Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Визуализации кальция в Published: August 6, 2016 doi: 10.3791/54311
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Zoology, University of Cambridge
* These authors contributed equally

Summary

В данной статье описывается адаптируемый экс виво протокол для визуализации Ca 2+ во время активации яйца у дрозофилы.

Introduction

Изменение внутриклеточного Са 2+ концентрации в яйце (ооцитов) активации является сохраняющимся компонентом всех изученных организмов 1,2. Это событие инициирует широкий спектр Ca 2+ -зависимые процессов, в том числе возобновление клеточного цикла и трансляции сохраненных мРНК. В связи с этим требованием , Ca 2+, визуализируя переходные изменения внутриклеточной концентрации Са 2+ является ключевой интерес.

Исторически сложилось так, модельные организмы были отобраны для исследования по активации яиц на основе размера и доступности их яиц. Различные подходы к визуализации были использованы , чтобы следовать и количественной оценки изменений во внутриклеточной концентрации Са 2+ в этих системах, в том числе: Фотобелок акворина в Оризии рыбы 3; Ca 2+ чувствительные флуоресцентные красители , такие как Fura-2 в морских ежей и хомяка 4,5; и кальций - зеленый-1-декстрана в Xenopus 6.

Генерация и улучшение генетически кодируемых показателей кальция (GECIs) превратило способность визуализировать динамику Ca 2+ в естественных условиях 7. Эти генетические конструкции выражаются в конкретных тканях и ограничить потребность в препаратах инвазивного ткани 8.

GCaMPs являются зеленый флуоресцентный белок (GFP) , класс , основанный на GECIs , которые были очень эффективны в связи с их высоким сродством Ca 2+, отношение сигнал-шум и способность быть настроены 9-11. В присутствии ионов Са 2+, комплекс GCaMP претерпевает ряд конформационных изменений, начиная с связывание Са 2+ с кальмодулин, что приводит к увеличению флуоресцентной интенсивности GFP компонента 9.

GCaMPs широко используются в исследованиях Drosophila нейронов визуализировать изменения внутриклеточного кальция 12. Недавние Applicatiпо технологии GCaMP визуализации Ca 2+ в зрелых яиц дрозофилы показал одну переходную Ca 2+ волну при активации яйца 13,14. Волны Ca 2+ могут быть визуализированы при малом увеличении во время овуляции в естественных условиях 13 или при большем увеличении с использованием ех естественных условиях анализа активации 13,14. В естественных условиях экс анализа, отдельные зрелые ооциты выделяют из яичников и активируют с использованием гипотонического раствора, именуемых активации буфера, которое было показано , чтобы резюмировать события активации 15-17 в естественных условиях.

Этот анализ ех естественных условиях позволяет легко визуализировать с высоким разрешением Са 2+ волны при различных экспериментальных условиях , включая фармакологическую нарушения, физических манипуляций и генетических мутантов. Эта статья демонстрирует получение зрелых яиц дрозофилы для активации экс естественных условиях и гое последующая микроскопия используется для визуализации волны Ca 2+ с помощью GCaMP. Такой подход может быть использован для тестирования инициации и контроля волны Ca 2+ и зондировать вниз по течению результатов.

Protocol

Примечание: Выполнить все операции, при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка к Dissection

Примечание: Описанные здесь шаги в соответствии с E. Гавис, Принстонский университет и Weil и др. и др. 18. Выполните следующие шаги, за два дня до съемки.

  1. Возьмем муху флакон, содержащий приблизительно 10 мл твердой пищи и добавить небольшое количество сухих дрожжей на один угол, менее 1 г достаточно.
    Примечание: Для получения информации о летучей флаконах или пищевых продуктов см 'Drosophila Техническое обслуживание »19.
  2. Добавьте 1 - 3 капли воды для гидратации дрожжей.
  3. Установите флакон в сторону под углом 45 ° и позволяют 3 - 5 мин для дрожжей, чтобы принять вверх воду.
  4. В то время как дрожжи поглощает воду, выбрать бутылку мух , экспрессирующих UASt- Миэр GCaMP5 20 , приводимый Тюб-VP16GAL4 (называемый GCaMP5) , которые в последнее время появились (в myristoyняющей форма GCaMP5 была выбрана, чтобы обеспечить высокое отношение сигнал-шум путем привязывания к Geci к мембране в яйце).
  5. Анестезировать мух в бутылке с CO 2 газа. Обязательно держите бутылку перевернутой таким образом, чтобы не потерять мух в мокрой пищи.
  6. Совет анестезированных мух на СО 2 колодки и сортировки 10 - 15 самок и 5 самцов с помощью кисти под рассекает микроскопом. Примечание: стандарт включает мужчин, чтобы обеспечить здоровые женщины для рассечения.
  7. Когда флакон с шага 1.3 будет готова, добавить выбранные мух во флакон. Позаботьтесь, чтобы держать флакон в горизонтальном положении, пока мухи не станут активными.
  8. Помещают пробирку при 25 ° С в течение приблизительно 36 часов.
  9. Возвращение оставшихся мух от СО 2 подушки к бутылке или выбраковки.

2. Режущая Drosophila Яичники

Примечание: Описанные здесь шаги в соответствии с Weil и др. и др.

  1. После того, как 36 ч, анестезию мух из дрожжевого флакона с CO 2.
  2. После того, как мухи внутри флакона анестезируют кончик их на СО 2 площадку для сортировки с кистью под микроскопом рассекает.
  3. Выберите женщину.
  4. Изолировать два яичники от самки. Для полного детального протокола см Weil эт. и др. 18. В итоге:
    1. Поместите небольшую каплю окисленной Галокарбоновое масло (серия 95) на N: 1,5, 22 х 40 мм покровным.
    2. Возьмитесь самки с пинцетом в передней части живота.
    3. Держа самка под микроскопом рассекает, используйте второй набор щипцов, чтобы аккуратно снять заднюю самки.
    4. Протрите заднюю ткань от второго щипцами.
    5. Выдавить на животе полости со вторыми пинцетом от передней к задней части живота. Два непрозрачные яичники должны придерживаться щипцов, когда за пределами FEMAле.
    6. Прикоснитесь к яичники в масло.
    7. Удалите ткань из пинцета, вытирая щипцов.
    8. Повторите эти действия (2.4.1 - 2.4.7), чтобы получить три покровные, каждый из которых содержит яичники из одной мухи.

3. Индивидуальные изолируя Зрелые яйца

  1. Под стандартным рассекает микроскопом с увеличением, установленным в 4 раза, на первом покровное с шага 2.4, разделить два яичники, оторвав яйцевод.
  2. Представьте пару закрытых щипцов в центре одного яичника, следя за тем, чтобы не проколоть любые яичные камеры.
  3. Вставьте стандартный рассекает зонд в центре яичник рядом с закрытым пинцетом.
  4. Аккуратно перетащите рассекает зонд через яичнике к заднему полюсу, где зрелые яйца (этап 14 яиц камеры) расположены.
  5. Повторите шаги 3.1 - 3.4 2 - 5 раз в зависимости от размера яичнике и количества яиц.
    Примечание: Добавление CO 2 Примечание: Зрелые яйца могут легко отделить от яичников соединительной ткани.
  6. Если не зрелые яйца не видны снаружи яичника, продолжайте мягко дразнит с рассекает зондом.
  7. После того, как зрелые яйца видны на покровное за пределами яичник, маневрировать 3 - 5 в линию в центре покровное.
    Примечание: Для достижения наилучших результатов, запустить зонд осторожно вдоль стороны яйца.
    Примечание: Избегайте потянув на спинных придатков, так как это может повредить яйцо.
    Примечание: В зависимости от будущего изображения установка, выравнивание яйца примерно 200 мкм друг от друга перпендикулярно покровное для максимальной области визуализации.
  8. После того, как выровнен, удалите остальную часть ткани яичников, перетащив его от выровненных яиц с использованием пorceps.
  9. Удалите излишки масла путем протирания углу медицинской салфеткой. Будьте осторожны, чтобы не касаться зрелых яиц с медицинским вытирать, как зрелые яйца, которые контактировали будут потеряны.
  10. Draw перекрестие на покровное с маркером для упрощения размещения образца под микроскопом.
  11. Установите покровное в безопасном месте и оставить подготовленные яичные камеры на покровное, чтобы отдохнуть в течение 5 - 10 мин. Это позволяет яйцу оседают в масле. Образцы могут быть использованы до 1 ч после рассечения.
  12. Повторите шаги 3.1 - 3.11 для остальной части покровные с яичниками на них.

4. Подготовка к визуализации

  1. Доведите подготовленный буфер активации 15 до комнатной температуры.
    Примечание: Буфер активации представляет собой гипотонический буфер: 3,3 мМ NaH 2 PO 4, 16,6 мМ КН 2 РО 4, 10 мМ NaCl, 50 мМ КСl, 5% полиэтиленгликоль 8000, 2 мМ CaCl 2, доводили до рН 6,4 с 1: 5 отношение NaOH: КОН.Для получения дополнительной информации см Маховальда, 1983 15. Аликвоты буфера активации можно хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев , и при 4 ° С в течение до 2 -х недель.
  2. Тщательно подготовленные транспортировать покровные, буфер активации и стеклянные пипетки к средству визуализации.
    Примечание: Широкий поле, конфокальной, вращающийся диск или легкий лист микроскоп может быть использован. Мы рекомендуем использовать инвертированный микроскоп. Наши репрезентативные результаты были получены с помощью конфокальной микроскопии.
  3. Цель подходит для работы с изображениями всего зрелую яйцеклетку следует выбирать (здесь: 20X 0,7 NA).
  4. Установите первый подготовленный покровное на столике микроскопа. Будьте осторожны, чтобы не сломать покровные на сцене.
  5. Качественно выбрать поле зрения со зрелой яйцевой камеры для активации. Не изображение проколот яичные камеры или те, с блеббинга в мембране.
    Примечание: шаги 4.6 - 4.7, программные команды будет меняться в зависимости от микроскопа и производителя.
  6. Набор изображений пунктметров для стандартного GFP возбуждения (488 нм) и испускания (500 - 580 нм). Также настроен вид ярко-поле для того, чтобы визуализировать и ориентированность зрелую яйцеклетку и смещенный масло.
  7. Выберите самый низкий Z-плоскость, где зрелые яйца видимы и установить полный Z-стек, которые необходимо принять в течение 40 мкм приблизительно 2 мкм на шаг. Установите параметры таким образом, нет никакой задержки между приобретением Z-стека. Установите временные ряды, чтобы захватить в течение примерно 30 мин.

5. визуализации Ex Vivo Яйцо активации

  1. Запустить захват изображения.
  2. Подождите 1 - 2 полных Z-стеки должны быть приобретены. Это показывает зрелую яйцеклетку до активации.
  3. Вывод примерно 300 мкл буфера активации в стеклянную пипетку.
  4. Позиционирование кончик стеклянной пипетки, содержащей буфер активации под углом 45 ° над покровное, медленно переместите пипетку на траекторию луча, пока он не находится непосредственно над зрелое яйцо изображаемого. Стеклянная пипетка должнабыть 1 - 2 см выше масла.
  5. Добавьте 1 - 2 капли буфера активации менее чем за 5 секунд от стеклянной пипетки. Это должно вытеснять масло. Избегайте добавления избытка буфера активации или прикосновением яйцо со стеклянной пипеткой, как это может привести к смещению зрелого яйца. Будьте осторожны, не прикасайтесь к покровное с пипеткой, так как это может привести к изменению в фокальной плоскости или пузырьков воздуха с образованием в иммерсионного масла между объективом и покровное.
  6. В то время как добавление буфера активации во время получения изображения, проверьте канал светлого поля, чтобы гарантировать, что масло было перемещено буфером активации.
    Примечание: Это будет сначала появляются как тень из-за пипетку нарушения на пути луча, но также приведет к появлению мелких капель масла. Некоторые капли масла могут оставаться связанным со зрелой яйцеклетки, которые будут влиять на экспериментальные результаты и качество изображения.
  7. Если масло не смещается из первоначального добавления активирующего буфера повторите шаги 5.4 - 5.6.
  8. После того, как масло успешно смещаются, позволяют временные ряды не работать до завершения.
    Примечание: Из-за отека ооцитов при активации, некоторые яичные камеры резко съехать из фокальной плоскости или поля зрения при добавлении буфера активации. В этой ситуации остановить приобретение и смонтировать следующий покровное.
  9. После того, как последовательность изображений завершила приобретение, сохранение данных.

6. после приобретения Обработка изображений

  1. Откройте набор данных, используя Фиджи (http://fiji.sc/Downloads#Fiji~~HEAD=dobj) или эквивалентное программное обеспечение для обработки изображений, а затем выберите соответствующие файлы для анализа.
  2. Чтобы построить проекцию полученных данных выберите: Image> Стеки> Z-проект.
  3. Выберите начальную Z-среза и Z-срез стоп, как правило, весь раздел. Выберите тип проекции, как правило, установлен в "Max Intensity". Проверьте окошки "Все временные рамки", чтобы применить выбранные настройки ко всей серии.
  4. Еслиболее чем один флуоресцентный канал был, изображаемый с помощью инструмента Каналы для того, чтобы движение между цветами, сделать составной, или сделать изображение в оттенках серого. Выберите Image> Цвета> Каналы инструмент.
  5. Для регулировки яркости и контрастности изображения выберите изображение> Adjust> Brightness / Contrast.
  6. Чтобы экспортировать одно изображение, переместите ползунок временной шкалы к соответствующей рамке и выберите File> Save As> Jpeg или любой нужный формат.
  7. Выберите местоположение и название для экспортируемого файла, а затем сохранить.
    Примечание Частота кадров с помощью программного обеспечения визуализации потребуется, чтобы дать временную метку на изображении.
  8. Для экспорта временной ряд как фильм выберите: File> Save As> AVI, а затем выбрать частоту кадров (~ 7 кадров в секунду).
  9. Выберите местоположение и название для экспортируемого файла, а затем сохранить.
  10. Для того, чтобы сохранить измененное файл в формате Фиджи, выберите Файл> Сохранить.

Representative Results

Вот мы продемонстрировали , как подготовить зрелые яйца дрозофилы для активации экс естественных условиях. Яйца , выражающие Geci включить визуализацию Ca 2+ динамика при активации яйца и начало эмбрионального развития (рисунок 1). Следует отметить , что в зависимости от GCaMP используется, в частности , наличие миристоил группы, результаты могут иметь небольшие качественные отличия 13 14. Кроме того, мы продемонстрировали роль функциональной актина во время активации яиц путем добавления ингибитора полимеризации актина, цитохалазином D, в буфер активации (рисунок 2) 14.

Требование к цитоскелета при активации яиц сохраняется. В С. Элеганс, после оплодотворения, цитоскелета компоненты реорганизованы для подготовки эмбриона одноклеточных для первого асимметричного деления 21,22. В морских ежей, нарушение cytoskeleTal реорганизации после активации было показано , что влияет на клеточный цикл путем предотвращения образования цикла сократительную 23. Роль актина в опосредовании волну Са 2+ и ее вниз по течению функцию при активации яиц у дрозофилы остается полностью выяснены.

У Drosophila, со-визуализация Са 2+ волн и цитоскелета может быть достигнуто с помощью этого анализа , исключая виво активации. Временные ряды нескольких каналов могут быть приобретены и динамика внутриклеточного Ca 2+ могут быть сопоставлены с изменениями в организации актина в ооцитах (рисунок 3).

Рисунок 1
Рисунок 1:. Единый Ca 2+ волна в серии Drosophila Яйцо Время активации экс естественных условиях зрелых Drosophila яйца , выражающую UASt- myrGCaMP5 следуя аddition буфера активации (АГ). Повышение цитоплазматического Са 2+ берет свое начало в заднем полюсе (B) , а затем распространяет (BF) со средней скоростью около 1,5 мкм / с. Инициирование волны, как правило, наблюдается в течение 3 мин после добавления буфера активации. После активации внутриклеточных уровней кальция зрелого яйца возвращается к предварительной активации уровней (G, H). См дополнительный фильм 1 (общее время 33 мин). Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Добавление Цитохалазин D к активации буфера возмущает Ca2+ Распространение волн. Временных рядов экс виво зрелых Drosophila яйцеклетку , выражающую UASt- myrGCaMP5 после добавления активации буфера , содержащего 10 мкг / мл цитохалазином D конечной концентрации (AH). В то время как 2+ волна Са инициируется на заднем полюсе (а), она скомпрометирована и не доходит переднюю часть яйца (F) (белые головки стрелок обозначают фронт волны). Никаких дополнительных не наблюдалось изменения Са 2+ в течение 30 мин). См дополнительный фильм 2 (общее время 30 мин). Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Co-визуализация актин и Са 2+ при ЕАктивация в GG серии дрозофилы. Время экс естественных условиях зрелых Drosophila яйца , выражающую UASt- myrGCaMP5 (Cyan) и UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) после добавления буфера активации (AH). Са 2+ волна инициирует от заднего полюса и восстанавливается как показано на рисунке 1. Актина , похоже, меняется с течением времени, белые наконечники стрел (А против Н). Отсутствие Ca 2+ детектирования сигнала в центре зрелого яйца из - за перемещения образца во время захвата изображения. Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарны Лаура Bampton, Алекс Дэвидсон, Ричард Партон, Арита Ачарья за помощь при подготовке этой рукописи; Мариана Wolfner для обсуждения активации яйца; Мэтт Wayland для поддержки формирования изображения; и Nan Ху для общей поддержки в лаборатории.

Эта работа была поддержана Кембриджского университета, ISSF в ТТЦ [грант номер 097814].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dry active yeast Fleischman’s #2192
Dissecting microscope Leica MZ6 Various will work
Lamp Mircotec Fibre optic MF0-90 Various will work
Medical wipes Kimberly-Clark Corporation KLEW3020 
Marker pen Stabilo 841/46 OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm
CO2 pad  Genesee Scientific 59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T 
Halocarbon oil, series 95 Halocarbon Products Corp. Distributor in Europe:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S VWR Chemicals 24627.188 Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps Fine Science Tools 11252-00 Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe Fine Science Tools 10140-01
Glass pipette Fisherbrand, FB50251 Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length 
Vial Regina Industries P1014 GPPS  80 mm x 25 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
  2. Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
  3. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
  4. Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
  5. Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
  6. Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
  7. Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).
  8. Douglass, A. New Techniques in Systems Neuroscience. , Springer. (2015).
  9. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  10. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  11. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  12. Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
  13. Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
  14. York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
  15. Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
  16. Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
  17. Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
  18. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
  19. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  20. Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
  21. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  22. Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
  23. Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).
  24. Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).

Tags

Биология развития выпуск 114 активация яйца Са Ca GCaMP буфер активации,
Визуализации кальция в<em&gt; Drosophila</em&gt; При активации Egg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Derrick, C. J., York-Andersen, A.… More

Derrick, C. J., York-Andersen, A. H., Weil, T. T. Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation. J. Vis. Exp. (114), e54311, doi:10.3791/54311 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter