Imaging Calcium i Published: August 6, 2016 doi: 10.3791/54311

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher J. Derrick*¹, Anna H. York-Andersen*¹, Timothy T. Weil¹

¹Department of Zoology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel beskriver en fleksibel ex vivo protokol for visualisering Ca2 ⁺ under æg aktivering i Drosophila.

Introduction

En ændring i intracellulær Ca2 ⁺ -koncentration på æg (oocyt) aktivering er et konserveret komponent i alle undersøgte organismer ^1,2. Denne begivenhed indleder en bred vifte af Ca2 ⁺ -afhængige processer, herunder genoptagelse af cellecyklussen og oversættelse af lagrede mRNA'er. På grund af dette krav for Ca ^2+, visualisere de forbigående ændringer i intracellulære Ca ^{2 +} koncentrationer har været af afgørende interesse.

Historisk set blev modelorganismer udvalgt til undersøgelser af æg aktivering baseret på størrelsen og tilgængeligheden af ​​deres æg. Forskellige visualisering fremgangsmåder er blevet anvendt til at følge og kvantificere ændringer i intracellulær Ca2 ⁺ koncentrationer i disse systemer, herunder: fotoproteinet aequorin i Medaka fisk ^3; Ca ^{2 +} følsomme fluorescerende farvestoffer såsom Fura-2 i søpindsvin og hamster ^4,5; og calcium grøn-1-dextran i Xenopus ^6.

Frembringelsen og forbedring af genetisk kodede calcium indikatorer (GECIs) har forvandlet den evne til at visualisere Ca ²⁺ dynamik in vivo ^7. Disse genetiske konstruktioner er udtrykt i specifikke væv og begrænse behovet for invasive vævspræparater ^8.

GCaMPs er et grønt fluorescerende protein (GFP) -baseret klasse af GECIs som har været meget effektive på grund af deres høje Ca2 ⁺ affinitet, at signal-til-støj-forhold og kapacitet tilpasses ^9-11. I nærvær af Ca2 ^+, den GCaMP kompleks undergår en række konformationsændringer, startende med bindingen af Ca2 ⁺ til calmodulin, der resulterer i en forøget fluorescensintensitet af GFP-komponenten ^9.

GCaMPs har været flittigt brugt i forskning i Drosophila neuroner til at visualisere ændringer i intracellulær Calcium ^12. De seneste applicatipå af GCaMP teknologi til at visualisere Ca2 ⁺ i modne Drosophila æg har afsløret en enkelt transient Ca2 ⁺ bølge på æg aktivering ^13,14. Ca2 ⁺ bølge kan visualiseres ved lav forstørrelse under ægløsning in vivo ¹³ eller ved højere forstørrelse under anvendelse af en ex vivo-aktivering assay ^13,14. I ex vivo-assay, der individuelle modne oocytter isoleret fra ovarierne og aktiveres med en hypotonisk opløsning, benævnt aktivering buffer, som er blevet vist at rekapitulere begivenhederne i in vivo-aktivering ^15-17.

Denne ex vivo-assay muliggør nem høj opløsning visualisering af Ca2 ⁺ bølge under forskellige eksperimentelle betingelser, herunder farmakologisk forstyrrelser, fysiske manipulationer og genetiske mutanter. Denne artikel viser fremstillingen af modne Drosophila æg til ex vivo aktivering og the efterfølgende mikroskopi bruges til at visualisere Ca2 ⁺ bølge hjælp GCaMP. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at teste initiering og kontrol af Ca2 ⁺ bølge og til at probe downstream resultater.

Protocol

Bemærk: Foretag alle trin ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

1. Forberedelse til Dissection

Bemærk: De beskrevne trin er i overensstemmelse med E. Gavis, Princeton University & Weil et. al. ^18. Udfør følgende trin to dage før billeddannelse.

1. Tag en flue hætteglas indeholdende ca. 10 ml fast føde og tilføje en lille mængde af tørret gær til det ene hjørne, mindre end 1 g er tilstrækkelig.
   Bemærk: Oplysninger om flyve hætteglas eller mad se 'Drosophila Vedligeholdelse ^«19.
2. Tilsæt 1 - 3 dråber vand til hydratisering af gær.
3. Sæt hætteglasset til side i en 45 ° vinkel og tillade 3 - 5 min i gær til at optage vand.
4. Mens gæren absorbere vandet, skal du vælge en flaske fluer, der udtrykker UASt- myr GCaMP5 ²⁰ drevet af kar-VP16GAL4 (benævnt GCaMP5), der for nylig opstået (en myristoynes form GCaMP5 blev valgt for at tilvejebringe et højt signal-støjforhold gennem tøjring af GECI til membranen i ægget).
5. Bedøve fluerne i flasken med _CO2-gas. Sørg for at holde flasken omvendt for ikke at miste fluer i vådfoder.
6. Tip bedøvede fluer på en CO ₂ pad og sortering 10 - 15 hunner og 5 hanner bruger pensel under et dissektionsmikroskop. Bemærk: Det er standard at omfatte mænd til at give raske kvinder til dissektion.
7. Når hætteglasset fra trin 1.3 er klar tilføje specifikke fluer til hætteglasset. Vær omhyggelig med at holde hætteglasset vandret indtil fluerne bliver aktive.
8. Placer hætteglasset ved 25 ° C i cirka 36 timer.
9. Retur de resterende fluer fra CO ₂ pad til flasken eller discard.

2. Dissecting Drosophila ovarier

Bemærk: De beskrevne trin er i overensstemmelse med Weil et. al.

1. Efter 36 timer, bedøve fluerne fra yeasted hætteglas med CO _2.
2. Når fluer inde i hætteglasset bedøves tip dem på CO ₂ puden skal sorteres med en pensel under et dissektionsmikroskop.
3. Vælg en kvinde.
4. Isoler de to æggestokke fra den kvindelige. For fuld detaljeret protokol se Weil et. al. ^18. Sammenfattende:
   1. Placer en lille dråbe iltet halogencarbon olie (serie 95) på en nr 1,5, 22 x 40 mm dækglas.
   2. Tag fat i kvinder med pincet ved den forreste af maven.
   3. Hold kvindelige under dissektionsmikroskop, bruge det andet sæt af pincet til forsigtigt at fjerne den bageste af den kvindelige.
   4. Tør den bageste væv fra den anden pincet.
   5. Klem på maven hulrum med det andet pincet fra den forreste til den bageste af maven. De to uigennemsigtige æggestokke bør holde sig til tangen, når uden for FEMAle.
   6. Berør æggestokkene i olien.
   7. Fjerne eventuelle væv fra tangen ved aftørring tangen.
   8. Gentag disse trin (2.4.1 - 2.4.7) for at opnå tre dækglas, hver indeholdende æggestokke fra en flue.

3. Isolering Individuel modne æg

1. Under en standard dissektionsmikroskop med forstørrelsen indstillet til 4X, på den første dækglas fra trin 2.4, adskille de to æggestokke ved at rive æggelederen.
2. Indføre et par lukkede pincet ind i midten af ​​en enkelt æggestok, pas på ikke at punktere eventuelle æg kamre.
3. Indsæt en standard dissekere sonde ind i midten af ​​ovariet ud for de lukkede pincet.
4. Træk forsigtigt dissekere sonde gennem æggestok mod bageste pol, hvor de modne æg (fase 14 æg kamre) er placeret.
5. Gentag trin 3.1 - 3.4 2. - 5. gange afhængigt af størrelsen af ​​ovariet og antallet af æg.
   Bemærk: Tilsætning af CO ₂ Bemærk: modne æg sandsynligvis let at adskille fra æggestokkene bindevæv.
6. Hvis der ikke modne æg er synlige uden i æggestokkene, fortsætte forsigtigt drille med dissekere sonden.
7. Når de modne æg er synlige på dækglasset uden i æggestokkene, manøvrere 3 - 5 i en linje i midten af ​​dækglasset.
   Bemærk: For det bedste resultat, køre sonden forsigtigt langs siden af ​​æggene.
   Bemærk: Undgå at trække i dorsale vedhæng, da dette kan beskadige ægget.
   Bemærk: Afhængigt af den fremtidige imaging opsætning, justere æggene ca. 200 um fra hinanden vinkelret på dækglasset for maksimal imaging område.
8. Når den er sidestillet, fjerne resten af ​​ovarievævet ved at trække den væk fra de flugtende æg ved hjælp af forceps.
9. Fjern overskydende olie ved duppe med hjørnet af en medicinsk serviet. Pas på ikke at røre ved de modne æg med den medicinske tørre så modne æg, der er kontaktet, vil blive tabt.
10. Tegn et trådkors på dækglasset med en markør for at forenkle placere prøven under mikroskop.
11. Sæt dækglasset på et sikkert sted og lad den forberedte æg kamre på dækglasset for at hvile i 5 - 10 min. Dette giver mulighed for ægget at bosætte sig i olien. Prøverne kan anvendes op til 1 time efter dissektion.
12. Gentag trin 3.1 - 3.11 for resten af ​​dækglassene med æggestokke på dem.

4. Forberedelse til Imaging

1. Bring forberedt aktivering buffer ¹⁵ til stuetemperatur.
   Bemærk: Aktivering buffer er en hypotonisk puffer: 3,3 mM NaH _{2 PO4,} 16,6 mM KH ₂ PO _4, 10 mM NaCl, 50 mM KCI, 5% polyethylenglycol 8.000, 2 mM _CaCl2, bragt til pH 6,4 med en 1: 5-forhold af NaOH: KOH.For mere information se Mahowald, 1983 ^15. Prøver af aktivering buffer kan opbevares ved -20 ° C i flere måneder, og ved 4 ° C i op til 2 uger.
2. transportere omhyggeligt tilberedte dækglas, aktivering buffer og glas pipetter til imaging facilitet.
   Bemærk: Der kan anvendes en bred-felt, konfokal, spinning disc eller lys ark mikroskop. Vi anbefaler at bruge et omvendt mikroskop. Vores repræsentative resultater blev opnået under anvendelse af et konfokalt mikroskop.
3. En objektiv egnet til afbildning af hele det modne æg bør vælges (her: 20X 0.7 NA).
4. Monter første rede dækglas på objektbordet. Pas på ikke at bryde dækglas på scenen.
5. Kvalitativt vælge et synsfelt med et modent æg kammer til aktivering. Må ikke billede punkteret æg kamre eller dem med blæredannelse i membranen.
   Bemærk: For trin 4.6 - 4.7, softwarekommandoer vil variere afhængigt af mikroskop og producent.
6. Set imaging parameter for standard GFP excitation (488 nm) og emission (500-580 nm). Også oprette en lys-felt view for at visualisere og orientere modent æg og fordrevne olie.
7. Vælg den laveste Z-plan, hvor modne æg er synlige og sætte en fuld Z-stack, der skal tages for 40 pm på ca. 2 um per trin. Indstil parametrene så der er ingen forsinkelse mellem Z-stack erhvervelse. Indstil tiden serien til at fange i ca. 30 min.

5. Imaging Ex Vivo Egg Aktivering

1. Start billedoptagelse.
2. Vent 1 - 2 fulde Z-stakke, der skal erhverves. Dette viser den modne æg før aktivering.
3. Trække ca. 300 pi aktivering puffer i et glas pipette.
4. Placering af spidsen af ​​glaspipette indeholdende aktivering puffer ved en 45 ° vinkel over dækglasset, langsomt bevæge pipetten ind i strålegangen, indtil det er direkte over modent æg, der afbildes. Den glaspipette børvære 1 - 2 cm over olien.
5. Tilsæt 1 - 2 dråber aktivering buffer på mindre end 5 sekunder fra glaspipette. Dette skulle fortrænge olien. Undgå at tilføje overskydende aktivering buffer eller røre ægget med glaspipette da det kan forårsage forskydning af modent æg. Pas på ikke at røre ved dækglasset med pipetten, da dette kan medføre en ændring i fokusplanet eller at der dannes luftbobler i fordybelse olie mellem målet og dækglasset.
6. Mens tilføje aktivering buffer under erhvervelse billede, tjek den lyse-feltet kanal for at sikre, at olien er blevet fordrevet af aktivering buffer.
   Bemærk: Dette vil først blive vist som en skygge på grund af pipetten bryde strålen vej, men vil også resultere i fremkomsten af ​​små oliedråber. Nogle små oliedråber kan forblive forbundet med det modne æg, som vil påvirke eksperimentelle resultater og billedkvalitet.
7. Hvis olien ikke forskydes fra den indledende tilsætning af aktivering buffer gentage trin 5,4-50,6.
8. Når olien er med succes forskudt, give tidsserier til at køre indtil afslutning.
   Bemærk: På grund hævelse af oocytter ved aktivering, vil nogle æg kamre flytte dramatisk ud af fokusplanet eller synsfelt efter tilsætning af aktivering buffer. I denne situation, stoppe købet og monter næste dækglas.
9. Når billedet sekvens har afsluttet købet, gemme data.

6. Post-erhvervelse billedbehandling

1. Åbn datasættet hjælp Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), eller tilsvarende billedbehandling software, og vælg de relevante filer til analyse.
2. At opbygge en fremskrivning af de indsamlede data vælge: Image> Stakke> Z-projekt.
3. Vælg en start Z-skive og et stop Z-skive, typisk hele afsnittet. Vælg en projektion type, typisk indstillet til 'Max Intensitet «. Kontroller afkrydsningsfeltet 'All Time Frames' for at anvende de valgte indstillinger til hele serien.
4. Hvismere end én fluorescerende kanal er blevet afbildet, bruge Kanaler værktøj til at muliggøre bevægelse mellem farver, lave en sammensat, eller gøre billedet gråtoner. Vælg Image> Farver> Kanaler værktøj.
5. For at justere billedets lysstyrke og kontrast vælge Billede> Juster> Lysstyrke / Kontrast.
6. For at eksportere et enkelt billede, flytte tidsskala skyderen til relevant ramme og vælge Filer> Gem som> Jpeg, eller enhver foretrukne format.
7. Vælg en placering og titel til den eksporterede fil, og gem derefter.
   Bemærk Rammen sats fra imaging software vil blive forpligtet til at give et tidsstempel på billedet.
8. For at eksportere tidsserier som en film vælge: Filer> Gem som> AVI, vælg derefter billedhastighed (~ 7 billeder i sekundet).
9. Vælg en placering og titel til den eksporterede fil, og gem derefter.
10. Hvis du vil gemme det justerede filen i Fiji-format, skal du vælge Filer> Gem.

Representative Results

Her har vi vist, hvordan man forbereder modne Drosophila æg til ex vivo aktivering. Æg, der udtrykker en GECI muliggøre billeddannelse af Ca ^{2 +} dynamikker på æg aktivering og begyndelsen af fosterudviklingen (figur 1). Det skal bemærkes, at afhængigt af GCaMP anvendt, specielt tilstedeværelsen af en myristoyl gruppe, kan resultaterne have lette kvalitative forskelle ^{13 14.} Vi har også påvist en rolle for funktionel actin during egg aktivering ved tilsætning af en inhibitor af actinpolymerisation, cytochalasin D, til aktivering buffer (figur 2) ^14.

Et krav om cytoskelettet på ægget aktivering er bevaret. I C. elegans efter befrugtningen, er cytoskeletale komponenter omorganiseret til at forberede en celle embryon for første asymmetriske division ^21,22. I søpindsvin, afbrydelse af cytoskeletal omorganisering efter aktivering har vist sig at påvirke cellecyklussen ved at forhindre kontraktile ringdannelse ^23. Stadig at blive fuldstændigt belyst rollen af actin ved mediering en Ca2 ⁺ bølge og dens nedstrøms funktion på æg aktivering i Drosophila.

I Drosophila, kan co-visualisering af Ca2 ⁺ bølge og aktincytoskelettet opnås ved anvendelse af denne ex vivo-aktivering assay. Tidsserier af flere kanaler kan erhverves og dynamik den intracellulære Ca2 ⁺ kan matches med ændringer i actin organisation i oocyt (figur 3).

Figur 1:. A Single Ca ²⁺ Wave på Drosophila Egg Aktivering Tidsserier af ex vivo modne Drosophila æg udtrykker UASt- myrGCaMP5 efter enddition af aktivering puffer (AH). Stigningen i cytoplasmatiske Ca2 ⁺ stammer ved den bageste pol (B) og udbreder (BF) med en gennemsnitlig hastighed på ca. 1,5 um / sek. Indledning af bølgen typisk observeres indenfor 3 minutter efter tilsætning af aktivering buffer. Efter aktivering, de intracellulære calciumniveauer i det modne æg vender tilbage til præ-aktiveringsniveauer (G, H). Se supplerende film 1 (total tid 33 min). Scale barer = 50 um. Max projektion = 40 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Tilsætning af Cytochalasin D til Activation Buffer forstyrrer Ca²⁺ Wave Formering. Tidsserier af ex vivo modne Drosophila æg udtrykker UASt- myrGCaMP5 efter tilsætning af aktivering buffer indeholdende 10 ug / ml cytochalasin D endelig koncentration (AH). Medens Ca2 ⁺ bølge initieres ved den bageste pol (A), er det kompromitteret og ikke når den forreste af ægget (F) (hvide pilespidser angiver forsiden af bølgen). Ingen yderligere Ca2 ⁺ ændringer blev observeret i løbet af 30 min). Se supplerende film 2 (total tid 30 min). Scale barer = 50 um. Max projektion = 40 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Co-visualisering af actin og Ca2 ⁺ ved Egg Aktivering i Drosophila. Tidsserier af ex vivo modne Drosophila æg udtrykker UASt- myrGCaMP5 (cyan) og UASp -F-Tractin.tdTomato (Magenta) efter tilsætning af aktivering buffer (AH). Ca2 ⁺ bølge initierer fra den bageste pol og gendanner som i figur 1. Actin synes at have ændret sig med tiden, hvide pilespidser (A vs H). Manglen på Ca2 ⁺ signal detektion i centrum af det modne æg skyldes bevægelse af prøven under billedoptagelse. Scale barer = 50 um. Max projektion = 40 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192
Dissecting microscope	Leica	MZ6	Various will work
Lamp	Mircotec Fibre optic	MF0-90	Various will work
Medical wipes	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Marker pen	Stabilo	841/46	OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Halocarbon oil, series 95	Halocarbon Products Corp.	Distributor in Europe:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Glass pipette	Fisherbrand,	FB50251	Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length
Vial	Regina Industries	P1014	GPPS  80 mm x 25 mm