Summary
Cet article décrit un protocole ex vivo adaptable pour la visualisation de Ca 2+ lors de l' activation de l' œuf chez la drosophile.
Introduction
Un changement de Ca 2+ intracellulaire concentration à ovule (ovocyte) activation est un élément conservé de tous les organismes étudiés 1,2. Cet événement déclenche un large éventail de processus -dépendantes de Ca, y compris la reprise du cycle cellulaire et la traduction des ARNm stockées. En raison de cette exigence pour Ca 2+, de visualiser les changements transitoires de Ca2 + intracellulaire des concentrations a été d' un intérêt primordial.
Historiquement, les organismes modèles ont été choisis pour des études sur l'activation des oeufs en fonction de la taille et de la disponibilité de leurs oeufs. Diverses approches de visualisation ont été utilisées pour suivre et quantifier les changements intracellulaire de Ca2 + concentrations dans ces systèmes, y compris: la photoprotéine aequorine en medaka poissons 3; Ca 2+ colorants fluorescents sensibles tels que Fura-2 dans oursin et le hamster 4,5; et de calcium vert-1-dextran dans Xenopus 6.
La génération et l' amélioration des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) a transformé la capacité de visualiser Ca 2+ dynamique in vivo 7. Ces constructions génétiques sont exprimés dans des tissus spécifiques et de limiter le besoin de préparations tissulaires invasives 8.
GCaMPs sont une protéine fluorescente verte (GFP) classe à base de GECIS qui ont été très efficaces en raison de leur forte affinité Ca 2+, le rapport et la capacité signal-bruit pour être personnalisés 9-11. En présence de Ca 2+, le complexe GCaMP subit une série de changements conformationnels, en commençant par la liaison de Ca2 + à la calmoduline qui se traduit par une augmentation de l' intensité de fluorescence de la composante de GFP 9.
GCaMPs ont été largement utilisés dans la recherche sur les neurones de Drosophila pour visualiser les changements de calcium intracellulaire 12. Les applicati récentssur la technologie GCaMP pour visualiser Ca 2+ dans les œufs de Drosophila matures a révélé un seul transitoire Ca 2+ onde à l' activation de l' œuf 13,14. La vague Ca 2+ peut être visualisé à faible grossissement pendant l' ovulation in vivo 13 ou à un grossissement plus élevé en utilisant un essai ex vivo d'activation 13,14. Dans le dosage ex vivo, les ovocytes matures individuels sont isolés des ovaires et activés à l' aide d' une solution hypotonique, dénommé tampon d'activation, ce qui a été montré pour récapituler les événements d'activation in vivo 15-17.
Ce test ex vivo permet facilement de haute résolution visualisation de la Ca 2+ onde dans différentes conditions expérimentales , y compris la perturbation pharmacologique, les manipulations physiques et mutants génétiques. Cet article montre la préparation d'œufs de Drosophila matures pour ex vivo et activation ee microscopie ultérieure utilisée pour visualiser l'onde Ca 2+ en utilisant GCaMP. Cette approche peut être utilisée pour tester l'initiation et le contrôle de l'onde Ca 2+ et de sonder les résultats en aval.
Protocol
Remarque: Effectuer toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire.
1. Préparation de Dissection
Remarque: Les étapes décrites ici sont conformes à E. Gavis, Princeton University et Weil et. al. 18. Effectuez les étapes suivantes, deux jours avant l'imagerie.
- Prenez un flacon de mouche contenant environ 10 ml de nourriture solide et ajouter une petite quantité de levure sèche dans un coin, à moins de 1 g est suffisante.
Remarque: Pour des informations sur les flacons de mouches ou de la nourriture voir 'Drosophila Maintenance' 19. - Ajouter 1 - 3 gouttes d'eau pour hydrater la levure.
- Réglez le flacon de côté à un angle de 45 ° et laisser 3-5 min pour la levure de prendre l'eau.
- Bien que la levure absorbe l'eau, sélectionnez une bouteille de mouches exprimant UASt- myr GCaMP5 20 entraînée par un bain-VP16GAL4 (dénommé GCaMP5) qui ont récemment vu le jour (un myristoyforme lated du GCaMP5 a été choisi pour fournir un signal élevé par rapport au bruit par le biais d'attacher la GECI à la membrane dans l'œuf).
- Anesthésier les mouches dans la bouteille avec du gaz CO 2. Soyez sûr de garder la bouteille inversée afin de ne pas perdre de mouches dans la nourriture humide.
- Astuce vol anesthésiés sur un tampon de CO 2 et de trier 10 - 15 femelles et 5 mâles à l' aide d' un pinceau sous un microscope à dissection. Note: Il est standard pour inclure les hommes pour fournir des femelles en bonne santé pour la dissection.
- Lorsque le flacon de l'étape 1.3 est prêt, ajouter les mouches sélectionnées dans le flacon. Prenez soin de garder l'horizontale flacon jusqu'à ce que les mouches deviennent actifs.
- Placer le flacon à 25 ° C pendant environ 36 heures.
- Retour à vol restants du CO 2 pad à la bouteille ou défausse.
2. Dissecting Drosophila Ovaires
Note: Les étapes décrites ici sont conformes à Weil et al. Al. 3. Isolating individuel Oeufs d'âge mûr 4. Préparation de l'imagerie 5. Activation de l' imagerie ex vivo d' oeuf 6. Post-acquisition Traitement d'image
Note: L' addition de CO 2 Remarque: les oeufs matures sont susceptibles de se séparer facilement du tissu conjonctif de l'ovaire.
Note: Pour de meilleurs résultats, exécutez la sonde doucement le long du côté des œufs.
Remarque: Évitez de tirer sur les appendices dorsaux car cela peut endommager l'œuf.
Remarque: En fonction de l'imagerie future mise en place, aligner les oeufs environ 200 um à part perpendiculairement à la lamelle pour la zone maximale d'imagerie.
Note: Le tampon d'activation est un tampon hypotonique: 3,3 mM , NaH 2 PO 4, 16,6 mM de KH 2 PO 4, NaCl 10 mM, KCl 50 mM, 5% de polyéthylèneglycol 8000, CaCl2 2 mM, porté à pH 6,4 avec un mélange 1: 5 rapport de NaOH: KOH.Pour plus d' informations , voir Mahowald 1983 15. Aliquotes de tampon d'activation peut être stocké à -20 ° C pendant des mois et à 4 ° C pendant 2 semaines.
Note: Un grand champ, confocal, disque tournant ou d'une feuille microscope optique peuvent être utilisés. Nous vous recommandons d'utiliser un microscope inversé. Nos résultats représentatifs ont été obtenus en utilisant un microscope confocal.
Remarque: Pour les étapes 4.6 - 4.7, les commandes logicielles varient en fonction de microscope et le fabricant.
Note: Ceci apparaît d'abord comme une ombre due à la pipette briser la trajectoire du faisceau, mais se traduira également par l'apparition de petites gouttelettes d'huile. Quelques gouttes d'huile peuvent rester associé à l'ovule mature qui aura une incidence sur les résultats expérimentaux et la qualité de l'image.
Remarque: En raison de l'enflure des ovocytes à l'activation, certaines chambres d'œufs vont se déplacer de façon spectaculaire sur le plan ou le champ de vision central lors de l'addition de tampon d'activation. Dans cette situation, arrêtez l'acquisition et monter la prochaine lamelle.
Remarque Le taux à partir du logiciel d'imagerie de trame sera nécessaire pour donner un horodatage sur l'image.
Representative Results
Ici , nous avons démontré comment préparer des œufs de Drosophila matures ex vivo activation. Les œufs exprimant un GECI permettre l' imagerie de Ca2 + dynamique lors de l' activation de l' œuf et le début du développement de l' embryon (figure 1). Il convient de noter que , selon le GCaMP utilisé, en particulier la présence d'un groupe myristoyle, les résultats peuvent présenter de légères différences qualitatives 13 14. Nous avons également démontré un rôle pour l' actine fonctionnelle lors de l' activation de l' œuf par l'addition d'un inhibiteur de polymérisation de l' actine, la cytochalasine D, le tampon d'activation (figure 2) 14.
Une exigence pour le cytosquelette lors de l'activation de l'œuf est conservée. En C. elegans, après la fécondation, les composants du cytosquelette sont réorganisés pour préparer l'embryon d' une cellule pour la première division asymétrique 21,22. En oursin de mer, la perturbation des cytoskeletal réorganisation suite à l' activation a été montré pour affecter le cycle cellulaire en empêchant contractile formation de l' anneau 23. Le rôle de l' actine dans la médiation d' une vague Ca 2+ et sa fonction aval lors de l' activation de l' œuf chez la drosophile reste à élucider.
Chez la drosophile, la co-visualisation de l'onde et le cytosquelette d' actine Ca2 + peut être réalisé en utilisant ce dosage ex vivo d'activation. Les séries chronologiques de multiples canaux peut être acquis et la dynamique du Ca2 * intracellulaire peut être associé à des changements dans l' organisation de l' actine dans l'ovocyte (Figure 3).
Figure 1:. A Single Ca 2+ vagues à la série Drosophila Egg Activation Temps des ex vivo matures Drosophila exprimant oeuf UASt- myrGCaMP5 suivant l'uneddition de tampon d'activation (AH). L'augmentation du Ca 2+ cytoplasmique commençant au niveau du pôle postérieur (B) et se propage (BF) avec une vitesse moyenne d'environ 1,5 um / s. L'initiation de l'onde est typiquement observée dans les 3 minutes de l'addition d'un tampon d'activation. Après activation, les taux de calcium intracellulaire de l'ovule mature retourne à des niveaux (G, H) d'activation pré. Voir un film supplémentaire 1 (durée totale de 33 min). Barres d'échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Ajout de cytochalasine D Activation Buffer perturbe Ca2+ propagation des ondes. Série Temps d'ex vivo matures Drosophila exprimant oeuf UASt- myrGCaMP5 après addition de tampon d'activation contenant 10 pg / ml de cytochalasine D concentration finale (AH). Tandis que le Ca2 + onde est initiée au niveau du pôle postérieur (A), elle est compromise et ne parvient pas à la partie antérieure de l'œuf (F) (pointes de flèches blanches indiquent la face de la vague). Pas encore les changements de Ca ont été observés plus de 30 min). Voir un film supplémentaire 2 (durée totale de 30 min). Barres d'échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Co-visualisation de l' actine et de Ca 2+ à EActivation de gg en série Drosophila. Temps d'ex vivo matures Drosophila oeuf exprimant UASt- myrGCaMP5 (Cyan) et UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) après addition de tampon d'activation (AH). Le Ca 2+ vague amorce du pôle postérieur et récupère comme dans la figure 1. Actine semble changer au fil du temps, des pointes de flèches blanches (A vs H). L'absence de détection de signal de Ca dans le centre de l'ovule mature est due au déplacement de l'échantillon lors de la capture d' image. Barres d'échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya pour l'assistance lors de la préparation de ce manuscrit; Mariana Wolfner pour des discussions sur l'activation de l'œuf; Matt Wayland pour le support d'imagerie; et Nan Hu pour le soutien général en laboratoire.
Ce travail a été soutenu par l'Université de Cambridge, ISSF à TTW [numéro de subvention 097814].
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
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