Summary
Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila.
Introduction
Eine Änderung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration in Ei (Eizelle) Aktivierung ist ein konserviertes Bestandteil aller untersuchten Organismen 1,2. Dieses Ereignis löst eine breite Palette von Ca 2+ -abhängigen Prozessen des Zellzyklus und Übersetzung von gespeicherten mRNAs einschließlich Wiederaufnahme. Aufgrund dieser Anforderung für Ca 2+, hat die vorübergehende Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen Visualisierung gewesen Zentrum des Interesses.
Historisch wurden Modellorganismen für Studien über Eiaktivierung ausgewählt basierend auf der Größe und Verfügbarkeit ihrer Eier. Verschiedene Visualisierungs Ansätze wurden verwendet , um folgen und zu quantifizieren Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen in diesen Systemen, einschließlich: das Photoprotein Aequorin in Medaka - Fisch 3; Ca 2+ empfindliche fluoreszierende Farbstoffe wie Fura-2 in Seeigel und Hamster 4,5; und Calcium - Grün-1-Dextran in Xenopus 6.
Die Erzeugung und Verbesserung von genetisch kodierte Kalzium - Indikatoren (GeCIS) hat die Fähigkeit , Ca zu visualisieren umgewandelt 2+ Dynamik in vivo 7. Diese genetischen Konstrukte werden in spezifischen Geweben und begrenzen die Notwendigkeit für invasive Gewebezubereitungen 8 ausgedrückt.
GCaMPs sind ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) -basierten Klasse von GeCIS , die aufgrund ihrer hohen Affinität Ca 2+ sehr effektiv gewesen sind, Signal-zu-Rausch - Verhältnis und die Kapazität zu 9-11 angepasst werden. In Gegenwart von Ca 2+ erfährt der GCaMP Komplex eine Reihe von Konformationsänderungen, wobei der Ca 2+ Bindung an Calmodulin ausgehend , dass die Ergebnisse in einer erhöhten Fluoreszenzintensität der GFP - Komponente 9.
GCaMPs wurden in der Forschung über Drosophila Neuronen zu visualisieren Änderungen in intrazellulärem Calcium 12 extensiv verwendet. Die jüngsten applicatiauf der GCaMP Technologie Ca 2+ in reifen Drosophila Eier zu visualisieren hat einen einzigen transienten Ca 2+ Welle bei Eiaktivierung 13,14 enthüllt. Die Ca 2+ Welle kann während des Eisprungs in vivo 13 oder bei höherer Vergrößerung unter Verwendung eines ex vivo - Aktivierungs - Assay 13,14 bei geringer Vergrößerung sichtbar gemacht werden. In dem ex vivo Assay werden Einzel reifen Eizellen aus den Ovarien isoliert und aktiviert , um eine hypotonische Lösung, bezeichnet als Aktivierungspuffer, der die Ereignisse in vivo Aktivierung 15-17 zu rekapitulieren gezeigt wurde.
Diese Ex - vivo - Test ermöglicht eine einfache hochauflösende Visualisierung der Ca 2+ Welle unter verschiedenen experimentellen Bedingungen einschließlich pharmakologische Unterbrechung, physikalische Manipulationen und genetische Mutanten. Dieser Artikel zeigt die Herstellung von reifen Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung und the nachfolgende Mikroskopie die Ca 2+ Welle mit GCaMP zur Visualisierung verwendet. Dieser Ansatz kann verwendet werden , um die Initiierung und Kontrolle der Ca 2+ Welle zu testen und nachgelagerten Ergebnisse zu untersuchen.
Protocol
Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben.
1. Vorbereitung für Dissection
Hinweis: Die beschriebenen Schritte sind hier in Übereinstimmung mit E. Gavis, Princeton University & Weil et. al. 18. Führen Sie die folgenden Schritte zwei Tage vor Bildgebung.
- Nehmen Sie eine Fliege Fläschchen ca. 10 ml feste Nahrung enthält, und eine kleine Menge von Trockenhefe zu einer Ecke hinzufügen, weniger als 1 g ausreichend ist.
Hinweis: Weitere Informationen über das Fliegenflaschen oder Nahrung siehe "Drosophila Wartung" 19. - Merken 1 - 3 Tropfen Wasser, um die Hefe zu hydratisieren.
- Stellen Sie das Fläschchen beiseite zu einem Winkel von 45 ° und ermöglichen 3-5 min für die Hefe, das Wasser aufzunehmen.
- Während die Hefe das Wasser absorbiert, wählen Sie eine Flasche von Fliegen UASt- myr GCaMP5 20 angetrieben durch wannen VP16GAL4 (bezeichnet als GCaMP5) zum Ausdruck , die vor kurzem entstanden sind (ein myristoyumgerechnet Form wurde der GCaMP5 durch Anbinden der GECI an die Membran in dem Ei) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu schaffen, gewählt.
- Betäuben die Fliegen in der Flasche mit CO 2 -Gas. Achten Sie darauf, die Flasche umgedreht zu halten, um nicht Fliegen im Nassfutter zu verlieren.
- Zünglein an der narkotisierten Fliegen auf einen CO 2 Pad und sortieren 10 bis 15 Frauen und 5 Männer mit einem Pinsel unter einem Binokular mit. Hinweis: Es ist Standard-Männchen sind gesunde Frauen für die Präparation zur Verfügung zu stellen.
- Wenn das Fläschchen aus Schritt 1.3 bereit ist, fügen Sie in das Fläschchen die ausgewählten Fliegen. Achten Sie darauf, das Fläschchen horizontal zu halten, bis die Fliegen aktiv.
- Legen Sie das Fläschchen bei 25 ° C für ca. 36 Std.
- Lege die restlichen Fliegen aus dem CO 2 - Pad auf der Flasche oder zu verwerfen.
2. Präparieren Drosophila Ovarien
Anmerkung: Die beschriebenen Schritte sind hier gemäß Weil et. al. 3. Isolierkanne Einzelne Ältere Eier 4. Vorbereitung für Imaging 5. Imaging Ex Vivo Eiaktivierung 6. Nach der Akquisition Bildverarbeitung
Anmerkung: Die Zugabe von CO 2 Hinweis: Ältere Eier sind wahrscheinlich leicht von ovarian Bindegewebe zu trennen.
Hinweis: Die besten Ergebnisse erzielen, die Sonde sanft an der Seite der Eier laufen.
Hinweis: Vermeiden Sie auf die Rückenanhänge ziehen, da dies das Ei beschädigen können.
Hinweis: Abhängig von der künftigen Abbildungsaufbau, richten Sie die Eier etwa 200 & mgr; m Abstand senkrecht zur Deck für maximale Abbildungsbereich.
Hinweis: Der Aktivierungspuffer ist ein hypotonischen Puffer: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16,6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% Polyethylenglykol 8000, 2 mM CaCl 2, auf pH 6,4 mit einer 1: 5-Verhältnis von NaOH: KOH.Für weitere Informationen siehe Mahowald 1983 15. Aliquots Aktivierungspuffer kann über Monate bei -20 ° C gelagert werden und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
Hinweis: Ein Weitfeld, konfokale kann sich drehende Scheibe oder Lichtblatt-Mikroskop verwendet werden. Wir empfehlen ein umgekehrtes Mikroskop. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit einem konfokalen Mikroskop erhalten.
Hinweis: Für die Schritte 4,6-4,7, Software-Befehle in Abhängigkeit von Mikroskop und Hersteller unterschiedlich.
Anmerkung: Dieser wird zunächst als Schatten erscheinen aufgrund der Pipette den Strahlengang zu brechen, sondern auch in dem Auftreten von kleinen Öltröpfchen führen. Einige Öltröpfchen können mit dem reifen Ei verbunden bleiben, die experimentellen Ergebnisse und die Bildqualität beeinflussen.
Hinweis: Aufgrund bei Aktivierung von Eizellen zu Schwellungen, einige Eikammern der Fokusebene oder Feld dramatisch aus Sicht bei der Zugabe von Aktivierungspuffer bewegen wird. In dieser Situation, die Übernahme zu stoppen und die nächste Deck montieren.
Hinweis: Die Bildrate von der Imaging-Software wird benötigt, mit einem Zeitstempel auf dem Bild zu geben.
Representative Results
Hier haben wir gezeigt , wie reif Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung vorzubereiten. Eier Exprimieren eines GECI ermöglichen Abbildung von Ca 2+ Dynamik bei Ei - Aktivierung und den Beginn der Embryonalentwicklung (Abbildung 1). Es sollte , daß auf der GCaMP je bemerkt werden , verwendet, und zwar das Vorhandensein einer Myristoylgruppe, Ergebnisse haben kann leichte qualitative Unterschiede 13 14. Wir haben auch eine Rolle für die funktionelle Aktin während Ei Aktivierung durch die Zugabe eines Inhibitors der Aktin - Polymerisation nachgewiesen, Cytochalasin D, auf den Aktivierungspuffer (Abbildung 2) 14.
Eine Voraussetzung für das Zytoskelett bei Eiaktivierung konserviert. In C. elegans, nach der Befruchtung werden Zytoskelett - Komponenten neu organisiert 21,22 die Ein-Zellen Embryo zum ersten asymmetrischen Teilung vorzubereiten. In Seeigel, Störung der cytoskeletal Umorganisation nach Aktivierung wurde durch Verhindern kontraktilen Ringbildung 23 in den Zellzyklus zu beeinflussen , gezeigt. Die Rolle von Aktin in vermittelnde bleibt ein Ca 2+ Welle und ihrem stromabwärtigen Funktion bei Eiaktivierung in Drosophila vollständig aufgeklärt werden.
In Drosophila, Co-Visualisierung der Ca 2+ Wellen- und Aktin - Zytoskelett können mit dieser ex vivo - Aktivierungs - Assay erreicht werden. Zeitreihen von mehreren Kanälen kann der intrazellulären Ca erworben und Dynamik werden 2+ kann mit Änderungen in Actin - Organisation in der Eizelle (Abbildung 3) angepasst werden.
Abb . 1: A Single Ca 2+ Welle von Drosophila Eiaktivierung Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 nach dem einddition der Aktivierungspuffer (AH). Der Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2+ entsteht am hinteren Pol (B) und pflanzt (BF) mit einer mittleren Geschwindigkeit von ungefähr 1,5 & mgr; m / sec. Initiierung der Welle wird in der Regel innerhalb von 3 min von der Zugabe von Aktivierungspuffer beobachtet. Nach der Aktivierung liefert die intrazellulären Calciumspiegel des reifen Eizelle Voraktivierung Ebenen (G, H). Siehe ergänzende Film 1 (Gesamtzeit 33 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die Zugabe von Cytochalasin D zu Activation Buffer stört Ca2+ Wellenausbreitung. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei UASt- myrGCaMP5 exprimierenden Puffer nach Zugabe von Aktivierungs 10 ug / ml Cytochalasin D Endkonzentration (AH) enthält. Während der Ca 2+ Welle am hinteren Pol (A) eingeleitet wird, beeinträchtigt wird , und erreicht nicht die anteriore des Eies (F) (weiße Pfeilspitzen bezeichnen die Vorderseite der Welle). Keine weiteren Änderungen Ca 2+ wurden über 30 min beobachtet). Siehe ergänzende Film 2 (Gesamtzeit 30 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die gleichzeitige Visualisierung von Actin und Ca 2+ bei Egg Aktivierung in Drosophila. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 (Cyan) und UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) nach Zugabe von Aktivierungspuffer (AH). Die Ca 2+ Welle von dem hinteren Pol initiiert und stellt , wie in Fig . 1 erscheint Actin im Laufe der Zeit zu ändern, weiße Pfeilspitzen (A vs H). Der Mangel an Ca 2+ Signaldetektion in der Mitte des reifen Eizelle ist auf die Bewegung der Probe während der Bildaufnahme durch. Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya für die Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts; Mariana Wolfner für Diskussionen über die Ei-Aktivierung; Matt Wayland für die Bildgebung zu unterstützen; und Nan Hu für die allgemeine Unterstützung im Labor.
Diese Arbeit wurde von der University of Cambridge, ISSF TTW [Gewährungsnummer 097814] unterstützt.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
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