوء المجهر عرض من القسم رقيقة جدا مع خلايا ورم سوماتوستاتيني تصنيفها لسوماتوستاتين هرمون وقد شنت قسم سامسونج على شبكة تيم، immunolabeled، ثم توضع على شريحة زجاجية في الماء تحت ساترة. خلايا ورم سوماتوستاتيني (الأسهم) تظهر نواة مستديرة وفيرة هرمون السوماتوستاتين حبيبات إيجابية في السيتوبلازم. وينظر إلى تباين كبير في كثافة العلامات في السكان خلية ورم سوماتوستاتيني (200X). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 2: كليم المركب مشاهدة من القسم سامسونج من خلال السوماتوستاتين تسالك الأنسجة تصنيفها لالسوماتوستاتين أ) الخلايا ورم سوماتوستاتيني بواسطة المجهر widefield مضان (120X)؛ ب) نفس الخلايا المحيطة التجويف (L) التي اطلعت عليها تيم في التكبير المنخفض (570X)؛ C) أعلى سلطة جهة نظر تيم تظهر خلية فلوري الزاهية من ( أ) مع النواة (N) (2،000X)؛ D) التفاصيل حبيبات هيولية تظهر العلامات مكثفة مع نقاط الكمية على مواد غير متبلور الواردة في الحبيبية (النجمة) (20،000X) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم . 
الرقم 3: كليم تراكب صورة صورة شفافة من المجهري مضان المخلوطة مع صورة تيم من المنطقة المقابلة (2،000X)./ftp_upload/54307/54307fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 4: نقل الإلكترون المجهري (تيم) عرض من السوماتوستاتين إيجابي حبيبات من ورم سوماتوستاتيني خلية السيتوبلازم سوماتوستاتين هرمون حبيبات إيجابية في السيتوبلازم (الأسهم) تظهر QD توطين على محتويات غير متبلور إلى حد كبير داخل الغشاء المحدد. الخلفية المحيطة هيولي غير نظيفة مع قليل من تحقيقات QD اضحة. وينظر بعض العلامات النووي غير محددة. غشاء الحويصلة المحيطة حبيبات (السهام) لا تزال واضحة (50،000X). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أثبتت هذه الدراسة الفائدة المحتملة من نقاط الكمية كما تحقيقات العالمية للدراسات كليم. وأظهرت النانوية نانومتر QD 585 تستخدم مضان مشرق ومستقر عند عرضها بواسطة المجهر الضوئي widefield ولوحظت بسهولة من قبل تيم. وقد أظهرت دراسة سابقة أجراها أحد مؤلفي الحالية نقاط الكمية أيضا أن تكون مناسبة لفائقة الدقة المجهر الضوئي (7). كان صمود بهم مفيدة بشكل خاص لفترات المشاهدة الموسعة والتعرض التصوير الطويلة. ويمكن أيضا أن تستخدم نقاط الكمية لالمناعية متعددة مع تحقيقات مختلفة الحجم تنبعث منها في وقت واحد أطياف ملونة مختلفة تحت نفس الطول الموجي الإثارة.
نقاط الكمية تمتلك ما يكفي من الوزن الذري أن تصور من قبل تيم ولكن هذا وجد أنه يمكن تحدي اعتمادا على حجم جسيمات متناهية الصغر المستخدمة. لالمجهر الضوئي، وجدنا أن 525 نقاط الكمية نانومتر (الأخضر) تنتج أقل العلامات خلفية بالمقارنة مع أكبر 585 نانومتر (برتقالي) و 655 نانومتر (الأحمر) أشكال. ومع ذلك، اخترنا لاستخدام أكبر 585 نانومتر QD في هذه الدراسة لتمكين التصور أكثر ملاءمة لوضع العلامات من قبل تيم. أصغر 525 نقاط الكمية نانومتر هي الحجم حوالي 3-5 نانومتر في حين أن أكبر 585 نانومتر الأشكال ما يقرب من 6-8 نانومتر و 655 نانومتر نقاط الكمية حوالي 8-10 نانومتر. تمتلك نقاط الكمية نانومتر 585 شكل بلوري عدم انتظام مع كثافة الإلكترونات المعتدلة عندما ينظر إليها من قبل تيم. ولم تكن بشكل دائري أو كما الإلكترون الكثيفة كما تحقيقات الذهب immunocytochemical التقليدية الغروية. ومع ذلك، فقد ثبت نقاط الكمية لانتاج ما يصل إلى 10X وضع العلامات أكثر كفاءة من الذهب الغروية 9 وأكدنا هنا أن ارتفاع كثافة العلامات يمكن تحقيقه بسهولة، ولا سيما مع نظام التحقيق ربط البيوتين streptavidin. تمتلك سيلينيد الكادميوم نقاط الكمية أيضا توقيع عنصري مميزة قد تسمح كشف ورسم الخرائط باستخدام التحليل الطيفي للطاقة والتشتت (EDS)، والإلكترون فقدان الطاقة الطيفي (ثعابين) أو طاقة المصفاة انتقال المجهر الإلكتروني (EFTEM) 8. انتقال المجهر الإلكتروني (STEM) أنظمة ويمكن أيضا أن تستخدم بسبب استغلالها من Z-التباين أو العدد الذري التصوير التي من شأنها أن تعزز التباين بين الجسيمات النانوية والمواد البيولوجية لانخفاض العدد الذري 14. وينبغي أيضا أن يكون رسم الخرائط مساحة واسعة والتصور المعلومات التوزيع 3D 15 مع انبعاث المجال المجهر الإلكتروني ممكن.
خطوة حاسمة في أسلوبنا هو الإجراء مستضد إماطة اللثام أو قسم الحفر. نحن نستخدم علاج واحد مع metaperiodate الصوديوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أطول من هذا، وتجميع هياكل أو فقدان تعريف غشاء يمكن أن يحدث. والبعض الآخر يستخدم طريقة من خطوتين التي تنطوي على deplasticizing مع ميثوكسيد الصوديوم تليها دي-المعاملة بالأوزميك مع بريودات الصوديوم وهذا يمكن أن توفر المزيد من السيطرة على عملية إذا لزم الأمر 16.
كان كليم الممكن باستخدام المجهر الضوئي لمتأنذ تسجيل السمات الهيكلية رويس فيما يتعلق الحانات الشبكة. ثم يتم وضع نفس الشبكة في تيم والموجه بحيث القضبان شبكة والمعالم تتوافق مع وجهة النظر المجهر الضوئي. وتضخم منخفض حوالي 1،400X هو الأكثر ملاءمة لهذا الغرض. أثبتت هياكل الأنسجة مثل تشكيلات الأقنية وأنماط من نوى أن يكون أكثر فائدة لإيجاد إعادة رويس في الأنسجة. ومع ذلك، ارتباط دقيق لقرار خلية نفسه يمكن أن يكون تحديا. كان الحرص على أن تؤخذ مع توجه الشبكة لتعكس نفس التوجه اطلعت عليها المجهر الضوئي. لقد حققنا دقيقة معقول الارتباط المكاني التحت خلوية بين الطرائق مع تراكب الصور المنتجة باستخدام برنامج فوتوشوب. وقد مزجت صورة مضان تراكب مع الصورة تيم الخلفية ولكن بعض الاختلال كان اكتشافها. قد يكون هذا بسبب أنظمة التصوير المختلفة المستخدمة من قبل كل طريقة أو أضرار الإشعاع لدينا أقسام سامسونج غير معتمد في تيم. نظم آلية للشارعسوف أورينج إحداثيات رويس اطلعت عليها المجهر الضوئي ونقل هذه إلى ويجري حاليا تسويقها المجهر الالكتروني وتبسيط كبير هذا الإجراء.
فائدة النهج كليم قدمناه للدراسات immunocytochemical هي بالضرورة محدودة بسبب طريقة تحضير العينة المستخدمة، أي تلطيخ المعادن الثقيلة وراتنجات الايبوكسي التضمين اخفاء حتما الحواتم المتاحة. ومع ذلك، فإن تقنية هل يسمح فائدة كبيرة للحصول على بيانات مضان وتيم من عينات علم الأمراض. الحصول على المعلومات الهيكلية والوظيفية من طرائق المجهر مختلفة باستخدام عينة واحدة هو الشيء الذي لم يكن عموما متاحة للدراسات الخلايا علم الأمراض والأنسجة البشرية التي تم معالجتها في المقام الأول لأغراض التشخيص.
ومن المتوقع أن توطين immunocytochemical أكثر حساسية يمكن الحصول عليها من نهج تجميد تثبيت بدلا من بروتوكول بASED على تثبيت الكيميائية. اعتماد مبادئ cryofixation 17 لالبنوك الحيوية من الأنسجة البشرية تليها cryoultramicrotomy ودرجة حرارة الغرفة immunolabeling القائم على QD كما في تقنية Tokuyasu الكلاسيكية 18 و 19 من شأنه أن يسهل دراسات immunocytochemical المترابطة حساسة ومحددة المرضية الأمراض التي تصيب البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M.
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M.
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T.
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
