Summary
Konventionella metoder för att initiera suspension aggregat baserade hjärt differentiering av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) plågas med odlings heterogenitet med avseende på aggregatstorlek och form. Här beskriver vi en robust metod för hjärtdifferentiering som utnyttjar mikro att generera storlek styrda hPSC aggregat odlas under hjärtfrämjande förhållanden.
Introduction
I cell vitro-odling kan utföras under ett antal villkor, men genomföres typiskt antingen i tvådimensionella vidhäftande förhållanden eller i tredimensionella upphängnings villkor som mer fullständigt rekapitulera in vivo system. Följaktligen finns det en växande trend i många forskningsområden att utveckla robusta metoder för att generera tredimensionella vävnadskonstruktioner. I scenarier där typer och processer cell kräver en stödjande extracellulärt matrix (ECM) yta och vidhäftnings signaler kan tredimensionella kultur aktiveras via bygga ställning konstruktioner, där celler odlas på eller i en exogen bärarmatris en. Celler och processer som inte kräver vidhäftning till en stödjande matris kan utföras i suspension som unscaffolded system består huvudsakligen eller uteslutande av celler (som sedan kan fortsätta att skapa sina egna endogena matriser) 2,3. Här presenterar vi ett protokoll för hjärtdifferentiering of humana pluripotenta stamceller (hPSCs - stamceller kan bli någon celltyp i kroppen, vare sig från embryon eller andra källor) i storlekskontrollerade, enhetlig, unscaffolded aggregat.
Differentieringen av hPSCs som upphängningsaggregat plågas av stora variationer i den aggregerade storlek både inom en körning och mellan körningar. Denna variation är en konsekvens av den metod som typiskt används för att generera dessa aggregat, som innebär mekanisk dissociation av cellkolonier. För att minska denna variation, har ett antal tillvägagångssätt använts för att kontrollera antalet celler per aggregat samt aggregatdiametern och enhetlighet. Som exempel kan nämnas bildning av aggregat i mikrocentrifugrör 4 eller som hängande droppar fem definierade micropatterning tvådimensionella hPSC kolonier 6 som sedan kan överföras till avstängning eller centrifugering av celler i U- eller V-botten flerbrunnsplattor 7,8, 9. Men alla dessa ca.oaches begränsas av deras låga genomströmningen av den samlade generation. Väl-baserade system använder en liknande strategi för V-bottenplatta system, men den mindre storleken av de mikro (i detta protokoll var och en har en bredd av 400 pm) möjliggör generering av ett större antal likformiga aggregat från en enda kultur-plattbrunn (standarddiameter av ~ 15,5 mm innehållande ~ 1.200 mikrobrunnar) än vad som skulle genereras från en hel V-bottenplatta 10. Väl baserade aggregatbildning har använts i ett antal inställningar inklusive differentiering av hPSCs att ektodermal 11, endodermalt 12, mesodermala 13 och extraembryonic 14 öden; kondrogenes från mesenkymala stamceller 15; generering av enhetliga substrat för toxikologisk screening 16; och undersökningar av mechanobiology 17.
En stor utmaning i att utveckla robusta tillverkningsprotokoll för framställning av hPSC härrörande cardiomyocytes har varit bristen på reproducerbarhet i hjärt differentiering effektivitet mellan körningarna. Vi visade tidigare att denna variation kan hänföras till heterogenitet i start hPSC befolkningen, som omfattar både självförnyande hPSCs och differentierande celler som uttrycker gener associerade med endoderm och neural differentiering 6,18. Signaler utsöndrade av dessa differentierande cellerna påverka hjärt induktion. Specifikt främjar extraembryonic endoderm hjärt induktion, medan neurala stamceller hämmar hjärt induktion. Upon hPSC aggregering, celler inom aggregatet differentiate och organisera så att odifferentierade hPSCs är omgivna av ett skikt av extraembryonic endoderm celler som utvecklas på den sammanlagda ytan 13. Genom att kontrollera aggregatstorlek, kan vi modulera förhållandet av hjärt-inducerande endoderm celler till odifferentierade hPSCs (ytarea till volymkvot) och optimera detta förhållande för maximal hjärt induktion 13.
Protocol
1. Beredning av medium Components
- Förbered tvätt Medium. Per 100 ml av DMEM / F12, tillsätt 1 ml 100x penicillin / streptomycin (Pen / Strep), 1 ml 100x L-glutamin, och 5 ml av ersättnings serum.
- Förbereda det kemiskt definierade Basal Cardiac induktionsmedium enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered följande stamreagens för media som kommer att användas i detta protokoll.
- L-askorbinsyra: Bered en förrådslösning av 5 mg per ml i 4 ° C, sterilt ultrarent destillerat vatten i en konisk tub.
- Låt denna lösning på is och skaka röret med jämna mellanrum tills det lösta är helt upplöst. Filtrera-sterilisera askorbinsyralösning med användning av ett 0,22 fim sprutfilter.
- Förbereda 1 ml alikvoter av askorbinsyralösning och lagra dessa alikvoter vid -20 ° C. Använd en nyligen tinat prov varje gång Mediet bereds.
- På dagen för medel preparat, Späd 13 pl monotioglycerol (MTG) i 1 ml Basal Cardiac induktionsmedium. Kassera oanvänd, utspädd MTG.
- Förbereda 1 ml alikvoter av Transferrin (30 mg / ml) för att lagra vid -20 ° C. Store tinade alikvoter vid 4 ° C i upp till 3 månader.
- Förbereda 4 mM saltsyra (HCl) innehållande 0,1% bovint serumalbumin (BSA). I ett dragskåp, tillsätt 30 pl 6,0 N HCl-lösning till 50 ml ultrarent destillerat vatten. Filtrera-sterilisera lösningen med användning av en 0,22 fim sprutfilter. Tillsätt 2 ml av 25% BSA-lösning till 50 ml HCl-lösning.
- Förbereda Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 0,1% BSA. Tillsätt 20 pl 25% BSA lösning per ml PBS.
- Förbereda Human benmorfogenetiskt protein 4 (BMP-4) stamlösning (10 ng / | il). Lös upp 10 jig lyofiliserade BMP-4 i 1 ml 4 mM HCl-buffertlösning innehållande 0,1% BSA. Förbered 50 | il alikvoter för att lagra vid -20 ° C.
- Förbered Human Fibroblast Growth Factor 2 (bFGF) stamlösning(10 ng / | il). Lös upp 10 | ig lyofiliserad bFGF i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 0,1% BSA. Förbered 50 | il alikvoter för att lagra vid -20 ° C.
- Förbereda Human Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) stamlösning (5 ng / | j, l). Lös upp 5 ug lyofiliserat VEGF i 1 ml PBS innehållande 0,1% BSA. Förbered 50 | il alikvoter för att lagra vid -20 ° C.
- Förbereda Aktivin En stamlösning (10 ng / | il). Lös 10 mikrogram lyofiliserade Activin A i 1 ml PBS innehållande 0,1% bovinserumalbumin (BSA). Förbered 50 | il alikvoter för att lagra vid -20 ° C.
- Förbereda Inhibitor av Wnt Production-2 (IWP-2) förrådslösning (10 mM). Lös upp 2 mg IWP-2 i 429 | il dimetylsulfoxid (DMSO). Förbered 10 pl alikvoter för att lagra vid -80 ° C.
- L-askorbinsyra: Bered en förrådslösning av 5 mg per ml i 4 ° C, sterilt ultrarent destillerat vatten i en konisk tub.
- Förbered Komplett Cardiac induktionsmedium. Till 100 ml Basal Cardiac induktionsmedium, tillsätt 1 ml 100x Pen / Strep, en ml 100x L-glutamin, 500 pl Transferrin, enml färskt tinade askorbinsyra och 300 pl MTG. Kasta oanvänt medium.
2. Framställning av mikrobrunnsplattan
OBS: Alla steg bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Tillsätt 0,5 ml Rens Solution (kit komponent) till varje brunn som ska användas på plattan. För att säkerställa att lösningen kommer i kontakt hela ytan inuti varje mikrobrunn, centrifugera plattan vid 840 xg under 2 min.
- Inkubera plattan i 30 till 60 min vid RT.
- Aspirera Sköljning Lösning från brunnarna. Tvätta varje brunn två gånger på följande sätt: Tillsätt 1 ml PBS till varje brunn, centrifugera plattan vid 840 x g under 2 min, och sedan aspirera PBS.
3. Bildning av hPSC aggregat i Micro Plate
OBS: Alla steg bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Placera tvättmedium i en 37 ° C vattenbad.
OBS: Den volym som behövs = 1 ml x antal brunnar för HPSC som skiljas. - Dissociera hPSCs till enstaka celler
OBS: Dessa steg beskriver dissociation av celler odlade på plattor med 6 brunnar - reagensvolymer kan skalas proportionellt för olika kultur format.- Aspirera odlingsmediet från varje hPSC odlingsbrunn för dissociation. Skölj varje brunn med 1 ml dissociation enzym, och sedan omedelbart aspirera dissociation enzymet från varje brunn.
OBS: Rest dissociation enzymet bör vara tillräcklig för att dissociera cellerna. - Inkubera plattan vid 37 ° C under 3 min.
- Tillsätt 1 ml tvättmedium till varje brunn och mekaniskt dissociera cellerna från vävnadsodlingsytan genom att pipettera tvättmediet med en P1000 mikropipett över vävnadsodlingsytan. Om dissociation synes vara ofullständiga och cellklumpar kvar, passera suspensionen genom en sil vid denna punkt.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör och lagraröret i inkubatorn medan cellantalet utförs i nästa steg.
- Gör en cellräkning:
- Ta ett prov av cellsuspensionen saml i föregående steg 10 | il. Tillsätt 30 | il av Trypan Blue och blanda suspensionen väl genom pipettering.
- Överför 10 pl Trypan Blue-färgade celler till varje kammare av en hemocytometer och visualisera under inverterat mikroskop med 10X objektivet. Räkna cellerna.
- Av resultaten kroppar, beräkna hur många brunnar kan ympas på 1,2 x 10 6 celler per brunn i mikroplattan. Beräkna Aggregation Medium krävs för att ympa cellerna vid 1 ml per brunn.
- Förbereda aggregering medium. Per 10 ml Complete Cardiac induktionsmedium, tillsätt 0,5 | il av BMP4 stamlösning (slutlig koncentration = 0,5 ng / ml) och Y-27632 ROCK Inhibitor (slutkoncentration = 10 | iM).
- Ta bort den koniska rör som innehåller de hPSCs från inkubatorn och centrifugeGE röret vid 200 xg under 5 min. Suga ut tvättmediet och återsuspendera cellerna i aggregering medium vid en densitet av 1,2 x 10 6 celler per ml.
- Aspirera PBS tvättlösningen från varje brunn i mikrobrunnplattan. Med hjälp av en P1000 mikropipett, jämnt fördela och utsäde 1 ml av cellsuspensionen till varje brunn på mikroplattan. Att ympa ett stort antal brunnar regelbundet virvel cellsuspensionen för att förhindra sedimentering.
- Centrifugera plattan vid 200 xg under 5 min. Observera plattan under mikroskop för att bekräfta celler har spunnits till botten av varje brunn.
- Inkubera plattan i 24 h vid 37 ° C i en 5% CO2, 5% O2 (hypoxisk) inkubator.
- Aspirera odlingsmediet från varje hPSC odlingsbrunn för dissociation. Skölj varje brunn med 1 ml dissociation enzym, och sedan omedelbart aspirera dissociation enzymet från varje brunn.
4. Cardiac Induktion Stage 1
- En dag efter aggregering (dag 1), förbereda den erforderliga volymen av etapp ett induktionsmedium (för en 24-brunnsplatta, volym = 1 ml x antal brunnar). För 1 ml kompletthjärtinduktionsmedium, tillsätts 1 | il av BMP4 stamlösning (slutlig koncentration = 10 ng / ml), 0,5 | il av bFGF stamlösning (slutlig koncentration = 5 ng / ml), och 0,6 | il av Aktivin A (slutkoncentration = 6 ng / ml). Placera mediet i ett 37 ° C vattenbad under minst 15 min.
- Avlägsna mikroplattan från inkubatorn. Inspektera aggregaten under mikroskop. Jämfört med omedelbart efter centrifug aggregering, bör de verkar intakt med jämna kanter (mer runda och mindre kvadrat än föregående dag).
- Avlägsna supernatanten utan att störa aggregat inuti mikro:
- Håll mikroplattan vågrätt (dvs., Inte luta den). För varje brunn på mikrobrunnsplatta, placera spetsen på en P1000 mikropipett vid ytan av odlingsmediet och mot kanten av brunnen.
- Sakta ut mediet, försiktigt så att inte störa aggregaten i botten av mikrobrunnarna. Efter att minska than medelhög nivå till ca 1 till 2 mm från den texturerade mikrobrunnytan, långsamt luta plattan för att samla in medium vid en sida av brunnen (en gång volymen är tillräckligt låg, är flytande rörelse kraftigt reducerad och det är lättare att undvika aggregat blir lyfts av deras individuella mikro). Långsamt pipettera ut det återstående mediet i brunnen.
- För att lägga till ny etapp ett induktionsmedium samtidigt som aggregaten kvar i sina individuella mikrobrunnar: Rita en ml av etapp ett induktionsmedium med en P1000 mikropipett. Håll pipettspetsen mot den inre kanten av brunnen och mycket långsamt fördela mediet mot innerväggen av brunnen. Upprepa för de återstående brunnarna.
- Returnera plattan till inkubatorn under hypoxiska betingelser i 3 dagar.
5. Hjärt Induktion Steg 2
- På dag 4, plats tvättmedium (volym = antal brunnar x 2 ml) i ett 37 ° C vattenbad under minst 15 min.
- Förbereda den nödvändiga volymen av Stage 2 Induktion Medium (volym = antal brunnar x 1 ml): Per ml Complete Cardiac induktionsmedium, tillsätt 2 pl av VEGF stamlösning (slutlig koncentration = 10 ng / ml) och 0,5 ^ il IWP-2 stamlösning (slutlig koncentration = 5 | aM). Placeras det preparerade Stage 2 Induktion medium i ett 37 ° C vattenbad under minst 15 min.
- Med användning av en 5 ml serologisk pipett, skörda aggregaten från varje brunn i mikrobrunnplattan och samla den sammanlagda suspension i ett 15 ml koniskt rör (samla upp till 10 brunnar per 15 ml rör).
- Låt aggregaten att nöja sig med 15 minuter i en hypoxisk inkubator.
OBS: Detta steg är viktigt att skilja enskilda celler och cellrester från intakta aggregat. - Aspirera supernatanten försiktigt och resuspendera aggregaten i 10 ml av den förvärmda tvättmediet för att avlägsna återstående induktiva cytokiner (t.ex. är Activin A en potent signalmolekyl även vid mycket låg concentrations).
- Centrifugera aggregaten vid 50 xg under 2 minuter. Aspirera supernatanten. Resuspendera pelleterade aggregaten i förvärmda Induktions 2 Medium.
- Överföra aggregerade suspensionen till en 24-brunnars ultralåg fäste (ULA) platta vid 1 ml per brunn. Observera aggregaten under mikroskop så enhetlig, täta cellkluster. Inkubera under hypoxiska betingelser till dag sex.
6. Cardiac Induktion Steg 3
- På dag 6, förbereda den nödvändiga volymen av etapp tre induktionsmedium (volym = antal brunnar x 1 ml). För en ml Complete Cardiac induktionsmedium, tillsätt 2 pl VEGF stamlösning (slutlig koncentration = 10 ng / ml), och 0,5 | il av bFGF stamlösning (slutlig koncentration = 5 ng / ml). Placera ställas Steg 3 induktionsmedium i en 37 ° C vattenbad under minst 15 min.
- Använd en 5 ml serologisk pipett för att överföra aggregaten till 15 ml koniska rör, samla upp till 10 ml aggregats per rör.
- Låt 10 minuter för aggregaten att lösa. Aspirera supernatanten och suspendera aggregaten i förvärmda Steg 3 induktionsmedium. Med hjälp av en 5 ml serologisk pipett, omfördela aggregaten i en 24 brunnar ULA platta vid 1 ml per brunn.
- På dag 10, förbereder den nödvändiga volymen av etapp tre induktionsmedium (volym = antal brunnar x 1 ml) som per steg 6,1.
- Använd en 5 ml serologisk pipett för att överföra aggregaten till 15 ml koniska rör, samla upp till 10 ml aggregat per rör.
- Låt 10 minuter för aggregaten att lösa. Aspirera supernatanten och suspendera aggregaten i etapp tre induktionsmedium. Med hjälp av en 5 ml serologisk pipett, omfördela aggregaten i en 24 brunnar ULA platta vid 1 ml per brunn.
- Inkubera under hypoxiska betingelser i två dagar. På dag 12, börjar att inkubera cellerna vid normoxiska syrenivåer under återstoden av odlingsperioden (37 ° C, 20% O2, 5% CO2).
NOTERA:Efter denna tidpunkt, celler inte längre odlas under hypoxiska betingelser. - Upprepa denna fullständiga mediumutbyte (steg 6,2 och 6,3) var 4 dagar, med början dag 14 tills cell skörd (typiskt är topp cardiomyocyte koncentrationer observerades efter dag 14 av differentiering).
7. Flödescytometrisk analys av Cardiac Troponin T (cTnT) Expression Frekvens Microkultur utgång
- Dissociera aggregat på följande sätt:
- Använd en 5 ml serologisk pipett för att överföra en brunn av aggregat till en 15 ml koniska rör. Centrifugera aggregaten vid 50 xg under 2 minuter och försiktigt aspirera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml av nyligen upplöst 1 mg / ml kollagenas typ II-lösning till aggregaten. Överföra aggregerade suspensionen till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inkubera aggregaten i kollagenas typ II över natten vid rumstemperatur.
- Följande dag, använda en P1000 mikropipett att försiktigt dissociera aggregattill en homogen suspension av enskilda celler. Om aggregaten inte lätt inte dissociera, lösa aggregaten, aspirera supernatanten och inkubera aggregaten i 700 pl Dissociation enzym under 1 till 2 minuter vid RT. pipett försiktigt aggregaten en till två gånger med en P1000 mikropipett att dissociera.
- Späd dissociation enzym: Lägg 700 ul av tvättmedium innehållande 14 | il av 1 mg / ml DNAse stamlösning. Ta ett prov 10 ^ il för att utföra en cellräkning, och centrifugera den återstående suspensionen med användning av en bänk-topp mikrocentrifug vid 300 x g under 2 min.
- Utför en celltal: Färga 10 pl räkning provet med en lika stor volym av trypanblått och räkna med en hemocytometer.
- Avlägsna 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande de återstående cellerna från mikrocentrifug. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna, vid en koncentration av 200.000 till 500.000 celler per 100 | il, i Hanks balanserade saltlösning innehållande2% fetalt bovint serum (HF).
- För varje tillstånd, överför 100 pl cellsuspension per brunn till 2 brunnar i en platta med 96 brunnar (en brunn kommer att färgas med cTnT antikroppen och den andra kommer att vara den andra kontroll-antikropp).
- Centrifugera plattan vid 300 xg under 2 min. Avlägsna supernatanten med en flerkanalig mikropipett.
- Fixera cellerna: Tillsätt 200 ul av fixeringslösning (satskomponent) per brunn och inkubera plattan under 15 min vid RT.
- Centrifugera plattan vid 300 xg under 2 min. Använd en flerkanalig mikropipett att noggrant dra supernatanten från brunnarna. Kasta supernatanten i en paraformaldehydavfallsbehållare.
- Tvätta de fixerade cellerna två gånger: Tillsätt 200 | il av HF till varje brunn. Centrifugera plattan vid 300 xg under 2 min. Aspirera supernatanten och upprepa tvättsteget än en gång. Fixerade celler kan lagras under upp till en vecka i HF vid 4 ° C.
- Permeabilisera cellerna:
- Centrifugera plattan vid 300xg under 2 min.
- Tillsätt 100 pl av Permeabilization Solution (kit komponent) till varje brunn och inkubera plattan vid rumstemperatur under 5 min.
- Centrifugera plattan vid 300 xg under 2 min och aspirera supernatanten.
- Förbereda en huvudblandning av anti-cTnT i HF vid den optimala koncentrationen för det givna partinumret (Den optimala utspädningen måste bestämmas genom titrering och sträcker sig typiskt från 1: 500 till 1: 2000).
- För varje tillstånd (2 brunnar per betingelse), tillsätt 100 | il av huvudblandning till en brunn (färgade provet) och 100 | il av vanlig HF till den andra brunnen (sekundär kontrollantikropp). Inkubera cellerna vid 4 ° C under 30 min.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 2 min. Aspirera supernatanten och tillsätt 200 pl HF per brunn. Upprepa detta tvättsteg en gång.
- Förbereda en huvudblandning av den sekundära antikroppen. För över en volym av HF som motsvarar 100 l för varje brunn (andra kontroll antikropp ochcTnT-färgad) som behandlas. Tillsätt 1 pl av get-anti-mus-APC sekundär antikropp per 200 pl av HF (1: 200 utspädning).
- Fläcka proverna. Tillsätt 100 pl av färglösningen till varje brunn (både den andra kontroll-antikropp och anti-cTnT-färgade brunnar). Inkubera cellerna i mörker vid 4 ° C under 30 minuter (håll plåt täckt eller i mörkret efter att ha lagt fluorescerande sekundär antikropp för att undvika fotoblekning).
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 2 min. Aspirera supernatanten och tillsätt 200 pl HF per brunn. Upprepa detta tvättsteg en gång.
- Överför proverna till 5 ml rundbottnad flödescytometer analysrören och utföra flödescytometri för signal i APC-kanalen med hjälp av standardprotokoll för instrumentet 19.
Representative Results
Storleksstyrda aggregat av hPSCs kan effektivt bildas med användning av mikrobrunnssystemet, beroende enbart på koncentrationen av celler och mikro ytarea. Efter en kort centrifugering, är de lämpliga antal celler (1000 i detta protokoll) förs samman i varje mikrobrunn (Figur 1A). Viktigt är dessa celler återupprätta intracellulära förbindelser inom 24 timmar, och bör inte längre fylla brunnen, men visas som kompakta aggregat med jämna kanter (Figur 1B). Dessa aggregat tillhandahålla utgångsmaterial för ytterligare differentiering i riktning mot en hjärt öde. Om cellerna inte bilda täta klungor, tyder detta möjligt celldöd efter dissociation och återaggregering och lämpligheten av encelliga passage och ROCK inhibitorkoncentrationer för en särskild cellinje bör undersökas. Följande tre dagar i mikrobrunnar visar små förändringar i aggregerad Morphology, även om en viss tillväxt är uppenbar. När bort från mikrobrunnarna, bör aggregat behålla sin runda, tätt packade morfologi och vara av samma storlek till varandra (Figur 1C). Kultur i ULA 24-brunnsplattor kommer att tillåta ytterligare expansion och tillväxt cell.
Vid dag 8, efter exponering först till Aktivin signalering, och Wnt inhibition kommer aggregaten börjar att framstå som större och ljusare aggregat (Figur 1D). Under denna period kommer en betydande cellrester vara uppenbar vid botten av varje brunn och måste avlägsnas genom att aggregat att lösa innan du tar bort media. Ibland kommer många aggregat smälter samman. Detta kommer inte att hämma differentieringen av andra aggregat i brunnen, även om dessa "super aggregat" tenderar att inte uppvisa morfologiska förändringar som ses med mindre aggregat och är mindre benägna att genomgå fullständig differentiering.
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Fortsatt differentiering resulterar i betydande morfologiska förändringar av aggregat med en ökad storlek och utseende av organiserade fibrösa regioner. På dagen 12, kan observeras upphandlande aggregat. Dessa kommer alltid består av stora, öppna celler och innehåller ofta omfattande extracellulärmatrix utanför aggregatet (Figur 2). Medan aggregatomfattande sammandragningar indikerar en framgångsrik differentiering, kan hjärt markör uttryck även observeras i aggregat som inte verkar dra ihop sig. Efter dissociation av aggregat och immunomärkning kommer en majoritet av celler vara positivt för cardiomyocyte markör cTnT med flödescytometri (Figur 3). Uttrycket av denna markör är stabilt i cellerna och kan observeras i aggregat så sent som dag 19 av differentiering.
1.jpg "/>
Figur 1: Timeline av hPSC differentierade mot en hjärt öde Omedelbart efter aggregering, celler fylla nästan varje mikro (A).. En dag senare, verkar aggregaten kondens och smidig (B). Denna morfologi kvarstår även när aggregaten avlägsnas från mikrobrunnarna och ströks in i brunnsplattor (C). Vid dag 8, aggregat börjar expandera och ljusare i färgen (D). Skala bar:. 250 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Aggregat Börja Contracting vid dag 12 av Differentiering Efter sex dagar i Cardiac Induktion Steg 3 Medium har kraftfulla aggregatomfattande sammandragningar observerats (övre panelen. Slappnaation, mellersta panel: kontraktion). Den undre panelen är härledd från subtrahera de övre och mellersta paneler, med mest signifikanta skillnader som uppträder som svarta eller vita (pilhuvuden). Skala bar:. 250 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Immunomärkning för Cardiac Troponin T i differentierade hPSCs Vid dag 17, de flesta av cellerna är positiva för cardiac troponin T med flödescytometri (fyllda histogram). Visas även celler färgade med sekundär antikropp enbart (ofyllda histogram). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det har observerats att en effektiv hjärt differentiering av pluripotenta stamceller är en mycket varierande process. Även om det är inte förvånande att olika cellinjer uppvisar olika benägenheter för differentiering förmåga att specifika celltyper, har det visat sig att hjärt differentiering effektivitet varierar dramatiskt mellan kopia körs använder samma cellinje 6. Protokollet som beskrivs här tar upp en stor källa till denna variabilitet genom att direkt styra den ingående cellantalet per aggregat. För att ytterligare minska variationen mellan körningarna, rekommenderas att hPSC linjer anpassade för enskild cell passage används, eftersom denna form av hPSC utbyggnad och underhåll resulterar i mer konsekventa pluripotenta populationer med avseende på expressionsfrekvenser av pluripotens markörer (t.ex. Oct4, NANOG, Tra-1-60, etc.).
Protokollet som skrivits här anger en sammanlagd storlek av 1000 celler för optimal hjärt induktion från HES-2 embryonal stamcellslinje. Att tillämpa detta protokoll för olika cellinjer, är det viktigt att en initial sammanlagd storlek skärmen för att bestämma cellinje specifika optimala aggregatstorlek. Även om det inte direkt påverkar de förfaranden som skall följas här, vi påminna läsaren om att förändringar i aggregatstorlek och totala celltätheten förväntas påverka syretillförsel. Detta kan bli en relevant fråga i tillämpningar nedströms. Dessutom är apoptotisk celldöd ett bekymmer under dissociation av hPSCs till enskilda celler. Därför är det viktigt att se till att ROCK-inhibitor är närvarande under tvångs cellaggregation i mikrobrunnarna. Slutligen är det kritiskt att på dag 4 av differentiering aggregaten är väl tvättas för att avlägsna spår Aktivin A, närvarande i den Induktion 1 Medium, före återsuspension i Induktion 2 Medium. Efter dag 4 av differentiering, främjar Aktivin A endoderm differentiering på bekostnad av mesoderm induktion 20.
Den viktigaste tillämpningen av denna teknik är att fyllnadsmassor storlekar som främjar en effektiv hjärtdifferentiering. Men är en av begränsningarna i den aktuella tekniken att det är svårt att skala hjärt produktionen till kliniskt relevanta nivåer med mikroplattor. Skala upp av hjärt differentiering utförs typiskt i bulk odlingsbetingelser i omrörd suspension bioreaktorer 21. Därför, när mikrosystemet har använts för att bestämma acceptabla intervall av aggregatstorlek för effektiv hjärt induktion, är nästa steg att skala upp för att bestämma bioreaktor propellerhastigheter som kan generera den önskade cellaggregatstorlek.
En av de stora skillnaderna i denna teknik med avseende på andra metoder för aggregat baserade hjärt differentiering är att det möjliggör direkta undersökningar modulera effekterna av endogena signalering i aggregat samtco-kultur av induktiva / hämmande vävnadstyper med hPSCs i aggregatet 13. Dessa typer av undersökningar kan informera processutveckling av storskalig hjärt produktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet | |||
| Pipette aid | |||
| Serological pipettes (5 to 25 ml) | |||
| Aspirator | |||
| Aspirator or Pasteur pipettes | |||
| 15 and 50 ml conical tubes | |||
| Fume hood | |||
| 0.22 µm syringe filter | |||
| 5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
| 5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
| Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
| P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
| Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
| Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Bench-top microcentrifuge | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Vortex | |||
| Ice | |||
| -20 °C freezer | |||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
| StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
| Transferrin | Roche | 10652202001 | |
| BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
| bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
| VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
| Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
| IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| 100x L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
| Hemocytometer | |||
| Trypan Blue | |||
| Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
| Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
| 96 well plate (for FACS staining) | |||
| Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
| cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
| goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
| 5 ml round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |
References
- Wintermantel, E., et al. Tissue engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials. 17, 83-91 (1996).
- Lazar, A., et al. Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).
- Sachlos, E., Auguste, D. T. Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation. Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).
- Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).
- Steinberg, M. S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).
- Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation. Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PloS One. 3, e1565 (2008).
- Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).
- Ungrin, M. D., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).
- Markway, B. D., et al. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).
- Wallace, L., Reichelt, J. Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).
- Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. Phenotypic analysis of human embryonic stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).
