Beeldvorming Calcium in Published: August 6, 2016 doi: 10.3791/54311

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher J. Derrick*¹, Anna H. York-Andersen*¹, Timothy T. Weil¹

¹Department of Zoology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca ²⁺ tijdens ei activering in Drosophila.

Introduction

Een verandering van de intracellulaire Ca2 ⁺ concentratie ei (eicel) activering is een geconserveerd deel van alle onderzochte organismen ^1,2. Deze gebeurtenis start uiteenlopende Ca2 ⁺ -afhankelijke processen, waaronder de hervatting van de celcyclus en translatie van mRNAs opgeslagen. Door deze eis voor Ca2 ⁺ visualiseert de voorbijgaande veranderingen in de intracellulaire Ca2 ⁺ concentratie is van essentieel belang.

Historisch gezien werden modelorganismen geselecteerd studies over eieren activatie gebaseerd op de grootte en de beschikbaarheid van eieren. Verschillende visualisatie benaderingen zijn gebruikt om veranderingen te volgen en kwantificeren intracellulaire Ca2 ⁺ concentraties in deze systemen, inclusief: het fotoproteïne aequorine in medaka vis ^3; Ca ²⁺ gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals Fura-2 in zee-egels en hamster ^4,5; en calcium groen-1-dextran in Xenopus ^6.

Het genereren en verbetering van genetisch gecodeerd calcium indicatoren (Geçiş) heeft de mogelijkheid om te visualiseren Ca ²⁺ dynamiek in vivo ⁷ omgezet. Deze genetische constructen uitgedrukt in specifieke weefsels en beperken de noodzaak voor invasieve weefselpreparaten ^8.

GCaMPs een groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde klasse Geçiş die zeer effectief zijn vanwege hun hoge Ca2 ⁺ affiniteit, signaal-ruisverhouding en capaciteit worden aangepast ^9-11. In de aanwezigheid van Ca2 ^+, de GCaMP complex ondergaat een reeks conformationele veranderingen, te beginnen met de binding van Ca2 ⁺ aan calmoduline, wat leidt tot een toegenomen fluorescentie-intensiteit van het GFP component ^9.

GCaMPs zijn uitgebreid gebruikt in onderzoek Drosophila neuronen veranderingen in intracellulaire calcium ¹² visualiseren. De recente applicatiop van GCaMP technologie om Ca ²⁺ te visualiseren in de volwassen Drosophila eieren is gebleken dat één van voorbijgaande aard Ca ²⁺ golf bij ei activering ^13,14. De Ca ²⁺ golf kan worden gevisualiseerd op lage vergroting tijdens de ovulatie in vivo ¹³ of bij een hogere vergroting met behulp van een ex vivo activering assay ^13,14. In de ex vivo analyse worden afzonderlijke rijpe oöcyten geïsoleerd van de eierstokken en geactiveerd door een hypotone oplossing, genoemd activeringsbuffer, waarvan is aangetoond dat de gebeurtenissen van in vivo activering ^15-17 recapituleren.

Deze ex vivo test maakt een eenvoudige hoge resolutie visualisatie van de Ca ²⁺ golf onder verschillende experimentele condities waaronder farmacologische verstoring, fysieke manipulaties en genetische mutanten. In dit artikel wordt de voorbereiding van de volwassen Drosophila eieren voor ex vivo activering en the daaropvolgende microscopie gebruikt om de Ca ²⁺ wave met behulp van GCaMP visualiseren. Deze benadering kan worden gebruikt voor de initiatie en controle van de Ca2 ⁺ golf testen en resultaten downstream probe.

Protocol

Opmerking: Voer alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.

1. Voorbereidingen voor Dissection

Opmerking: De hier beschreven stappen zijn in overeenstemming met E. Gavis, Princeton University & Weil et. al. ^18. Voer de volgende stappen twee dagen voor de beeldvorming.

1. Neem een ​​vlieg flacon ongeveer 10 ml vast voedsel en voeg een kleine hoeveelheid gedroogde gist een hoek, minder dan 1 g volstaat.
   Opmerking: Voor informatie over fly flesjes of voedsel zie 'Drosophila Maintenance' ^19.
2. Voeg 1-3 druppels water de gist hydrateren.
3. Zet de flacon opzij in een hoek van 45 ° en laat 3-5 min voor de gist tot het nemen van het water.
4. Terwijl de gist wordt het water absorberen, selecteert u een fles vliegen uitdrukken UASt- myr GCaMP5 ²⁰ gedreven door bad-VP16GAL4 (aangeduid als GCaMP5) die onlangs zijn ontstaan ​​(een myristoyberekende vorm van de GCaMP5 werd gekozen om een ​​hoge signaal-ruisverhouding met aanbinden de GECI het membraan in het ei).
5. Verdoven de vliegen in de fles met CO ₂ gas. Zorg ervoor dat u de fles omgekeerd, zodat er geen vliegen te verliezen in het natvoer te houden.
6. Tip de verdoofd vliegen op een CO ₂ pad en sorteren 10 - 15 vrouwen en 5 mannen met behulp van een penseel onder een dissectie microscoop. Opmerking: Het is standaard om mannetjes aan gezonde vrouwen voor dissectie bevatten.
7. Wanneer de flacon uit stap 1.3 is klaar, voeg de geselecteerde vliegen aan de flacon. Zorg ervoor dat de flacon horizontaal te houden totdat de vliegen actief worden.
8. Plaats het flesje bij 25 ° C gedurende ongeveer 36 uur.
9. De terugkeer van de resterende vliegt van de CO ₂ pad naar de fles of discard.

2. Ontleden Drosophila Eierstokken

Opmerking: De hier beschreven stappen zijn overeenkomstig Weil et. al.

1. Na 36 uur, verdoven de vliegen uit de gegiste flacon met CO _2.
2. Zodra de vliegen in de flacon worden verdoofd tip hen op de CO ₂ pad worden opgelost met een kwast onder een dissectie microscoop.
3. Selecteer een vrouw.
4. Isoleer beide eierstokken van de vrouw. Voor de volledige gedetailleerd protocol zie Weil et. al. ^18. Samengevat:
   1. Plaats een kleine daling van zuurstofrijk halogene olie (serie 95) op een No. 1.5, 22 x 40 mm dekglaasje.
   2. Pak de vrouw met tang op de voorste van de buik.
   3. Het houden van de vrouwelijke onder de microscoop ontleden, gebruik maken van de tweede set van een tang om voorzichtig verwijderen van de achterkant van het vrouwtje.
   4. Veeg het achterste weefsel van de tweede tang.
   5. Knijp de buikholte tweede tang uit de voorste naar het achterste van de buik. De twee ondoorzichtige eierstokken moet vasthouden aan de tang als buitenkant van de female.
   6. Raak de eierstokken in de olie.
   7. Verwijder eventuele weefsel uit de tang door afvegen de tang.
   8. Herhaal deze stappen (2.4.1 - 2.4.7) tot drie dekglaasjes te verkrijgen, die elk eierstokken van een vlieg.

3. Isoleren Individuele rijpe eicellen

1. Onder een standaard dissectie microscoop met het ingesteld op 4X, op de eerste dekglaasje van stap 2,4 vergroting, scheiden de twee eierstokken door het scheuren van de eileider.
2. Invoering van een paar gesloten pincet in het midden van een eierstok, verzorgen elk ei kamers niet doorboren.
3. Plaats een standaard dissectie sonde in het midden van het ovarium naast de gesloten tang.
4. Voorzichtig sleept u de ontleden sonde door de eierstok naar de achterste paal, waar de rijpe eicellen (fase 14 ei kamers) bevinden zich.
5. Herhaal stap 3,1-3,4 2-5 keer afhankelijk van de grootte van het ovarium en het aantal eieren.
   Opmerking: Toevoeging van CO ₂ Opmerking: De rijpe eieren zijn waarschijnlijk gemakkelijk te scheiden van de eierstokken bindweefsel.
6. Als er geen rijpe eicellen zijn zichtbaar buiten de eierstok, blijven voorzichtig plagen met het ontleden sonde.
7. Zodra de rijpe eicellen zijn zichtbaar op het dekglaasje buitenkant van de eierstok, manoeuvreren 3-5 in een lijn in het midden van het dekglaasje.
   Opmerking: Voor de beste resultaten voert u de sonde voorzichtig langs de zijkant van de eieren.
   Opmerking: Vermijd het trekken aan de dorsale aanhangsels, omdat dit het ei kan beschadigen.
   Opmerking: Afhankelijk van de toekomst beeldvorming set-up, uitlijnen de eieren ongeveer 200 urn van elkaar loodrecht op het dekglaasje voor maximale beeldgebied.
8. Eenmaal uitgelijnd, verwijder de rest van het eierstokweefsel door het weg te slepen uit de uitgelijnde eieren behulp van de forceps.
9. Verwijder overtollige olie door deppen met de hoek van een medische vegen. Zorg ervoor dat u de rijpe eicellen te raken met de medische veegt als rijpe eicellen die worden benaderd zullen verloren gaan.
10. Teken een draadkruis op het dekglaasje met een marker te vereenvoudigen lokaliseren van het monster onder de microscoop.
11. Stel de dekglaasje op een veilige plaats en laat de voorbereide ei kamers op het dekglaasje te rusten voor 5-10 min. Dit maakt het mogelijk eieren te vestigen in de olie. Monsters kunnen gebruikt worden tot 1 uur na dissectie.
12. Herhaal stap 3,1-3,11 de rest van de dekglaasjes met eierstokken erop.

4. Voorbereiding van Imaging

1. Breng bereid activeringsbuffer ¹⁵ tot kamertemperatuur.
   Opmerking: activering buffer is een hypotonische buffer: 3,3 mM NaH _{2PO 4,} 16,6 mM KH _{2PO 4,} 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% polyethyleenglycol 8000, 2 mM _CaCl2, pH 6,4 gebracht met 1: 5 verhouding van NaOH: KOH.Voor meer informatie zie Mahowald, 1983 ^15. Porties activeringsbuffer kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maanden bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
2. vervoeren zorgvuldig voorbereide dekglaasjes, activering buffer en glazen pipetten voor de beeldvorming faciliteit.
   Opmerking: Een breed gebied confocale, draaiende schijf of plaat licht microscoop kan worden gebruikt. We raden het gebruik van een omgekeerde microscoop. De representatieve resultaten werden verkregen met een confocale microscoop.
3. Een objectieve geschikt voor beeldvorming van het gehele rijpe eicel moet (hier: 20X 0.7 NA) worden gekozen.
4. Monteer de eerste voorbereide dekglaasje op de microscoop podium. Zorg ervoor dat u de dekglaasjes op het podium te breken.
5. Kwalitatief selecteert u een gezichtsveld met een volwassen ei kamer voor activering. Niet image doorboord ei kamers of mensen met blebbing in het membraan.
   Opmerking: voor de stappen 4,6-4,7, softwareopdrachten is afhankelijk van microscoop en fabrikant.
6. Set imaging parameter voor standaard GFP excitatie (488 nm) en emissie (500-580 nm). Ook het opzetten van een bright-field oog in oog te visualiseren en te oriënteren de rijpe eicel en ontheemde olie.
7. Selecteer de laagste Z-vlak waarbinnen rijpe eicellen zijn toegankelijk en tot fullcolour Z-stack te worden genomen voor 40 urn ongeveer 2 micrometer per stap. Stel de parameters zodat er geen vertraging tussen Z-stack acquisitie. Stel de tijdreeks te leggen gedurende ongeveer 30 minuten.

5. Imaging Ex Vivo Egg Activation

1. Start beeld vast te leggen.
2. Wacht 1-2 full Z-stacks te verwerven. Dit toont de rijpe eicel voorafgaande aan activatie.
3. Trekken ongeveer 300 gl buffer activatie in een glazen pipet.
4. Positioneren van het uiteinde van de glazen pipet met activatie buffer bij een 45 ° hoek boven het dekglaasje, langzaam de pipet in de stralengang totdat deze direct boven de rijpe eicel wordt afgebeeld. De glazen pipet moetzijn 1-2 cm boven de olie.
5. Voeg 1-2 druppels activeringsbuffer in minder dan 5 seconden van de glazen pipet. Dit moet de olie vervangen. Vermijd het toevoegen overtollige activering buffer of het aanraken van het ei met de glazen pipet als het verplaatsen van de rijpe eicel kan veroorzaken. Zorg ervoor dat u het dekglaasje te raken met de pipet, omdat dit een verandering in de focal plane of luchtbellen kunnen veroorzaken te vormen in de immersie olie tussen de objectieve en dekglaasje.
6. Terwijl het toevoegen van activering buffer tijdens beeldacquisitie, controleer dan de bright-field kanaal om ervoor te zorgen dat de olie is verdrongen door de activering buffer.
   Opmerking: Deze verschijnt eerst als een schaduw door het breken van de pipet stralengang maar zal ook leiden tot het verschijnen van kleine oliedruppeltjes. Sommige oliedruppeltjes kan geassocieerd blijven met de rijpe eicel die experimentele resultaten en de beeldkwaliteit zal beïnvloeden.
7. Als de olie niet wordt verplaatst van de eerste toevoeging van activering buffer herhaalt u stap 5,4-50,6.
8. Zodra de olie met succes wordt verplaatst, zodat de tijdreeksen te lopen tot aan de voltooiing.
   Let op: Als gevolg van zwelling van eicellen bij activering, sommige ei kamers zal drastisch uit de focal plane of gezichtsveld verplaatsen na toevoeging van de activering buffer. In deze situatie, stopt de verwerving en monteer de volgende dekglaasje.
9. Na de reeks afbeeldingen overname heeft afgerond, opslaan van gegevens.

6. Post-acquisitie Image Processing

1. Open de dataset met behulp van Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), of gelijkwaardige software voor beeldverwerking, en selecteer de relevante bestanden voor analyse.
2. Om een ​​projectie van de verkregen gegevens te bouwen selecteren: Afbeelding> Stacks> Z-project.
3. Selecteer een start Z-slice en een stop Z-slice, meestal de hele sectie. Selecteer een projectie type doorgaans ingesteld op 'Max Intensity'. Controleer hokje 'All Time Frames' om de gekozen instellingen toe te passen op de hele reeks.
4. Alsmeer dan een TL-kanaal is afgebeeld, gebruik maken van de Kanalen tool om beweging tussen kleuren maken, maak een composiet, of maak de afbeelding grijstinten. Selecteer Afbeelding> Kleuren> Kanalen tool.
5. Om de helderheid van het beeld aan te passen en het contrast te selecteren Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast.
6. Om een ​​enkel beeld te exporteren, verplaatsen tijdschaal schuifregelaar naar relevante frame en selecteer Bestand> Opslaan als> Jpeg, of iedere gewenste formaat.
7. Kies een locatie en naam voor het geëxporteerde bestand en vervolgens op te slaan.
   Opmerking Het frame rate van de imaging software vereist zal zijn om een ​​tijdstempel op het beeld te geven.
8. Exporteren de tijdreeks als een film te selecteren: Bestand> Opslaan als> AVI, selecteer frame rate (~ 7 frames per seconde).
9. Kies een locatie en naam voor het geëxporteerde bestand en vervolgens op te slaan.
10. Om de aangepaste bestand in Fiji formaat op te slaan, selecteert u Bestand> Opslaan.

Representative Results

Hier hebben we aangetoond hoe volwassen Drosophila eieren voor te bereiden op ex vivo activering. Eieren expressie een GECI mogelijk imaging Ca2 ⁺ dynamiek ei activering en het begin van de embryonale ontwikkeling (figuur 1). Opgemerkt wordt dat afhankelijk van de GCaMP gebruikt, met name de aanwezigheid van een myristoyl groep, kunnen de resultaten kleine kwaliteitsverschillen ^{13 14} hebben. Wij hebben ook een rol voor functionele actine tijdens de eieren activatie aangetoond door toevoeging van een remmer van actine polymerisatie, cytochalasine D, tot de activering buffer (figuur 2) ^14.

Een vereiste voor het cytoskelet bij ei activering wordt geconserveerd. In C. elegans, na de bevruchting, het cytoskelet componenten worden gereorganiseerd om de een-cel embryo voor te bereiden op de eerste asymmetrische divisie ^21,22. In de zee-egel, verstoring van cytoskeletal reorganisatie na activering is aangetoond dat de celcyclus te beïnvloeden door het voorkomen contractiele ringvorming ^23. De rol van actine in het bemiddelen van een Ca ²⁺ wave en de downstream-functie op ei activering in Drosophila nog niet volledig opgehelderd.

In Drosophila, kan co-visualisatie van de Ca2 ⁺ golf en actine cytoskelet worden bereikt met deze ex vivo activatie assay. Tijdreeksen van meerdere kanalen kan worden verkregen en dynamiek van de intracellulaire Ca2 ⁺ kan worden gekoppeld aan veranderingen in actine organisatie in de eicel (figuur 3).

Figuur 1:. A Single Ca ²⁺ golf bij Drosophila Egg Activering Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 na eenddition van de activering buffer (AH). De stijging van cytoplasmatische Ca2 ⁺ beginnend op het achterpool (B) en voortplant (BF) met een gemiddelde snelheid van ongeveer 1,5 um / sec. Initiatie van de golf wordt meestal waargenomen binnen 3 minuten van de toevoeging van activeringsbuffer. Na activering, het intracellulaire calciumgehalte van de rijpe eicel terug naar pre-activatie niveau (G, H). Zie aanvullende film 1 (totale tijd 33 min). Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Toevoeging van cytochalasine D op Activation Buffer verstoort Ca²⁺ golfvoortplanting. Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 na toevoeging van activering buffer die 10 ug / ml cytochalasine D uiteindelijke concentratie (AH). Terwijl de Ca2 ⁺ golf wordt ingeleid op achterpool (A) wordt aangetast en niet het voorste van het ei (F) te bereiken (witte pijlen duiden de voorkant van de golf). Geen verdere Ca2 ⁺ veranderingen werden waargenomen gedurende 30 min). Zie aanvullende film 2 (totale tijd 30 min). Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Co-visualisatie van Actin en Ca2 ⁺ bij Egg activering in Drosophila. Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 (cyaan) en UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) na toevoeging van activering buffer (AH). De Ca ²⁺ golf initieert uit de achterste paal en herstelt als in figuur 1. Actine lijkt te veranderen in de tijd, witte pijlpunten (A vs H). Het ontbreken van Ca2 ⁺ signaaldetectie in het midden van het rijpe eicel wordt veroorzaakt door beweging van het monster gedurende beeldopname. Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192
Dissecting microscope	Leica	MZ6	Various will work
Lamp	Mircotec Fibre optic	MF0-90	Various will work
Medical wipes	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Marker pen	Stabilo	841/46	OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Halocarbon oil, series 95	Halocarbon Products Corp.	Distributor in Europe:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Glass pipette	Fisherbrand,	FB50251	Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length
Vial	Regina Industries	P1014	GPPS  80 mm x 25 mm