Abstract
De cerebrale arteriële cirkel (circulus arteriosus cerebri) of een cirkel van Willis (Cow) is een van de bloedsomloop anastomose rond de optische chiasma en de hypothalamus die bloed naar de hersenen en de omliggende structuren. Het is betrokken bij verscheidene cerebrovasculaire aandoeningen zoals cerebrale amyloïde angiopathie (CAA) geassocieerde vasculopathieën, intracraniële atherosclerose en aneurysma's. Onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze ziekten voor de identificatie van nieuwe drug targets voor de preventie nodig diermodellen. Sommige van deze modellen kan transgeen zijn, terwijl andere isolatie van de cerebro-vasculatuur, inclusief CoW.The hier beschreven methode is geschikt voor CoW isolatie in een muis afstamming en aanzienlijke mogelijkheden voor het screenen (expressie van genen, eiwitproductie zal betrekken, posttranslationele eiwit modificaties, secretoom analyse, enz.) onderzoek naar de grote schepen van de muis cerebrovaatstelsel. Het kan ook worden gebruikt voor ex vivo studies, door aanpassing van het orgaanbad ontwikkeld voor geïsoleerde muis olfactorische slagaders.
Introduction
De cerebrale arteriële cirkel (circulus arteriosus cerebri), ook bekend als de cirkel van Willis (CoW), lus van Willisor veelhoek Willis) werd eerst beschreven door Thomas Willis in 1664. Het is een anastomose circulatie rond de optische chiasma en de hypothalamus dat kan worden beschouwd als een centrale naaf die bloed naar de hersenen en de omliggende structuren. Bloed in deze structuur via de interne halsslagader en vertebrale slagaders en stroomt uit de cirkel via het interieur middelste en achterste cerebrale slagaders. Elk van deze slagaders heeft links en rechts takken ter weerszijden van de cirkel. De basilaire, post communiceren, en de voorste communiceren slagaders compleet de cirkel (figuur 1 en figuur 2). Het risico van verminderde bloedstroom in een van de uitstroming slagaders wordt geminimaliseerd door de samenvoeging van bloed die de cirkel van de hals- en cerebrale slagaders, teneinde te garanderen dat voldoende bloed wordt toegevoerd aan de bregen. Deze structuur dient ook als de beste methode om collaterale bloedstroom in ernstige occlusieve aandoeningen van de interne halsslagader.
Verschillende soorten cerebrovasculaire aandoeningen vinden hun oorsprong in de koe. De meest voorkomende zijn cerebrale amyloïde angiopathie (CAA) geassocieerde vasculopathieën, intracraniële atherosclerose en aneurysma's. 1, 2, 3 Deze aandoeningen kunnen leiden tot hypoperfusie door vaatverwijding en intracerebrale en / of subarachnoïdale bloeding uiteindelijk vertalen in ischemische of hemorragische beroertes of , in het beste geval een transient ischemic attack. Recente ontwikkelingen in diagnostische procedures, waaronder neuroimaging, eventueel gecombineerd met angiografie, hebben het mogelijk gemaakt om belangrijke cerebrovasculaire ziekten klinisch diagnosticeren, zonder dat een hersenbiopsie. Toch zijn effectieve en specifieke behandelingen (farmacologische of endovasculaire) momenteel ontbreekt en er is dus een noodzaak om te definiëren nieuwemoleculaire doelen.
De identificatie van nieuwe targets voor de preventie van deze ziekten bij mensen zal diermodellen en manieren isoleren de cerebro-vasculatuur zoals de koe vereist. Dergelijke modellen moeten bewijzen en aanwijzingen geven aan de specifieke veranderingen, waaronder inflammatoire veranderingen, die zich in de wanden van de grote vaten in diermodellen van intracraniële aneurysma, CAA of intracraniële atherosclerose. 4, 5, 6
We hebben een methode voor muizen CoW isolatie vastgestelde studies vaartuig ontsteking bij de ziekte van Alzheimer (AD) en gerelateerde ziekten zoals CAA vergemakkelijken. Deze methode voor het isoleren van de muis CoW werd ontwikkeld voor de beoordeling van inflammatoire cerebrovasculaire genexpressie tijdens ziekteprogressie. Samen met de detectie van amyloïde beta afzetting op de wanden van de leptomeningiale en pial slagaders, zou deze werkwijze gemakkelijker te ontmoedigenmine de mogelijke relatie tussen inflammatoire genexpressie in de cerebro-vaatstelsel muur en Ap-peptide accumulatie. Het vasculaire netwerk van de hersenen, waaronder de leptomeningiale en pial in de subarachnoïdale ruimte, is een uitbreiding van de grote slagaders die de cirkel van Willis. De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de koe van elke muis lineage isoleren en kan worden gebruikt voor alle soorten screening (bijvoorbeeld genexpressie, eiwitproductie en posttranslationele eiwit modificaties) op de grote vaten van de muis cerebro-vasculatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese communautaire normen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, met goedkeuring van de lokale ethische commissie voor dierproeven (Ile de France-Paris-comité, Authorization 4270).
1. Anesthesie
- Infuseren een dodelijke dosis pentobarbital (1 mg / 10 g lichaamsgewicht) intraperitoneaal (27-gauge naald en 1-ml spuit) in volwassen muizen voor de operatie.
2. Vessel Perfusie
Opmerking: Het is niet nodig om dierenarts zalf op de ogen tijdens het verblijf perfusie. Deze procedure is snel (5-10 minuten) en eindigt in de dood van het dier. Bevestigen het gebrek aan respons met een teen knijpen.
- Gebruik irisschaar, een insnijding, ongeveer 4 cm lang, in de buikwand en peritoneum, net onder de ribbenkast.
- Maak een kleine incisie (een paar millimeter lang) in het middenrif en vervolgens continue de incisie van het membraan over de gehele lengte van de ribbenkast naar de borstholte bloot te leggen.
- Til het borstbeen weg en klem de punt van het borstbeen met de hemostaat; Plaats de hemostaat op de hals. Zorgvuldig trim de vetweefsel aansluiten van het borstbeen naar het hart.
- Leid de 15-gauge naald perfusie via de linker ventrikel in de apex van het hart.
- Tenslotte, met een schaar op een van de lever lobben snijden naar een uitlaat te creëren.
OPMERKING: Een afzetmogelijkheid kan worden gecreëerd door irisschaar een incisie aan het rechter atrium te maken. - Perfuseren het dier met 25 tot 50 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een pomp die werkt bij een snelheid van 2,5 ml / min. De lever moet blancheer als het bloed wordt vervangen door PBS.
- Na ongeveer vijf minuten nadat de vloeistof uit de lever volkomen helder, stop de perfusie.
- Als immunokleuring of regelmatige kleuring gepland, perfuseren het dier met 50 ml paraformaldehyde(PFA, 4% in PBS) gedurende 15 min.
LET OP: Let op, PFA dampen zijn giftig. Perfusie van het dier met PFA moet in een geventileerde zuurkast worden uitgevoerd.
3. Isolatie van de hersenen en de Cirkel van Willis
- Isolatie van de hersenen
- Verwijder het hoofd met een paar chirurgische schaar.
- Maak een middellijn incisie met iris schaar, langs de huid van de hals aan de neus.
- Snij de huid aan de schedel bloot te leggen en verwijder eventueel resterende spieren en vetweefsel met iris schaar.
- Plaats de punt van de irisschaar in de foramen magnum enerzijds en schuift deze langs het binnenoppervlak van de schedel om de externe gehoorgang (ook bekend als de gehoorgang).
- Reproduceren in 3.1.4 beschreven aan de contralaterale zijde incisie en een middellijn snede langs het binnenoppervlak van de inter-pariëtale bot om het begin van de pijlnaad.
- Plant de irisschaar in de frontale bot, recht tussen de ogen, in de pijlnaad en open ze naar de schedel in tweeën gesplitst.
- Til de hersenen, grijpen de olfactorische bollen en met behulp van de iris schaar om de zenuwverbindingen op zijn ventrale oppervlak af te snijden.
- Verwijder de hersenen en plaats deze in een 60 mm petrischaal met ijskoude PBS voor CoW isolement. Volledig onder te dompelen de hersenen in de PBS. Als de hersenen gefixeerd met 4% PFA (voor volgende snijden en immunokleuring of regelmatige kleuring), houd het in een bad van 4% PFA bij 4 ° C gedurende 24 uur.
- Isolatie van de cirkel van Willis
LET OP: Een dissectie microscoop nodig is voor CoW isolement. De hersenen moet bij 4 ° C gedurende de gehele procedure gehouden.- Zet de hersens kraken (dat is op het dorsale oppervlak) de koe visualiseren.
- Gebruik een kleine tang om de voorste cerebrale arteriën (ACA) bij de basis van de olfactorische kwabben grijpen (
- Gebruik de scherpe uiteinden van de tang te tillen en verwijder de grote slagaders vormen de koe uit de cortex.
- Til de start van het achterste communicerende arteriën (PCA) om ze los te koppelen van de hersenen door het vastgrijpen van de middelste cerebrale arteriën (MCA) met de tang. Pak de voorste slagaders (ACA en MCA) en trek ze voorzichtig over de optische chiasma in een anterior-dorsale richting. Om verstoring van de koe te voorkomen, onderbreken de procedure te gaan met de andere slagaders.
- Herhaal stap 3.2.2 en 3.2.3 voor de superieure en posterieure cerebellaire slagaders (SCA) / (PCA) (c, figuur 1) en voor de basilaris (BA) (d, figuur 1), trekken ze in een rug- anterieure richting. Stop aan het einde van de procedure beschreven in 3.2.4.
- Verwijder de gehele Koe door zachtjes te trekken met de tang. Plaats de koe in een 60 mm petrischaal gevuld met ijskoude PBS en verwijder alle resterende bevestigd hersenweefsel met twee tang, die de koe in plaats met kleine pinnetjes.
- Houd de geoogste CoW bij -80 ° C voor verdere verwerking voor RNA-zuivering (RNA uitmaling grote hoeveelheden RNA - ongeveer 500 ng) of eiwitextractie.
Let op: de koe kan worden gehandhaafd ex vivo gedurende 24 uur door een aanpassing van het orgel bad systeem ontwikkeld voor geïsoleerde muis olfactorische slagader 7.
Figuur 1: Schematische weergave van een Ventraal aanzicht van de hersenen van muizen benadrukken de koe de koe wordt gevormd uit de twee interne halsslagaders (MCA), die zijn afgeleid van de twee voorste cerebrale arteriën (ACA). het basilairslagader (BA) takken in de achterste (PCA) en een superieure (SCA) cerebrale slagaders, en twee vertebrale slagaders (VA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De PBS-doorbloed muis is gedood en de koe wordt geïsoleerd zoals beschreven in paragraaf 3.2 van het protocol. Wanneer de dissectie correct wordt uitgevoerd, dient de koe in één stuk zijn en lichtjes transparant zijn door de afwezigheid van resterende bloed in de vasculatuur.
Figuur 2: De muis CoW na isolatie. (A) Overzicht van de koe in een 10-cm petrischaal. (B) Details van de verschillende takken van de koe. MCA voor middelste cerebrale slagaders, ACA voor anterieure cerebrale slagaders, BA voor basilaire slagader, PCA voor posterieure cerebrale slagaders en SCA voor superieure cerebrale slagaders. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Niveaus van mRNA kan worden bepaald door RT-qPCR met normalisatie ten opzichte van een referentie-gen transcript (hier, dat GAPDH). Typische resultaten worden getoond in figuur 3A en B.
Figuur 3:. Expressie van neuronale en Contractiele genen in de muis Cirkel van Willis en de hersenen van de RT-qPCR resultaten werden genormaliseerd tegen die van een referentie-gen (GAPDH). Zij worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van 6 tot 12 onafhankelijke experimenten; Vergelijking van de koe met de hersenen: ns, niet significant, * P <0,05, ** P <0,005 en *** p <0,001 (A) Expressie van contractiele genen. SMA (gladde spier actine), smootheline, SM-MHC (gladde spier-myosine heavy chain 11) en E-selectine (B) Expressie van neuronale genen. Mog (myeline oligodendrocyt glycoproteïne) en Map2 (microtubule geassocieerd proteïne 2).
De expressie patroon van de endotheliale marker E-selectine in de hersenen ontbreekt de koe is zeer vergelijkbaar met die verkregen voor CoW monsters, mogelijk als gevolg van het bestaan van een brein capillair netwerk. Tabel 1:. Mean Crossing Point voor de expressie van neuronale en Contractiele genen in de muis Cirkel van Willis en Brain De berekeningen zijn gebaseerd op een vergelijking van de precieze cyclus bepaald door grensovergangen (Cp) op een constant niveau van de fluorescentie. De grensovergang is het cyclus nummer van de maximum tweede afgeleide van de amplificatiecurve. Hogere Cp waarden geassocieerd met lagere expressieniveaus. Voor een bepaald gen wordt expressie geacht niet te detecteren wanneer de Cp dan 35. (A) Cp van het referentiegen: GAPDH; en contractiele genen: SMA, smootheline, SMMHC en E-selectine (B) Cp van het referentie-gen. GAPDH; en neuronale genen: Mog en Map2. EEN. Mean Cp GAPDH SMA smootheline SM-MHC E-Sel Gemiddelde SD N Gemiddelde SD N Gemiddelde SD N Gemiddelde SD N Gemiddelde SD N Koe 20.86 0.93 12 22.02 0.67 12 25.29 1.89 12 23.37 0.80 12 30.56 1.66 12 Hersenen 18.71 0.72 6 33.91 2.06 6 31.08 3.17 6 26.05 0.73 6 28.45 0.63 6 B. <td> Mean Cp GAPDH Mog Map2 Gemiddelde SD N Gemiddelde SD N Gemiddelde SD N Koe 21.04 0.41 6 32.13 1.63 6 30.21 0.85 6 Hersenen 19.09 0.49 6 26.43 0.88 6 23.30 0.99 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier een reproduceerbare protocol voor de isolatie van de cirkel van Willis. De meest voorkomende cerebrovasculaire aandoeningen van CoW worden met CAA geassocieerde vasculopathieën, intracraniële atherosclerose en intracraniële aneurysma, die allemaal invloed op de wanden van slagaders. De risicofactoren zijn bekend, maar de moleculaire pathogenese van deze hersenaandoeningen steeds slecht begrepen en specifieke biologische merkers voor het voorspellen van het optreden daarvan ontbreken. Er bestaat grote belangstelling in werkwijzen voor het isoleren van de koe transgene muizen macroscopische waarnemingen te koppelen aan moleculaire veranderingen. Bijvoorbeeld, door het induceren consistente aneurysma in een muismodel waarin een bepaald gen wordt uitgeschakeld (zoals beschreven door Hosaka et al. 8) en het analyseren van de koe moet het mogelijk zijn te bepalen of behandelingen voor de proteïne gecodeerd door dit gen kan voorkomen intracraniële aneurysmata en / of subarachnoïdale bloeding. Obviously, kan deze werkwijze ook worden gebruikt om het effect van een bepaald geneesmiddel op de progressie van CAA geassocieerde vasculopathieën in de verschillende transgene muismodellen voor AD analyse.
Het is gemakkelijker om muis slagaders isoleren dan muis gehele microvaatjes zuiveren, maar deze bemonstering is echter moeilijker muizen dan bij ratten. Inderdaad, de rat CoW ingebed in veel stijver hersenvliezen, waardoor de hele constructie te isoleren in een keer. Naast het probleem van de geringe omvang van de vaartuigen in muizen, deze procedure is lastig vanwege de transparantie van de vaten na de perfusie met PBS voor het verwijderen van de hersenen. Wij adviseren daarom het beoefenen zonder de infusie, vanaf stap 3 na de anesthesie om het gemakkelijker maken om de bloedvaten te onderscheiden. Tenslotte een muis hersenvaten zijn zeer goed en gemakkelijk breken, de ontleding worden uitgevoerd zeer zorgvuldig uitgevoerd, zonder haast, zodat de gehele structuuris geïsoleerd uit één stuk, door eerst de ACA grijpen. De zuiverheid van de koe preparaat kan worden geëvalueerd door de niveaus van expressie van de neuronale en vat genen. Met de praktijk, een CoW biedt slechts toereikend RNA voor de studie van 5-10 genexpressies. Voor grootschalige screening moet met een aantal muis koeien worden samengevoegd.
Gauthier et al. 9 een werkwijze beschreven voor het isoleren van kleine stukjes microvaatjes (gebaseerd op het gebruik van collagenase / dispase fragmenten van de hersenen en glasparels te houden verteren) dat gladde spiercellen of endotheelcellen die in kweek wanneer kan worden gehandhaafd levert geplaatst in een geschikt medium. Het voordeel van onze werkwijze is dat deze isoleert grote vaten, zonder dat vatstructuur. De dissectie van specifieke takken van de koe kan ook van belang zijn om de correlatie tussen de expressie van genen profiel van een bepaalde tak en mogelijke gevoeligheid voor cerebrovasculaire diseas bepalenes zoals intracraniële aneurysma. Een dergelijke aanpak kan een verklaring te geven over de vraag waarom sommige ACA anatomische en genetische variaties zijn gecorreleerd met een hogere prevalentie van ACA aneurysma's. Deze dissectie vereist druk met een tang bij de basis van elke specifieke aftakking wordt uitgeoefend, te scheiden van de andere takken, aan het begin van de koe isolatiewerkwijze.
Dus naast waardoor cellen afkomstig van de koe 10 of screenen op genexpressie 11 en eiwitproductie 12 of posttranslationele eiwit modificaties, kan deze methode worden gebruikt voor ex vivo studies, door simpelweg aanpassen van het orgaanbad systeem ontwikkeld geïsoleerde muis olfactorische slagaders. 7 Na incubatie van de gehele koe in kweekmedium met antibiotica, kan de secretoom vrijgegeven door deze specifieke structuur worden verkregen en geanalyseerd. Een analyse van deze secretoom in muismodellen van CAA zou het po makenssible bijvoorbeeld de CAA-gerelateerde ontstekingsstatus deze cerebrale arteriën bepalen. Het resulterende geconditioneerde medium kan ook worden gebruikt om de effecten van de secretoom op elke vaatwand celtype fenotype bepalen. Pathologische CoW preparaten kunnen ook worden gebruikt om mogelijke verschillen in biochemische signalen, zoals cyclisch guanosine monofosfaat (cGMP), cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) bepalen of Ca2 + concentraties, met detecteerbare fluorescentie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde biosensoren. -Virus geleverd biosensoren werden gebruikt hersenplakje preparaten die experimenteel toegankelijk rijpe levende neuronen met een behouden morfologie leidt tot de detectie van grote verschillen in D1 reactie tussen de piramidale corticale neuronen en striatale medium stekelige neuronen. 13
Het modelleren van cerebrovasculaire aandoeningen in transgene muizen die FRET-gebaseerde tweede boodschapper sensor eiwitten 14voor de beeldvorming van biochemische signalen in de geïsoleerde CoW dienen voorts nader inzicht in de biochemie, pathofysiologie en farmacotherapie van deze ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Paris VI University en een Pierre Fabre Innovatie subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors - Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
- Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
- Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
- Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
- Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
- Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
- Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
- Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
- Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
- Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
- Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
- Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
- Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
- Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
- Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).
