Summary
В данной статье описывается адаптируемый экс виво протокол для визуализации Ca 2+ во время активации яйца у дрозофилы.
Introduction
Изменение внутриклеточного Са 2+ концентрации в яйце (ооцитов) активации является сохраняющимся компонентом всех изученных организмов 1,2. Это событие инициирует широкий спектр Ca 2+ -зависимые процессов, в том числе возобновление клеточного цикла и трансляции сохраненных мРНК. В связи с этим требованием , Ca 2+, визуализируя переходные изменения внутриклеточной концентрации Са 2+ является ключевой интерес.
Исторически сложилось так, модельные организмы были отобраны для исследования по активации яиц на основе размера и доступности их яиц. Различные подходы к визуализации были использованы , чтобы следовать и количественной оценки изменений во внутриклеточной концентрации Са 2+ в этих системах, в том числе: Фотобелок акворина в Оризии рыбы 3; Ca 2+ чувствительные флуоресцентные красители , такие как Fura-2 в морских ежей и хомяка 4,5; и кальций - зеленый-1-декстрана в Xenopus 6.
Генерация и улучшение генетически кодируемых показателей кальция (GECIs) превратило способность визуализировать динамику Ca 2+ в естественных условиях 7. Эти генетические конструкции выражаются в конкретных тканях и ограничить потребность в препаратах инвазивного ткани 8.
GCaMPs являются зеленый флуоресцентный белок (GFP) , класс , основанный на GECIs , которые были очень эффективны в связи с их высоким сродством Ca 2+, отношение сигнал-шум и способность быть настроены 9-11. В присутствии ионов Са 2+, комплекс GCaMP претерпевает ряд конформационных изменений, начиная с связывание Са 2+ с кальмодулин, что приводит к увеличению флуоресцентной интенсивности GFP компонента 9.
GCaMPs широко используются в исследованиях Drosophila нейронов визуализировать изменения внутриклеточного кальция 12. Недавние Applicatiпо технологии GCaMP визуализации Ca 2+ в зрелых яиц дрозофилы показал одну переходную Ca 2+ волну при активации яйца 13,14. Волны Ca 2+ могут быть визуализированы при малом увеличении во время овуляции в естественных условиях 13 или при большем увеличении с использованием ех естественных условиях анализа активации 13,14. В естественных условиях экс анализа, отдельные зрелые ооциты выделяют из яичников и активируют с использованием гипотонического раствора, именуемых активации буфера, которое было показано , чтобы резюмировать события активации 15-17 в естественных условиях.
Этот анализ ех естественных условиях позволяет легко визуализировать с высоким разрешением Са 2+ волны при различных экспериментальных условиях , включая фармакологическую нарушения, физических манипуляций и генетических мутантов. Эта статья демонстрирует получение зрелых яиц дрозофилы для активации экс естественных условиях и гое последующая микроскопия используется для визуализации волны Ca 2+ с помощью GCaMP. Такой подход может быть использован для тестирования инициации и контроля волны Ca 2+ и зондировать вниз по течению результатов.
Protocol
Примечание: Выполнить все операции, при комнатной температуре, если не указано иное.
1. Подготовка к Dissection
Примечание: Описанные здесь шаги в соответствии с E. Гавис, Принстонский университет и Weil и др. и др. 18. Выполните следующие шаги, за два дня до съемки.
- Возьмем муху флакон, содержащий приблизительно 10 мл твердой пищи и добавить небольшое количество сухих дрожжей на один угол, менее 1 г достаточно.
Примечание: Для получения информации о летучей флаконах или пищевых продуктов см 'Drosophila Техническое обслуживание »19. - Добавьте 1 - 3 капли воды для гидратации дрожжей.
- Установите флакон в сторону под углом 45 ° и позволяют 3 - 5 мин для дрожжей, чтобы принять вверх воду.
- В то время как дрожжи поглощает воду, выбрать бутылку мух , экспрессирующих UASt- Миэр GCaMP5 20 , приводимый Тюб-VP16GAL4 (называемый GCaMP5) , которые в последнее время появились (в myristoyняющей форма GCaMP5 была выбрана, чтобы обеспечить высокое отношение сигнал-шум путем привязывания к Geci к мембране в яйце).
- Анестезировать мух в бутылке с CO 2 газа. Обязательно держите бутылку перевернутой таким образом, чтобы не потерять мух в мокрой пищи.
- Совет анестезированных мух на СО 2 колодки и сортировки 10 - 15 самок и 5 самцов с помощью кисти под рассекает микроскопом. Примечание: стандарт включает мужчин, чтобы обеспечить здоровые женщины для рассечения.
- Когда флакон с шага 1.3 будет готова, добавить выбранные мух во флакон. Позаботьтесь, чтобы держать флакон в горизонтальном положении, пока мухи не станут активными.
- Помещают пробирку при 25 ° С в течение приблизительно 36 часов.
- Возвращение оставшихся мух от СО 2 подушки к бутылке или выбраковки.
2. Режущая Drosophila Яичники
Примечание: Описанные здесь шаги в соответствии с Weil и др. и др.
3. Индивидуальные изолируя Зрелые яйца
- Под стандартным рассекает микроскопом с увеличением, установленным в 4 раза, на первом покровное с шага 2.4, разделить два яичники, оторвав яйцевод.
- Представьте пару закрытых щипцов в центре одного яичника, следя за тем, чтобы не проколоть любые яичные камеры.
- Вставьте стандартный рассекает зонд в центре яичник рядом с закрытым пинцетом.
- Аккуратно перетащите рассекает зонд через яичнике к заднему полюсу, где зрелые яйца (этап 14 яиц камеры) расположены.
- Повторите шаги 3.1 - 3.4 2 - 5 раз в зависимости от размера яичнике и количества яиц.
Примечание: Добавление CO 2 к югу> обычно вызывает осаждение одного яйца, которое появится больше с поднятыми спинных придатков, чем предварительно депонированы яиц. Это яйцо должно быть отброшено для работы с изображениями, так как она уже была активирована внутри самки.
Примечание: Зрелые яйца могут легко отделить от яичников соединительной ткани. - Если не зрелые яйца не видны снаружи яичника, продолжайте мягко дразнит с рассекает зондом.
- После того, как зрелые яйца видны на покровное за пределами яичник, маневрировать 3 - 5 в линию в центре покровное.
Примечание: Для достижения наилучших результатов, запустить зонд осторожно вдоль стороны яйца.
Примечание: Избегайте потянув на спинных придатков, так как это может повредить яйцо.
Примечание: В зависимости от будущего изображения установка, выравнивание яйца примерно 200 мкм друг от друга перпендикулярно покровное для максимальной области визуализации. - После того, как выровнен, удалите остальную часть ткани яичников, перетащив его от выровненных яиц с использованием пorceps.
- Удалите излишки масла путем протирания углу медицинской салфеткой. Будьте осторожны, чтобы не касаться зрелых яиц с медицинским вытирать, как зрелые яйца, которые контактировали будут потеряны.
- Draw перекрестие на покровное с маркером для упрощения размещения образца под микроскопом.
- Установите покровное в безопасном месте и оставить подготовленные яичные камеры на покровное, чтобы отдохнуть в течение 5 - 10 мин. Это позволяет яйцу оседают в масле. Образцы могут быть использованы до 1 ч после рассечения.
- Повторите шаги 3.1 - 3.11 для остальной части покровные с яичниками на них.
4. Подготовка к визуализации
- Доведите подготовленный буфер активации 15 до комнатной температуры.
Примечание: Буфер активации представляет собой гипотонический буфер: 3,3 мМ NaH 2 PO 4, 16,6 мМ КН 2 РО 4, 10 мМ NaCl, 50 мМ КСl, 5% полиэтиленгликоль 8000, 2 мМ CaCl 2, доводили до рН 6,4 с 1: 5 отношение NaOH: КОН.Для получения дополнительной информации см Маховальда, 1983 15. Аликвоты буфера активации можно хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев , и при 4 ° С в течение до 2 -х недель. - Тщательно подготовленные транспортировать покровные, буфер активации и стеклянные пипетки к средству визуализации.
Примечание: Широкий поле, конфокальной, вращающийся диск или легкий лист микроскоп может быть использован. Мы рекомендуем использовать инвертированный микроскоп. Наши репрезентативные результаты были получены с помощью конфокальной микроскопии. - Цель подходит для работы с изображениями всего зрелую яйцеклетку следует выбирать (здесь: 20X 0,7 NA).
- Установите первый подготовленный покровное на столике микроскопа. Будьте осторожны, чтобы не сломать покровные на сцене.
- Качественно выбрать поле зрения со зрелой яйцевой камеры для активации. Не изображение проколот яичные камеры или те, с блеббинга в мембране.
Примечание: шаги 4.6 - 4.7, программные команды будет меняться в зависимости от микроскопа и производителя. - Набор изображений пунктметров для стандартного GFP возбуждения (488 нм) и испускания (500 - 580 нм). Также настроен вид ярко-поле для того, чтобы визуализировать и ориентированность зрелую яйцеклетку и смещенный масло.
- Выберите самый низкий Z-плоскость, где зрелые яйца видимы и установить полный Z-стек, которые необходимо принять в течение 40 мкм приблизительно 2 мкм на шаг. Установите параметры таким образом, нет никакой задержки между приобретением Z-стека. Установите временные ряды, чтобы захватить в течение примерно 30 мин.
5. визуализации Ex Vivo Яйцо активации
- Запустить захват изображения.
- Подождите 1 - 2 полных Z-стеки должны быть приобретены. Это показывает зрелую яйцеклетку до активации.
- Вывод примерно 300 мкл буфера активации в стеклянную пипетку.
- Позиционирование кончик стеклянной пипетки, содержащей буфер активации под углом 45 ° над покровное, медленно переместите пипетку на траекторию луча, пока он не находится непосредственно над зрелое яйцо изображаемого. Стеклянная пипетка должнабыть 1 - 2 см выше масла.
- Добавьте 1 - 2 капли буфера активации менее чем за 5 секунд от стеклянной пипетки. Это должно вытеснять масло. Избегайте добавления избытка буфера активации или прикосновением яйцо со стеклянной пипеткой, как это может привести к смещению зрелого яйца. Будьте осторожны, не прикасайтесь к покровное с пипеткой, так как это может привести к изменению в фокальной плоскости или пузырьков воздуха с образованием в иммерсионного масла между объективом и покровное.
- В то время как добавление буфера активации во время получения изображения, проверьте канал светлого поля, чтобы гарантировать, что масло было перемещено буфером активации.
Примечание: Это будет сначала появляются как тень из-за пипетку нарушения на пути луча, но также приведет к появлению мелких капель масла. Некоторые капли масла могут оставаться связанным со зрелой яйцеклетки, которые будут влиять на экспериментальные результаты и качество изображения. - Если масло не смещается из первоначального добавления активирующего буфера повторите шаги 5.4 - 5.6.
- После того, как масло успешно смещаются, позволяют временные ряды не работать до завершения.
Примечание: Из-за отека ооцитов при активации, некоторые яичные камеры резко съехать из фокальной плоскости или поля зрения при добавлении буфера активации. В этой ситуации остановить приобретение и смонтировать следующий покровное. - После того, как последовательность изображений завершила приобретение, сохранение данных.
6. после приобретения Обработка изображений
- Откройте набор данных, используя Фиджи (http://fiji.sc/Downloads#Fiji~~HEAD=dobj) или эквивалентное программное обеспечение для обработки изображений, а затем выберите соответствующие файлы для анализа.
- Чтобы построить проекцию полученных данных выберите: Image> Стеки> Z-проект.
- Выберите начальную Z-среза и Z-срез стоп, как правило, весь раздел. Выберите тип проекции, как правило, установлен в "Max Intensity". Проверьте окошки "Все временные рамки", чтобы применить выбранные настройки ко всей серии.
- Еслиболее чем один флуоресцентный канал был, изображаемый с помощью инструмента Каналы для того, чтобы движение между цветами, сделать составной, или сделать изображение в оттенках серого. Выберите Image> Цвета> Каналы инструмент.
- Для регулировки яркости и контрастности изображения выберите изображение> Adjust> Brightness / Contrast.
- Чтобы экспортировать одно изображение, переместите ползунок временной шкалы к соответствующей рамке и выберите File> Save As> Jpeg или любой нужный формат.
- Выберите местоположение и название для экспортируемого файла, а затем сохранить.
Примечание Частота кадров с помощью программного обеспечения визуализации потребуется, чтобы дать временную метку на изображении. - Для экспорта временной ряд как фильм выберите: File> Save As> AVI, а затем выбрать частоту кадров (~ 7 кадров в секунду).
- Выберите местоположение и название для экспортируемого файла, а затем сохранить.
- Для того, чтобы сохранить измененное файл в формате Фиджи, выберите Файл> Сохранить.
Representative Results
Вот мы продемонстрировали , как подготовить зрелые яйца дрозофилы для активации экс естественных условиях. Яйца , выражающие Geci включить визуализацию Ca 2+ динамика при активации яйца и начало эмбрионального развития (рисунок 1). Следует отметить , что в зависимости от GCaMP используется, в частности , наличие миристоил группы, результаты могут иметь небольшие качественные отличия 13 14. Кроме того, мы продемонстрировали роль функциональной актина во время активации яиц путем добавления ингибитора полимеризации актина, цитохалазином D, в буфер активации (рисунок 2) 14.
Требование к цитоскелета при активации яиц сохраняется. В С. Элеганс, после оплодотворения, цитоскелета компоненты реорганизованы для подготовки эмбриона одноклеточных для первого асимметричного деления 21,22. В морских ежей, нарушение cytoskeleTal реорганизации после активации было показано , что влияет на клеточный цикл путем предотвращения образования цикла сократительную 23. Роль актина в опосредовании волну Са 2+ и ее вниз по течению функцию при активации яиц у дрозофилы остается полностью выяснены.
У Drosophila, со-визуализация Са 2+ волн и цитоскелета может быть достигнуто с помощью этого анализа , исключая виво активации. Временные ряды нескольких каналов могут быть приобретены и динамика внутриклеточного Ca 2+ могут быть сопоставлены с изменениями в организации актина в ооцитах (рисунок 3).
Рисунок 1:. Единый Ca 2+ волна в серии Drosophila Яйцо Время активации экс естественных условиях зрелых Drosophila яйца , выражающую UASt- myrGCaMP5 следуя аddition буфера активации (АГ). Повышение цитоплазматического Са 2+ берет свое начало в заднем полюсе (B) , а затем распространяет (BF) со средней скоростью около 1,5 мкм / с. Инициирование волны, как правило, наблюдается в течение 3 мин после добавления буфера активации. После активации внутриклеточных уровней кальция зрелого яйца возвращается к предварительной активации уровней (G, H). См дополнительный фильм 1 (общее время 33 мин). Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Добавление Цитохалазин D к активации буфера возмущает Ca2+ Распространение волн. Временных рядов экс виво зрелых Drosophila яйцеклетку , выражающую UASt- myrGCaMP5 после добавления активации буфера , содержащего 10 мкг / мл цитохалазином D конечной концентрации (AH). В то время как 2+ волна Са инициируется на заднем полюсе (а), она скомпрометирована и не доходит переднюю часть яйца (F) (белые головки стрелок обозначают фронт волны). Никаких дополнительных не наблюдалось изменения Са 2+ в течение 30 мин). См дополнительный фильм 2 (общее время 30 мин). Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Co-визуализация актин и Са 2+ при ЕАктивация в GG серии дрозофилы. Время экс естественных условиях зрелых Drosophila яйца , выражающую UASt- myrGCaMP5 (Cyan) и UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) после добавления буфера активации (AH). Са 2+ волна инициирует от заднего полюса и восстанавливается как показано на рисунке 1. Актина , похоже, меняется с течением времени, белые наконечники стрел (А против Н). Отсутствие Ca 2+ детектирования сигнала в центре зрелого яйца из - за перемещения образца во время захвата изображения. Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны Лаура Bampton, Алекс Дэвидсон, Ричард Партон, Арита Ачарья за помощь при подготовке этой рукописи; Мариана Wolfner для обсуждения активации яйца; Мэтт Wayland для поддержки формирования изображения; и Nan Ху для общей поддержки в лаборатории.
Эта работа была поддержана Кембриджского университета, ISSF в ТТЦ [грант номер 097814].
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
- Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
- Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
- Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
- Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).
- Douglass, A. New Techniques in Systems Neuroscience. , Springer. (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
- York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
- Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
- Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).
- Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).