Summary
Den här artikeln beskriver en anpassningsbar ex vivo protokoll för att visualisera Ca2 + under ägg aktivering i Drosophila.
Introduction
En förändring av intracellulär Ca2 + -koncentration på ägg (oocyt) aktivering är en konserverad komponent i alla studerade organismer 1,2. Denna händelse initierar ett brett spektrum av Ca2 + -beroende processer, inklusive återupptagande av cellcykeln och översättning av lagrade mRNA. På grund av detta krav på Ca2 +, visualisera övergående förändringar i intracellulära Ca 2 + koncentrationer har varit av avgörande intresse.
Historiskt sett har modellorganismer ut för studier på ägg aktivering utifrån storleken och tillgängligheten av deras ägg. Olika visualiseringsmetoder har använts för att följa och kvantifiera förändringar i intracellulär Ca2 + koncentrationer i dessa system, inklusive: fotoproteinet aequorin i medaka fisk 3; Ca2 + känsliga fluorescerande färgämnen som Fura-2 i sjöborre och hamster 4,5; och kalcium grön-en-dextran i Xenopus 6.
Genereringen och förbättring av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) har förändrat möjligheten att visualisera Ca2 + dynamiken in vivo 7. Dessa genetiska konstruktioner uttrycks i specifika vävnader och begränsa behovet av invasiva vävnadsberedningar 8.
GCaMPs är ett grönt fluorescerande protein (GFP) -baserad klass av GECIs som har varit mycket effektiv på grund av deras höga Ca 2 + affinitet, att signal-till-brusförhållande och kapacitet kan anpassas 9-11. I närvaro av Ca2 +, undergår GCaMP komplexet en serie av konformationsförändringar, med början med bindningen av Ca 2+ till kalmodulin, som resulterar i en ökad fluorescensintensitet av GFP-komponenten 9.
GCaMPs har i stor utsträckning använts i forskning om Drosophila nervceller att visualisera förändringar i intracellulär kalcium 12. De senaste applicatining GCaMP teknik för att visualisera Ca2 + i mogna Drosophila ägg har avslöjat en enda transient Ca2 + våg på ägg aktivering 13,14. Ca2 + våg kan visualiseras vid låg förstoring under ägglossning in vivo 13 eller högre förstoring med hjälp av en ex vivo aktiveringsanalys 13,14. I ex vivo-analysen är individuella mogna oocyter isolerades från äggstockar och aktiveras med hjälp av en hypoton lösning, kallad aktiveringsbuffert, som har visat sig rekapitulera händelserna av in vivo-aktivering 15-17.
Detta ex vivo assay möjliggör enkel hög upplösning visualisering av Ca2 + våg under olika experimentella förhållanden inklusive farmakologisk störningar, fysiska manipulationer och genetiska mutanter. Den här artikeln visar framställningen av mogna Drosophila ägg för ex vivo aktivering och the efterföljande mikroskopi används för att visualisera den Ca2 + våg med användning GCaMP. Denna metod kan användas för att testa initiering och kontroll av Ca2 + vågen och att undersöka resultat nedströms.
Protocol
Obs: Utför alla steg vid rumstemperatur om inget annat anges.
1. Förberedelser för Dissection
Obs: De steg som beskrivs här är i enlighet med E. Gavis, Princeton University och Weil et. al. 18. Utför följande steg två dagar innan avbildning.
- Ta en fluga flaska innehållande ca 10 ml av fast föda och tillsätt en liten mängd torrjäst till ett hörn, är mindre än 1 g tillräcklig.
Obs: information om flyga flaskor eller mat se för "Drosophila underhåll" 19. - Tillsätt 1 - 3 droppar vatten för att hydratisera jäst.
- Ställa flaskan åt sidan vid en 45 ° vinkel och tillåta 3-5 min för jästen att ta upp vattnet.
- Medan jästen är absorbera vatten eller för att välja en flaska av flugor som uttrycker UASt- myr GCaMP5 20 driven av tub-VP16GAL4 (kallad GCaMP5) som nyligen har uppstått (a myristoyrade formen av GCaMP5 valdes för att ge en hög signalbrusförhållande genom att tjudra den GECI till membranet i ägget).
- Bedöva flugorna i flaskan med CO2 gas. Var noga med att hålla flaskan inverterad för att inte förlora flugor i våtfoder.
- Tippa sövda flugor på en CO 2 pad och sortera 10 - 15 kvinnor och 5 män med hjälp av en pensel under ett dissektionsmikroskop. Obs: Det är standard att inkludera män att ge friska kvinnor för dissekering.
- När flaskan från steg 1,3 är redo, lägga till de valda flugor till flaskan. Var noga med att hålla flaskan horisontellt tills flugorna blir aktiva.
- Placera flaskan vid 25 ° C i ungefär 36 timmar.
- Återlämna resterande flugor från CO 2 pad till flaskan eller kassering.
2. Dissecting Drosophila Äggstockar
Obs: De steg som beskrivs här är i enlighet med Weil et. al. 3. Isolera enstaka mogna ägg 4. Förberedelser för Imaging 5. Imaging Ex Vivo Egg Aktivering 6. Post-förvärv bildbehandling
Obs: Tillsats av CO 2 Obs: Mogna ägg sannolikt att skilja enkelt från äggstocks bindväv.
Obs: För bästa resultat, kör sonden försiktigt längs sidan av äggen.
Obs: Undvik att dra på rygg bihang eftersom det kan skada ägget.
Obs! Beroende på den framtida imaging set-up, anpassa ägg ungefär 200 pm från varandra vinkelrätt mot täck för maximal bildyta.
Obs: Aktivering buffert är en hypoton buffert: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16,6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% polyetylenglykol 8000, 2 mM CaCl2, till pH 6,4 med en 1: 5 förhållandet mellan NaOH: KOH.För mer information, se Mahowald, 1983 15. Alikvoter av aktiveringsbuffert kan förvaras vid -20 ° C i flera månader och vid 4 ° C i upp till två veckor.
Obs: Ett brett fält, konfokala, snurrande skiva eller ljus ark mikroskop kan användas. Vi rekommenderar att du använder ett inverterat mikroskop. Våra representativa resultat erhölls med användning av ett konfokalt mikroskop.
Obs! Steg 4,6 - 4,7, programvarukommandon varierar beroende på mikroskop och tillverkare.
Notera: Detta kommer först att visas som en skugga på grund av pipetten att bryta strålen banan men kommer också att resultera i uppkomsten av små oljedroppar. Vissa oljedroppar kan förbli i samband med den mogna ägg som kommer att påverka experimentella resultat och bildkvalitet.
Obs: På grund av svullnad av äggceller vid aktivering, kommer vissa ägg kammare flytta dramatiskt ur fokalplanet eller synfält vid tillsats av aktiveringsbuffert. I denna situation, stoppa förvärv och montera nästa täckglas.
Obs Bildhastigheten från bildbehandlingsprogram kommer att krävas för att ge en tidsstämpel på bilden.
Representative Results
Här har vi visat hur man förbereder mogna Drosophila ägg för ex vivo aktivering. Ägg som uttrycker en GECI möjliggöra avbildning av Ca2 + dynamiken på ägg aktivering och början av embryonal utveckling (Figur 1). Det bör noteras att beroende på GCaMP användes, specifikt närvaron av en myristoyl-grupp, kan resultaten ha små kvalitativa skillnader 13 14. Vi har också visat en roll för funktionell aktin under ägg aktivering genom tillsats av en inhibitor av aktin polymerisation, cytochalasin D, till aktiveringsbuffert (figur 2) 14.
En förutsättning för cytoskelettet på ägg aktivering bevaras. I C. elegans, efter befruktningen, cytoskelettala komponenter omorganiseras för att framställa en cell embryo för första asymmetriska division 21,22. I sjöborre, störningar i cytoskeletal omorganisation efter aktivering har visat sig påverka cellcykeln genom att förhindra kontraktila ringbildning 23. Rollen av aktin i medla en Ca2 + våg och dess nedströms funktion på ägg aktivering i Drosophila fortfarande inte helt klarlagd.
I Drosophila, kan uppnås samtidig visualisering av Ca2 + vågen och aktincytoskelettet med användning av denna ex vivo aktiveringsanalys. Tidsserier av flera kanaler kan förvärvas och dynamiken i den intracellulära Ca2 + kan matchas med förändringar i aktin organisation i äggcellen (Figur 3).
Figur 1:. En enda Ca2 + Wave på Drosophila Egg Aktivering Tidsserier av ex vivo mogna Drosophila ägg uttrycker UASt- myrGCaMP5 efter enddition aktiveringsbuffert (AH). Ökningen av cytoplasma Ca2 + ursprung på den bakre stolpen (B) och propagerar (BF) med en medelhastighet på ungefär 1,5 pm / sek. Initiering av vågen typiskt observeras inom 3 min av tillsatsen av aktiveringsbuffert. Efter aktivering, de intracellulära kalciumnivåer i den mogna ägget återgår till pre-aktiveringsnivåer (G, H). Se kompletterande filmen 1 (total tid 33 minuter). Skalstrecken = 50 | im. Max projektion = 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tillägg av Cytochalasin D till aktiveringsbuffert stör Ca2+ vågutbredning. Tidsserier av ex vivo mogna Drosophila ägg uttrycker UASt- myrGCaMP5 efter tillsats av aktiveringsbuffert innehållande 10 pg / ml cytochalasin D slutlig koncentration (AH). Medan Ca2 + vågen initieras vid den bakre stolpen (A), är det äventyras och inte når den främre av ägget (F) (vita pilspetsar beteckna den främre delen av vågen). Ingen ytterligare Ca2 + förändringar observerades under 30 min). Se kompletterande filmen 2 (total tid 30 minuter). Skalstrecken = 50 | im. Max projektion = 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Co-visualisering av aktin och Ca2 + vid Egg Aktivering i Drosophila. Tidsserier av ex vivo mogna Drosophila ägg uttrycker UASt- myrGCaMP5 (cyan) och UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) efter tillsats av aktiveringsbuffert (AH). Ca2 + våg initierar från den bakre polen och återvinner som i figur 1. Actin verkar vara förändras över tiden, vita pilspetsar (A vs H). Avsaknaden av Ca2 + signaldetektering i centrum av den mogna ägget är på grund av rörelse av provet under bildinfångnings. Skalstrecken = 50 | im. Max projektion = 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya för hjälp under utarbetandet av detta manuskript; Mariana Wolfner för diskussioner om ägg aktivering; Matt Wayland för avbildning stöd; och Nan Hu för allmänt stöd i laboratoriet.
Detta arbete stöddes av University of Cambridge, ISSF till TTW [licensnummer 097.814].
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
- Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
- Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
- Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
- Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).
- Douglass, A. New Techniques in Systems Neuroscience. , Springer. (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
- York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
- Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
- Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).
- Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).