Summary
Konvensjonelle metoder for å initiere suspensjon aggregat basert kardial differensiering av human flerpotent stammer celler (hPSCs) er plaget med kultur heterogenitet med hensyn til aggregatstørrelse og form. Her beskriver vi en robust metode for hjerte differensiering ansette mikro å generere størrelse styrt hPSC aggregater dyrket med hjertefremmende forhold.
Introduction
In vitro cellekultur kan utføres under en rekke modaliteter, men blir typisk utført enten i todimensjonale adherente betingelser eller i tredimensjonale fjæringsforhold som mer fullstendig rekapitulere in vivo systemer. Følgelig er det en økende trend i mange felt av forskning for å utvikle robuste metoder for å generere tredimensjonale vev konstruksjoner. I situasjoner der celletyper og prosesser krever en støttende ekstracellulære matrix (ECM) overflate og heft signaler, kan tredimensjonale kultur aktiveres via stillaset konstruksjoner, hvor celler dyrkes på eller i en eksogen støtte matrise 1. Celler og prosesser som ikke krever adhesjon til en støttende matrise kan utføres i suspensjon som unscaffolded systemene består hovedsakelig eller utelukkende av celler (som kan deretter fortsette å generere sine egne endogene matriser) 2,3. Her presenterer vi en protokoll for hjerte differensiering of menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs - stamceller i stand til å bli noen celletype i kroppen, enten fra embryonale eller andre kilder) i størrelse kontrollerte, uniform, unscaffolded aggregater.
Differensiering av hPSCs som henge aggregater er plaget av store variasjoner i samlet størrelse både innen og mellom kjøringer. Denne variasjonen er et resultat av fremgangsmåten som typisk anvendes for å generere disse aggregater, som innebærer mekanisk dissosiasjon av cellekolonier. For å redusere denne variasjonen, har en rekke tilnærminger blitt anvendt for å kontrollere antall celler pr aggregat så vel som samlet diameter og ensartethet. Eksempler innbefatter dannelsen av aggregater i mikrosentrifugerør 4 eller som hengende dråper 5, micropatterning definerte todimensjonale hPSC kolonier 6, som deretter kan overføres til suspensjonen, eller sentrifugering av celler i U- eller V-bunn multi-brønnplater 7,8, 9. Men alle disse ca.oaches er begrenset av deres lave gjennomstrømningen av samlet produksjon. Vel-baserte systemer benytter en lignende tilnærming til V-bunnplaten systemer, men den mindre størrelsen på mikrobrønnene (i denne protokollen som hver har en bredde på 400 um) muliggjør genereringen av et større antall ensartede tilslag fra en enkelt kultur-platebrønn (standard diameter på 15,5 mm ~ inneholdende mikro ~ 1200) enn det som ville bli generert fra en hel V-bunnplate 10. Vel basert aggregatdannelse har blitt brukt i en rekke innstillinger, inkludert differensiering av hPSCs til ectodermal 11, endodermal 12, mesodermal 13 og extraembryonic 14 skjebner; chondrogenesis fra stamceller 15; generasjon av ensartede underlag for toksikologisk screening 16; og undersøkelser av mechanobiology 17.
En stor utfordring i å utvikle robuste industri protokoller for produksjon av hPSC-avledet cardiomyocytes har vært mangel på reproduserbarhet i hjerte differensiering effektivitet mellom kjøringer. Vi har tidligere vist at denne variasjon kan skyldes heterogenitet i utgangs hPSC befolkningen, som omfatter både selvfornyende hPSCs og differensiering av celler som uttrykker gener assosiert med endoderm og nevrale differensiering 6,18. Signaler utskilles av disse differensierende celler påvirke hjerte induksjon. Spesielt fremmer extraembryonic endoderm hjertestans induksjon, mens nevrale stamceller hemme hjertets induksjon. Ved hPSC aggregering, celler i den samlede differensiere og organisere slik at udifferensierte hPSCs er omgitt av et lag av extraembryonic endoderm celler som utvikler seg på den samlede overflaten 13. Ved å kontrollere samlede størrelse, kan vi modulere forholdet mellom hjerte-induserende endoderm celler til udifferensierte hPSCs (overflateareal til volumforhold) og optimalisere dette forholdet for maksimal hjerte induksjon 13.
Protocol
1. Utarbeidelse av Medium Components
- Forbered Wash Medium. Per 100 ml DMEM / F12, tilsett 1 ml 100x Penicillin / streptomycin (Pen / Strep), 1 ml 100x L-glutamin, og 5 ml serum erstatning.
- Klargjør kjemisk definerte Basal Cardiac Induksjon Medium i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forbered følgende aksje reagenser for media som vil bli brukt i denne protokollen.
- L-askorbinsyre: Fremstill en stamløsning av 5 mg pr ml i 4 ° C, sterile ultrarent destillert vann i et konisk rør.
- La denne løsningen på is, og vortex tube periodisk inntil det oppløste stoffet er fullstendig oppløst. Filter-sterilisere Ascorbic Acid løsning ved hjelp av en 0,22 mikrometer sprøyte filter.
- Fremstille 1 ml aliquoter av askorbinsyre løsning og lagre disse alikvoter ved -20 ° C. Bruk en fersk tint delmengde hver gang medium er forberedt.
- På dagen for medium forberedelse, Fortynne 13 mL av monotioglycerol (MTG) i 1 ml Basal Cardiac Induksjon Medium. Kast ubrukte, fortynnet MTG.
- Fremstille 1 ml alikvoter av Transferrin (30 mg / ml) til å lagre ved -20 ° C. Oppbevares tint alikvoter ved 4 ° C i inntil 3 måneder.
- Fremstille 4 mM saltsyre (HCl) inneholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA). I et avtrekksskap, tilsett 30 ul 6,0 N HCl-oppløsning til 50 ml ultrarent destillert vann. Filter-sterilisere løsningen ved hjelp av en 0,22 mikrometer sprøyte filter. Tilsett 2 ml 25% BSA-oppløsning i 50 ml HCl-oppløsning.
- Forbered fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,1% BSA. Tilsett 20 ul av 25% BSA-oppløsning per ml PBS.
- Forbered Menneskelig Bone Morfogenetisk Protein 4 (BMP-4) stamløsning (10 ng / mL). Oppløs 10 ug lyofilisert BMP-4 i 1 ml 4 mM HCl-bufferløsning inneholdende 0,1% BSA. Forbered 50 mL porsjoner til å lagre ved -20 ° C.
- Forbered human-fibroblast vekstfaktor 2 (bFGF) stamløsning(10 ng / ul). Oppløs 10 pg frysetørket bFGF i 1 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) inneholdende 0,1% BSA. Forbered 50 mL porsjoner til å lagre ved -20 ° C.
- Forbered human vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) stamløsning (5 ng / mL). Oppløs 5 pg lyofilisert VEGF i 1 ml PBS inneholdende 0,1% BSA. Forbered 50 mL porsjoner til å lagre ved -20 ° C.
- Forbered activin En stamløsning (10 ng / mL). Oppløs 10 ug lyofilisert aktivin A i 1 ml PBS inneholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Forbered 50 mL porsjoner til å lagre ved -20 ° C.
- Forbered hemmer av Wnt Produksjon-2 (iwp-2) lageroppløsning (10 mm). Løs opp 2 mg iwp-2 i 429 ul dimetylsulfoksid (DMSO). Forbered 10 mL porsjoner til å lagre ved -80 ° C.
- L-askorbinsyre: Fremstill en stamløsning av 5 mg pr ml i 4 ° C, sterile ultrarent destillert vann i et konisk rør.
- Forbered Komplett Cardiac Induksjon Medium. Til 100 ml av Basal Cardiac Induksjon Medium, tilsett 1 ml 100x Pen / Strep, 1 ml 100x L-glutamin, 500 mL av transferrin, enml nylig tint askorbinsyre, og 300 ul av MTG. Kast ubrukt medium.
2. Fremstilling av mikrobrønnplate
MERK: Alle trinn skal utføres i et biologisk sikkerhetskabinett.
- Tilsett 0,5 ml Renseoppløsning (kit komponent) til hver brønn som skal brukes på plate. For å sikre at løsningen kommer i kontakt på hele overflaten inne i hver mikrobrønn, sentrifuger platen ved 840 xg i 2 min.
- Platen inkuberes i 30 til 60 minutter ved RT.
- Aspirer Skylling Solution fra brønnene. Vask to ganger hver brønn som følger: Tilsett 1 ml PBS til hver brønn, sentrifuger plate på 840 x g i 2 min, og deretter suge PBS.
3. Dannelse av hPSC Aggregater i mikrobrønnplate
MERK: Alle trinn skal utføres i et biologisk sikkerhetskabinett.
- Plasser vaskemedium i et 37 ° C vannbad.
MERK: Volum required = 1 ml x antall brønner av HpSC som vil bli skilt. - Distansere hPSCs til enkeltceller
MERK: Disse trinnene beskriver dissosiasjon fra celler dyrket på 6 brønners plater - de reagensvolumene kan skaleres proporsjonalt for ulike kultur formater.- Aspirer kulturmediet fra hver hPSC kultur godt for dissosiasjon. Skylle hver brønn med 1 ml dissosiasjon enzym, og deretter umiddelbart aspirer dissosiasjon enzym fra hver brønn.
MERK: Residual dissosiasjon enzymet bør være tilstrekkelig til å dissosiere cellene. - Inkuber platen ved 37 ° C i 3 minutter.
- Tilsett 1 ml vaskemedium til hver brønn, og mekanisk å dissosiere cellene fra vevkultur overflate ved pipettering av vaskemedium med en P1000 mikropipette over vevskultur overflate. Når dissosiasjonen ser ut til å være ufullstendig, og celleklumper forbli, passerer suspensjonen gjennom en sil på dette punktet.
- Overfør cellesuspensjonen til en 15 ml konisk rør og butikkrøret i kuvøsen, mens celletallet blir utført i det neste trinn.
- Utfør et celletall:
- Ta en 10 pl prøve av cellesuspensjonen samles opp i det foregående trinn. Tilsett 30 mL av trypanblått og blande suspensjonen godt ved pipettering.
- Overfør 10 ul av trypanblått-fargede celler til hvert kammer av et hemocytometer og visualisere under invertert mikroskop med 10X objektiv. Telle celler.
- Fra celle teller resultatene, beregne hvor mange brønner kan bli seedet på 1,2 x 10 6 celler per brønn av mikroplaten. Beregn Aggregation Medium nødvendig å frø cellene på 1 ml per brønn.
- Forbered aggregering medium. Per 10 ml Complete Cardiac Induksjon medium, tilsett 0,5 mL av BMP4 stamoppløsning (sluttkonsentrasjon = 0,5 ng / ml) og Y-27632 ROCK inhibitor (endelig konsentrasjon = 10 uM).
- Fjern konisk rør som inneholder hPSCs fra inkubatoren og centrifuge røret ved 200 xg i 5 minutter. Suge vaskemediet og resuspender cellene i aggregering medium ved en tetthet på 1,2 x 10 6 celler pr ml.
- Aspirer PBS-vaskeoppløsning fra hver brønn på mikrobrønnplate. Ved hjelp av en mikropipette P1000, jevnt fordele og frø 1 ml av cellesuspensjon til hver brønn på mikrobrønnplate. Å pode et stort antall brønner, periodevis vortex cellesuspensjonen for å forhindre settling.
- Sentrifuger plate ved 200 xg i 5 minutter. Observere platen under mikroskop for å bekrefte at cellene er spunnet til bunnen av hver mikrobrønn.
- Platen inkuberes i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2, 5% O 2 (hypoksiske) inkubator.
- Aspirer kulturmediet fra hver hPSC kultur godt for dissosiasjon. Skylle hver brønn med 1 ml dissosiasjon enzym, og deretter umiddelbart aspirer dissosiasjon enzym fra hver brønn.
4. Cardiac Induksjon Stage 1
- En dag etter aggregasjon (dag 1), fremstille det nødvendige volum av Trinn 1 Induction medium (for en 24-brønners plate, volum = 1 ml x antall brønner). For 1 ml kompletthjerte induksjon medium, tilsett 1 pl av BMP4 stamoppløsning (sluttkonsentrasjon = 10 ng / ml), 0,5 ul av bFGF stamoppløsning (sluttkonsentrasjon = 5 ng / ml), og 0,6 ul av aktivin A (sluttkonsentrasjon = 6 ng / ml). Plasser medium i et 37 ° C vannbad i minst 15 min.
- Fjern det mikrobrønnplate fra inkubatoren. Inspiser aggregatene under mikroskop. Sammenlignet med umiddelbart etter sentrifuge aggregering, bør de vises intakt med myke kanter (mer rund og mindre firkantet enn gårsdagen).
- Fjern supernatanten uten å forstyrre aggregatene inne i mikro:
- Hold mikroplaten horisontalt nivå (ie., Ikke vippe det). For hver brønn på mikrobrønnplate, plasserer spissen av en P1000 mikropipette på overflaten av kulturmediet og mot kanten av brønnen.
- Sakte fjerne mediet, være forsiktig for ikke å forstyrre aggregatene på bunnen av mikrobrønnene. Etter å redusere than middels nivå til omtrent 1 til 2 mm fra den teksturerte mikro overflate, langsomt vippe platen for å samle mediet på en side av brønnen (når volumet er tilstrekkelig lav, blir flytende bevegelser sterkt redusert, og det er lettere å unngå aggregater bli løftet ut av deres individuelle mikrobrønner). Sakte pipette ut det gjenværende medium i brønnen.
- For å legge til frisk Stage 1 Induction Medium samtidig aggregatene forbli i sine individuelle mikro: Tegn en ml Stage 1 induksjon medium med en P1000 mikropipette. Hold pipettespissen mot den indre kanten av brønnen og meget langsomt dispensere mediet mot innerveggen av brønnen. Gjenta for de resterende brønnene.
- Returnere platen til inkubatoren i henhold hypoksiske forhold i 3 dager.
5. Cardiac Induksjon Stage 2
- På dag 4, place vaske medium (volum = antall brønner x 2 ml) i et 37 ° C vannbad i minst 15 min.
- Klargjør nødvendig volum av Stage 2 Induksjon Medium (volum = antall brønner x 1 ml): Per ml Komplett Cardiac Induksjon Medium, tilsett 2 mL av VEGF stamoppløsning (endelig konsentrasjon = 10 ng / ml) og 0,5 mL iwp-2 stamoppløsning (sluttkonsentrasjon = 5 uM). Plasser den fremstilte Trinn 2 Induksjon medium i et 37 ° C vannbad i minst 15 min.
- Ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette, høste aggregatene fra hver brønn på mikrobrønnplate og samle den samlede suspensjonen i et 15 ml konisk rør (samle opp til 10 brønner pr 15 ml tube).
- Tillat aggregatene å bosette i 15 min i et hypoksisk inkubator.
MERK: Dette trinnet er viktig å skille enkeltceller og cellerester fra intakte aggregater. - Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender aggregatene i 10 ml av pre-oppvarmet vaskemedium for å fjerne rester av induktive cytokiner (for eksempel, er aktivin A en potent signalmolekyl selv ved meget lave concentrations).
- Sentrifuger tilslag på 50 xg i 2 min. Aspirer supernatanten. Suspender pelle aggregater i forvarmet Induksjon 2 Medium.
- Overfør den samlede suspensjonen til en 24-brønners ultra-lav festet (ULA) plate på 1 ml pr brønn. Observer aggregatene under mikroskopet som uniform, stramme cellegrupper. Inkuber i henhold hypoksiske forhold til dag 6.
6. Cardiac Induksjon Stage 3
- På dag 6, forberede de nødvendige volumet av Stage 3 Induction Medium (volum = antall brønner x 1 ml). I 1 ml komplett Cardiac Induksjon medium, tilsett 2 mL VEGF stamoppløsning (sluttkonsentrasjon = 10 ng / ml), og 0,5 ul av bFGF stamoppløsning (sluttkonsentrasjon = 5 ng / ml). Plasser fremstilt Trinn 3 induksjon medium i et 37 ° C vannbad i minst 15 min.
- Bruke en 5 ml serologisk pipette for å overføre aggregatene til 15 ml koniske rør, pooling opp til 10 ml av aggregaters per tube.
- Tillat 10 minutter for aggregatene å bosette seg. Aspirer supernatanten og resuspender aggregatene i forvarmet Stage 3 Induction Medium. Ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette, redistribuere aggregatene inn i en 24-brønners plate ULA på 1 ml pr brønn.
- På dag 10, forberede de nødvendige volumet av Stage 3 Induction Medium (volum = antall brønner x 1 ml) som per trinn 6.1.
- Bruk en 5 ml serologisk pipette til å overføre tilslag til 15 ml koniske rør, pooling opp til 10 ml tilslag per tube.
- Tillat 10 minutter for aggregatene å bosette seg. Aspirer supernatanten og resuspender aggregatene i Stage 3 Induction Medium. Ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette, redistribuere aggregatene inn i en 24-brønners plate ULA på 1 ml pr brønn.
- Inkuber i henhold hypoksiske betingelser i to dager. På dag 12, begynne å inkubere cellene ved normoksisk oksygennivåer for resten av dyrkningsperioden (37 ° C, 20% O2, 5% CO2).
NOTAT:Etter dette tidspunkt ble cellene ikke lenger er dyrket med hypoksiske betingelser. - Gjenta dette komplett medium utveksling (trinn 6.2 og 6.3) hver 4 dager, begynner dagen 14 til celle høsting (typisk, peak cardiomyocyte konsentrasjoner er observert etter dag 14 av differensiering).
7. Flowcytometri Analyse av Cardiac troponin T (cTnT) Expression Frekvens av Micro Kultur Output
- Dissosiere aggregatene som følger:
- Bruk en 5 ml serologisk pipette til å overføre en vel av aggregater til en 15 ml konisk tube. Sentrifuger aggregater ved 50 x g i 2 minutter og omhyggelig aspirer supernatanten.
- Tilsett 1 ml av nyoppløst 1 mg / ml Collagenase type II-løsning til aggregatene. Overfør den samlede suspensjonen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Inkuber aggregatene i Kollagenase Type II over natten ved romtemperatur.
- Dagen etter, bruker en P1000 mikropipette å forsiktig distansere aggregatenetil en homogen enkelt cellesuspensjon. Dersom aggregatene ikke lett dissosierer, avgjøre aggregatene, aspirer supernatanten, og inkuber aggregatene i 700 ul Dissosiasjon enzym i 1 til 2 minutter ved romtemperatur. Forsiktig pipette aggregatene 1 til 2 ganger med en P1000 mikropipette å distansere.
- Fortynn dissosiasjon enzymet: Legg 700 ul vaskemedium inneholdende 14 ul av 1 mg / ml DNAse stamløsning. Ta en 10 pl prøve for å utføre en celletelling, og sentrifuger den resterende suspensjonen ved hjelp av en benk-topp mikrosentrifuge ved 300 xg i 2 min.
- Utfør et celletall: Stain 10 mL telling prøve med et likt volum av trypanblått og telle ved hjelp av en hemocytometer.
- Fjern 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende de gjenværende celler fra mikrosentrifuge. Aspirer supernatanten og resuspender cellene, i en konsentrasjon på 200 000 til 500 000 celler per 100 ul, i Hanks balanserte saltløsning innehold2% føtalt bovint serum (HF).
- For hver tilstand, å overføre 100 ul cellesuspensjon per brønn til 2 brønner i en 96-brønns plate (en brønn vil være farget med cTnT antistoff og den andre vil være det sekundære antistoff kontroll).
- Sentrifuger plate ved 300 xg i 2 min. Fjern supernatanten med en multikanalpipette.
- Fikser cellene Tilsett 200 ul av fikseringsløsning (sett-komponent) per brønn og inkuber platen i 15 minutter ved RT.
- Sentrifuger plate ved 300 xg i 2 min. Bruk en multikanalpipette å nøye trekke supernatanten fra brønnene. Kast supernatanten i en paraformaldehyde avfallsbeholder.
- Vask de faste cellene to ganger: Tilsett 200 ul av HF til hver brønn. Sentrifuger plate ved 300 xg i 2 min. Aspirer supernatanten, og gjenta vasketrinnet igjen. Faste celler kan lagres i opp til en uke i HF ved 4 ° C.
- Permeabilize cellene:
- Sentrifuger plate ved 300x g i 2 min.
- Tilsett 100 Permeabilization Solution (kit komponent) til hver brønn og inkuber platen ved romtemperatur i 5 min.
- Sentrifuger plate ved 300 xg i 2 min og aspirer supernatanten.
- Fremstille et konsentrat-blanding av anti-cTnT i HF ved den optimale konsentrasjonen for det angitte partinummer (Den optimale fortynning må bestemmes ved titrering og er typisk i området fra 1: 500 til 1: 2000).
- For hver tilstand (2 brønner pr tilstand), tilsett 100 ul masterblanding til en brønn (farget prøve) og 100 ul av ren HF til den andre brønnen (sekundært antistoff kontroll). Inkuber cellene ved 4 ° C i 30 minutter.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 2 min. Aspirer supernatanten og tilsett 200 ul HF per brønn. Gjenta dette vasketrinn en gang til.
- Forbered en mester blanding av det sekundære antistoffet. Overfør et volum av HF som svarer til 100 ul i hver brønn (kontroll og sekundære antistoffetcTnT-farget) som behandles. Tilsett 1 pl geite-anti-muse-sekundært antistoff APC per 200 ul HF (1: 200 fortynning).
- Flekk prøvene. Tilsett 100 ul av fargeløsning til hver brønn (både det sekundære antistoff kontroll og anti-cTnT-farget brønner). Inkuber cellene i mørke ved 4 ° C i 30 minutter (beholde den plate som er dekket eller i mørket etter tilsetning av fluorescerende sekundært antistoff for å unngå fotobleking).
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 2 min. Aspirer supernatanten og tilsett 200 ul HF per brønn. Gjenta dette vasketrinn en gang til.
- Overfør prøvene til 5 ml rund bunn flowcytometer analyse rør og utføre flowcytometri for signal i APC kanal ved hjelp av standard protokoller for instrumentet 19.
Representative Results
Størrelseregulert aggregater av hPSCs effektivt kan bli dannet ved hjelp av mikrosystemet, avhengig bare av konsentrasjonen av celler og mikroflateareal. Etter en kort sentrifugering, blir de passende antall celler (1.000 i denne protokollen) bringes sammen i hver mikrobrønn (figur 1A). Viktigere, disse cellene gjenetablere intracellulære forbindelser i 24 timer, og bør ikke lenger fylle brønnen, men det ser ut som kompakte aggregater med glatte kanter (figur 1B). Disse aggregater gi utgangsmaterialer for ytterligere differensiering mot en hjerte skjebne. Hvis cellene ikke klarer å danne tette klynger, tyder dette mulig celledød etter dissosiasjon og reaggregering, og egnetheten av enkeltcelle aging og ROCK inhibitorkonsentrasjoner for en bestemt cellelinje bør undersøkes. Følgende tre dager i mikro viser liten endring i samlet Morphologi, selv om noen vekst er tydelig. Når fjernet fra mikrobrønnene, skal tilslag opprettholde sin runde, tettpakket morfologi og være av samme størrelse til hverandre (figur 1C). Kultur i ULA 24-brønners plater vil tillate ytterligere celle ekspansjon og vekst.
Etter dag 8, etter eksponering første til activin signalering, og Wnt hemming, vil aggregatene begynner å fremstå som større og lysere tilslag (Figur 1D). I løpet av denne perioden, vil betydelig cellerester være tydelig på bunnen av hver brønn, og må fjernes ved at aggregatene for å avgjøre før fjerning av mediet. Av og til vil mange tilslag smelte sammen. Dette vil ikke hemme differensiering av andre aggregater i brønnen, selv om disse "super" aggregater har en tendens til ikke å oppvise de morfologiske endringer sett med mindre aggregater og er mindre tilbøyelige til å gjennomgå fullstendig differensiering.
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Fortsatt differensiering resulterer i betydelige morfologiske endringer i aggregater med økt størrelse og utseende organiserte fiber regioner. Ved dag 12, kan kontrahering aggregater holdes. Disse vil alltid bestå av store, transparente celler og inkluderer ofte omfattende ekstracellulær matriks utsiden av aggregat (figur 2). Mens samlede omfattende sammentrekninger indikerer en vellykket differensiering, kan hjerte markør uttrykk også observeres i aggregater som ikke ser ut til å trekke seg sammen. Etter dissosiasjon av aggregater og immunolabeling, vil et flertall av celler være positivt for kardiomyocytt markør cTnT av flowcytometri (figur 3). Ekspresjonen av denne markøren er stabil i cellene og kan observeres i aggregater så sent som i dag 19 av differensiering.
1.jpg "/>
Figur 1: Tidslinje for hPSC differensiert mot en hjerte skjebne Umiddelbart etter aggregering, celler nesten fylle hver mikro (A).. En dag senere, vises aggregatene kondensert og glatt (B). Denne morfologi vedvarer selv når aggregatene er fjernet fra mikrobrønnene og platet inn i brønnplater (C). Etter dag 8, aggregater begynne å utvide og lysere i fargen (D). Skala:. 250 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Aggregater Begynn kontraherende by Day 12 av Differensiering Etter seks dager i Cardiac Induksjon Stage 3 Medium, ble kraftfulle samlede dekkende sammentrekninger observert (øverste panel. Slappe avasjon, midtre panelet: sammentrekning). Det nedre panel er avledet fra å trekke de øvre og midtre panelene, og de fleste signifikante forskjeller som opptrer som svarte eller hvite (pilspisser). Skala:. 250 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Immunolabeling for Cardiac troponin T i Differensiert hPSCs På dag 17, de fleste av cellene er positive for hjerte troponin T ved strømningscytometri (fylt histogram). Også vist er celler farget med sekundært antistoff alene (uten fylling histogram). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det har blitt observert at effektiv kardial differensiering av pluripotente stamceller er en svært variabel prosess. Mens det er ikke overraskende at forskjellige cellelinjer som oppviser varierende tilbøyeligheter for differensiering kapasitet til bestemte celletyper, har det blitt observert at kardial differensiering effektivitet varierer dramatisk mellom replikat forsøk ved bruk av den samme cellelinje 6. Protokollen er beskrevet her tar opp en viktig kilde til denne variasjonen ved direkte styre input celle nummer per aggregat. For ytterligere å redusere variabilitet mellom kjøringer, anbefales det at hPSC linjer tilrettelagt for enkelt celle aging brukes, som denne formen for hPSC utvidelse og vedlikehold gir mer konsistente pluripotente populasjoner med hensyn til uttrykk frekvenser av pluripotency markører (f.eks Oct4, Nanog, Tra-1-60, osv.).
Protokollen som skrevet her angir en samlet størrelse på 1000 celler for optimal hjertestans induksjon fra HMS-2 embryonale stamcellelinje. For å anvende denne protokollen til forskjellige cellelinjer, er det avgjørende at en første aggregatstørrelse skjerm utføres for å bestemme den cellelinje-spesifikk optimal aggregatstørrelse. Selv om det ikke direkte påvirke de prosedyrer som skal følges her, vi minne leseren at endringer i samlet størrelse og generell celletetthet er forventet å påvirke oksygentilførsel. Dette kan bli et relevant hensyn på nedstrømsapplikasjoner. I tillegg er apoptotisk celledød et problem under dissosiasjon av hPSCs til enkeltceller. Derfor er det viktig å sikre at ROCK-inhibitoren er til stede under tvungen celle aggregering i mikrobrønnene. Endelig, er det avgjørende at på dag 4 av differensiering aggregatene er godt vasket for å fjerne spor av aktivin A, som er tilstede i Induksjon en Medium, før resuspensjon i Induksjon 2 Medium. Etter dag 4 av differensiering, fremmer activin A endoderm differensiering på bekostning av mesoderm induksjon 20.
Den viktigste anvendelsen av denne teknikken er å skjerme aggregerte størrelser som fremmer effektiv hjertestans differensiering. Imidlertid er en av begrensningene i dagens teknikk som det er utfordrende å skalere hjerte produksjon til klinisk relevante nivåer med mikroplater. Scale opp av hjertestans differensiering er vanligvis utført i bulk dyrkningsforhold i rørt suspensjon bioreaktorer 21. Derfor, når mikro systemet har blitt benyttet for å bestemme akseptable nivåer av aggregatstørrelse for effektiv hjerte induksjon, er neste trinn å skalere opp, er å bestemme bioreaktor løpehjulhastigheter som kan generere den ønskede celleaggregatstørrelse.
En av de vesentlige forskjeller i denne teknikk med hensyn til andre fremgangsmåter for aggregatbasert hjerte differensiering er at den muliggjør direkte undersøkelser modulerende effekter av endogent signalering i aggregater samtco-kultur induktive / hemmende vevstyper med hPSCs i samlet 13. Disse typer undersøkelser kan informere prosessutvikling i stor skala hjerte produksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet | |||
| Pipette aid | |||
| Serological pipettes (5 to 25 ml) | |||
| Aspirator | |||
| Aspirator or Pasteur pipettes | |||
| 15 and 50 ml conical tubes | |||
| Fume hood | |||
| 0.22 µm syringe filter | |||
| 5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
| 5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
| Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
| P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
| Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
| Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Bench-top microcentrifuge | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Vortex | |||
| Ice | |||
| -20 °C freezer | |||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
| StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
| Transferrin | Roche | 10652202001 | |
| BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
| bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
| VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
| Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
| IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| 100x L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
| Hemocytometer | |||
| Trypan Blue | |||
| Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
| Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
| 96 well plate (for FACS staining) | |||
| Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
| cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
| goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
| 5 ml round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |
References
- Wintermantel, E., et al. Tissue engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials. 17, 83-91 (1996).
- Lazar, A., et al. Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).
- Sachlos, E., Auguste, D. T. Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation. Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).
- Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).
- Steinberg, M. S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).
- Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation. Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PloS One. 3, e1565 (2008).
- Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).
- Ungrin, M. D., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).
- Markway, B. D., et al. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).
- Wallace, L., Reichelt, J. Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).
- Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. Phenotypic analysis of human embryonic stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).
