Abstract
Den cerebrala arteriella cirkel (circulus arteriosus cerebri) eller cirkel av Willis (ko) är en cirkulations anastomos omger synnervskorsning och hypotalamus som levererar blod till hjärnan och omgivande strukturer. Det har varit inblandad i flera cerebrovaskulära störningar, inklusive cerebral amyloid angiopati (CAA) -associated vaskulopatier, intrakraniell ateroskleros och intrakraniella aneurysmer. Studier av de molekylära mekanismerna bakom dessa sjukdomar för identifiering av nya målproteiner för förebyggande kräver djurmodeller. Några av dessa modeller kan vara transgena, medan andra kommer att innebära isolering av cerebro-kärlsystemet, inklusive CoW.The här beskrivna metoden är lämplig för ko isolering i någon mus härstamning och har stor potential för screening (uttryck av gener, proteinproduktion, posttranslationella proteinmodifieringar, secretome analys, etc.) studier på de stora kärlen i musen cerebro-vaskulatur. Den kan även användas för ex vivo-studier, genom att anpassa organbadet system utvecklat för isolerade mus olfactory artärer.
Introduction
Den cerebrala arteriella cirkel (circulus arteriosus cerebri), också känd som kretsen av Willis (ko), slinga av Willisor Willis polygon) beskrevs först av Thomas Willis i 1664. Det är en cirkulations anastomos ligger runt synnervskorsning och hypotalamus som kan betraktas som ett centralt nav som levererar blod till hjärnan och omgivande strukturer. Blod kommer in denna struktur via inre hals och vertebrala artärerna och den flyter ut ur cirkeln via det inre mitten och bakre cerebrala artärerna. Var och en av dessa artärer har vänster och höger grenar på vardera sidan av cirkeln. Basilaris, post kommunicerande, och främre kommunicerande artärer fullständigt cirkeln (figur 1 och figur 2). Risken för nedsatt blodflöde i någon av utflödes artärerna minimeras genom en sammanslagning av blod in i cirkeln från halspulsådern och hjärnans kärl, vilket garanterar att tillräckligt med blod matas till bregn. Denna struktur fungerar också som den viktigaste vägen för säkerheter blodflödet i svåra ocklusiva sjukdomar i inre halspulsådern.
Flera typer av cerebrovaskulära störningar har sitt ursprung i kon. De vanligaste är cerebral amyloid angiopati (CAA) -associated vaskulopatier, intrakraniell ateroskleros och intrakraniella aneurysm. 1, 2, 3 Dessa störningar kan leda till hypoperfusion på grund av vasodilation, och intracerebrala och / eller subaraknoidal blödningar i slutänden ischemisk eller hemorragisk stroke eller , i bästa fall, en transitorisk ischemisk attack. Senaste framstegen inom diagnostik, bland annat neuroradiologiska, eventuellt i kombination med angiografi, har gjort det möjligt att diagnostisera dessa stora cerebrovaskulära sjukdomar kliniskt, utan behov av en hjärnbiopsi. Ändå är effektiva och specifika behandlingar (farmakologiska eller endovaskulära) för närvarande saknas och det finns därför ett behov av att definiera nyamolekylära mål.
Identifieringen av nya läkemedelsmål för att förebygga dessa sjukdomar hos människor kommer att kräva djurmodeller och sätt att isolera den cerebro-kärlsystemet inklusive kon. Sådana modeller bör ge bevis och ledtrådar till de specifika förändringar, inklusive inflammatoriska förändringar, som förekommer i väggarna i de stora kärlen i djurmodeller av intrakraniell artär aneurysm, CAA eller intrakraniell ateroskleros. 4, 5, 6
Vi har etablerat en metod för mus ko isolering för att underlätta studier av kärlinflammation i Alzheimers sjukdom (AD) och relaterade sjukdomar, såsom CAA. Denna metod för att isolera mus ko var utvecklad för bedömning av inflammatorisk cerebrovaskulär genuttryck under sjukdomsförloppet. Tillsammans med detekteringen av amyloid beta avsättning inom väggarna i de leptomeningeal och pial artärer, kunde denna metod gör det lättare att avskräckagruva möjligt samband mellan inflammatoriska genuttrycket i cerebro-kärlväggen och Ap-peptid ackumulering. Det vaskulära nätverket av hjärnan, inklusive det leptomeningeal och pial i subaraknoidalrummet, är en förlängning av de stora artärerna som bildar kretsen av Willis. Den här beskrivna metoden kan användas för att isolera den ko av något mus härstamning och skulle kunna användas för alla typer av screening (t.ex., genexpression, proteinproduktion och posttranslationella proteinmodifieringar) på de stora kärlen i mus-cerebro-kärlsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes i enlighet med Europeiska gemenskapens standarder för vård och användning av försöksdjur, med godkännande av den lokala etiska kommittén för djurförsök (Ile de France-Paris-kommittén, godkännande 4270).
1. Anestesi
- Ingjuta en letal dos av pentobarbital (upp till 1 mg / 10 g kroppsvikt) intraperitonealt (27-gauge-nål och 1-ml spruta) i vuxna möss före operation.
2. Fartygs Perfusion
OBS: Det finns ingen anledning att tillämpa veterinär salva för ögonen under fartyg perfusion. Detta förfarande är snabb (5-10 min) och slutar i djurets död. Bekräfta bristen på svar med en tå nypa.
- Med användning av iris sax, gör ett snitt, ca 4 cm lång, i bukväggen och peritoneum, precis under bröstkorgen.
- Gör ett litet snitt (några millimeter lång) i membranet och därefter continue snittet av membranet längs hela längden av bröstkorgen för att exponera pleurahålan.
- Lyft bröstbenet bort och klämma spetsen av bröstbenet med hemostat; placera hemostat på halsen. Noggrant trimma fettvävnad ansluter bröstbenet till hjärtat.
- Passera 15-gauge perfusion nål genom vänster kammare i spetsen av hjärtat.
- Slutligen använder sax för att klippa en av leverlober för att skapa ett utlopp.
OBS: En alternativ utlopp kan skapas med hjälp av iris sax för att skapa ett snitt till höger förmak. - BEGJUTA djuret med 25 till 50 ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en pump som arbetar med en hastighet av 2,5 ml / min. Levern bör blanch som blodet ersätts med PBS.
- Efter ca fem minuter, en gång vätskan från levern är helt klar, stoppa perfusion.
- Om immunfärgning eller vanlig färgning planeras, BEGJUTA djuret med 50 ml av paraformaldehyd(PFA; 4% i PBS) under 15 min.
OBS: Varning, PFA ångor är giftiga. Perfusion av djuret med PFA bör utföras i ett ventilerat dragskåp.
3. Isolering av hjärnan och Circle of Willis
- Isolering av hjärnan
- Ta bort huvudet med ett par av kirurgiska saxar.
- Gör en mittlinjesincision med iris sax, längs huden från halsen till näsan.
- Trimma bort huden för att exponera skallen och ta bort eventuella kvarvarande muskler och fettvävnad med iris sax.
- Placera den vassa änden av iris sax in i foramen magnum på ena sidan och noggrant glida dem längs den inre ytan av skallen till den yttre hörselgången (även känd som öronkanalen).
- Reproducera snittet som beskrivs i 3.1.4 på kontralaterala sidan och göra en mittlinje skär längs den inre ytan av den inter-parietala benet till starten av den sagittala suturen.
- Plantera irissax i pannben, mitt emellan ögonen, i sagittala suturen och sedan öppna dem att dela skallen i två.
- Lyft ur hjärnan, ta tag i luktsinnet glödlampor och använda iris sax för att klippa bort nerv anslutningar på sin ventrala yta.
- Ta bort hjärnan och placera den i en 60-mm petriskål med iskall PBS under ko isolering. Helt fördjupa hjärnan i PBS. Om hjärnan fixerades med 4% PFA (för efterföljande sektionering och immunfärgning eller vanlig färgning), hålla den i ett bad med 4% PFA vid 4 ° C under 24 timmar.
- Isolering av kretsen av Willis
OBS: Ett dissektionsmikroskop krävs för ko isolering. Hjärnan bör hållas vid 4 ° C under hela förfarandet.- Sätta hjärnan upp och ned (det vill säga på sin dorsala ytan) för att visualisera kon.
- Använd en liten tång för att greppa de främre cerebrala artärer (ACA) vid basen av luktlober (
- Använd skarpa ändarna av pincett för att lyfta och ta bort de stora artärerna bildar ko från cortex.
- Lyft upp starten av de posteriora kommunicerande artärer (PCA) för att koppla bort dem från hjärnan, genom att gripa de mittersta cerebrala artärer (MCA) med tången. Plocka upp de främre artärer (ACA och MCA) och dra dem försiktigt över den optiska chiasm i en anterior-dorsal riktning. För att förhindra störning av det ko, avbryta det förfarande för att ta itu med de andra artärer.
- Upprepa steg 3.2.2 och 3.2.3 för de överlägsna och posteriora cerebellära artärer (SCA) / (PCA) (c, figur 1) och för basilar artär (BA) (d, figur 1), dra dem i en dorsal- anterior riktning. Stanna vid slutet av det förfarande som beskrivs in 3.2.4.
- Ta bort hela ko genom att dra försiktigt med pincett. Placera ko i en 60 mm petriskål fylld med iskallt PBS och ta bort eventuella kvarvarande fäst hjärnvävnad med två pincett, hålla ko på plats med små stift.
- Hålla den skördade ko vid -80 ° C för efterföljande behandling för RNA-rening (RNA extraktion utbyten stora mängder RNA - cirka 500 ng) eller proteinextraktion.
Obs: kan bibehållas kon ex vivo för 24 timmar, genom att anpassa organbadet system utvecklat för isolerad mus lukt artär 7.
Figur 1: Schematiskt diagram av en Ventral Vy av Mouse Brain Markering kon kon är bildad av de båda inre halspulsåder (MCA), vilka är härledda från de två främre cerebrala artärer (ACA);. basilarisartär (BA) förgrenar sig i den bakre (PCA) och överlägsen (SCA) cerebrala artärer, och två vertebrala artärer (VA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBS-perfusion mus dödas och kon isolerades såsom beskrivits i avsnitt 3.2 i protokollet. När dissektion utförs korrekt, bör kon komma ut i ett stycke och bör vara något transparenta på grund av frånvaron av kvarvarande blod i kärlsystemet.
Figur 2: musen ko efter isolering. (A) Översikt över ko i en 10-cm petriskål. (B) Uppgifter om de olika grenarna av kon. MCA för mellan cerebrala artärer, ACA för främre cerebrala artärer, BA för basilar artär, PCA för bakre cerebrala artärer och SCA för överlägsen cerebrala artärer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Nivåer av mRNA kan bedömas genom RT-qPCR med normalisering i förhållande till en referens gentranskript (här, det av GAPDH). Typiska resultat visas i Figur 3A och B.
Figur 3:. Expression av neurala och Kontraktila gener i musen Circle of Willis och Brain RT-qPCR resultat normaliserades mot dem för en referens gen (GAPDH). De uttrycks som medelvärde ± SD av 6 till 12 oberoende försök; Jämförelse av kon med hjärnan: ns, inte signifikant, *, P <0,05, **, P <0,005, och ***, P <0,001 (A) Expression av kontraktila gener:. SMA (glattmuskelaktin), smoothelin, SM-MHC (glattmuskel-myosin tung kedja 11) och E-selektin (B) Expression av neuronala gener:. Mog (myelin oligodendrocyt-glykoprotein) och MAP2 (mikrotubulus associerat protein 2).
Uttrycksmönstret för den endoteliala markör E-selektin i hjärnan som saknar den kon är mycket lik den som erhölls för ko prover, vilket möjligen återspeglar förekomsten av en hjärna kapillärt nätverk. Tabell 1:. Mean övergångsställe för uttrycket av neuronala och Kontraktila gener i musen Circle of Willis och Brain Beräkningarna baseras på en jämförelse av den exakta cykeln bestämdes med övergångsställen (cp) vid en konstant nivå av fluorescens. Korsningspunkten är cykelnumret som motsvarar den maximala andraderivatan av förstärkningskurvan. Högre Cp värden förknippade med lägre nivåer av uttryck. För en given gen, är uttryck anses vara omöjlig att upptäcka om Cp överstiger 35. (A) Cp av referens genen: GAPDH; och av kontraktila gener: SMA, smoothelin, SM-MHC och E-selektin (B) Cp av referens genen. GAPDH; och neuronala gener: Mog och MAP2. EN. medelvärde Cp GAPDH SMA Smoothelin SM-MHC E-Sel Betyda SD N Betyda SD N Betyda SD N Betyda SD N Betyda SD N Ko 20,86 0,93 12 22.02 0,67 12 25,29 1,89 12 23,37 0,80 12 30,56 1,66 12 Hjärna 18,71 0,72 6 33,91 2,06 6 31,08 3,17 6 26,05 0,73 6 28,45 0,63 6 B. <td> medelvärde Cp GAPDH KATT MAP2 Betyda SD N Betyda SD N Betyda SD N Ko 21,04 0,41 6 32,13 1,63 6 30,21 0,85 6 Hjärna 19,09 0,49 6 26,43 0,88 6 23,30 0,99 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver här en reproducerbar protokoll för isolering av kretsen av Willis. De vanligaste cerebrovaskulära sjukdomar som involverar kon är CAA-associerade kärlsjukdomar, intrakraniell ateroskleros och hjärnaneurysm, som alla påverkar väggarna i arteriella kärl. Riskfaktorerna är välkända, men den molekylära patogenesen av dessa cerebrala störningar inte är tillräckligt utredd och specifika biologiska markörer för att förutsäga deras förekomst saknas. Det finns ett stort intresse för metoder för att isolera ko från transgena möss för att länka makroskopiska observationer med molekylära förändringar. Till exempel, genom att inducera konsekventa aneurysmer i en musmodell i vilken en särskild gen slås ut (såsom beskrivits av Hosaka et al. 8) och analysera den ko, bör det vara möjligt att bestämma huruvida behandlingar targeting proteinet som kodas av denna gen kunde förhindra intrakraniella aneurysm och / eller subaraknoidal blödningar. Obviously, kan denna metod även användas för att analysera effekten av ett speciellt läkemedel på utvecklingen av CAA-associerade vaskulopatier i de olika transgena musmodeller av AD.
Det är lättare att isolera mus artärer än att rena hela mus mikrokärl, men en sådan provtagning är dock svårare hos möss än hos råttor. Faktum är att rått-ko inbäddad i mycket styvare meninges, vilket gör det möjligt att isolera hela strukturen på en gång. Förutom problemet med den lilla storleken av fartygen i möss, är detta förfarande också svårt på grund av insyn i de fartyg som till följd av deras perfusion med PBS före bortförandet av hjärnan. Vi rekommenderar därför att öva utan infusion, med början från steg 3 efter anestesi för att göra det lättare att skilja blodkärlen. Slutligen, såsom mus cerebrala kärl är mycket fina och går lätt sönder, dissektion bör utföras mycket noggrant, utan att rusa, för att säkerställa att hela strukturenisoleras i ett stycke, genom att först ta tag i ACA. Renheten av kon preparatet kan utvärderas genom att jämföra uttrycksnivåerna av de neuronala och kärl gener. Med praktiken ger en enda ko endast tillräcklig RNA för studier av 5 - 10 genuttryck. För storskalig screening bör flera mus kor slås samman.
Et al. Gauthier 9 beskrivs ett förfarande för isolering små bitar av mikrokärl (baserat på användning av kollagenas / dispas att smälta fragment av hjärnan och av glaspärlor för att fånga dem) som ger glatt muskulatur eller endotelceller som kan upprätthållas i odling när placeras i ett lämpligt medium. Fördelen med vår metod är att det isolerar stora fartyg, utan att ändra fartygets struktur. Dissektion av specifika grenar av kon kan också vara av intresse, för att bestämma korrelationen mellan genuttrycket profilen för en viss gren och eventuell känslighet för cerebrovaskulära diseases, såsom hjärnaneurysm. Sådana metoder kan ge en förklaring till varför vissa ACA anatomiska och genetiska variationer är korrelerade med en högre prevalens av ACA aneurysm. Denna dissektion kräver tryck utövas med pincett vid basen av varje specifik gren, att skilja den från andra branscher, i början av kon isoleringsproceduren.
Således, förutom att göra det möjligt att härleda celler från kon 10 eller för att screena för genuttryck 11 och proteinproduktion 12 eller posttranslationella proteinmodifieringar, denna metod kan användas för ex vivo-studier, genom att helt enkelt anpassa organbadet system utvecklat för isolerad mus lukt artärer. 7 efter inkubation av hela ko i odlingsmedium innehållande antibiotika, kan secretome släpptes av denna specifika struktur erhållas och analyseras. En analys av denna secretome i musmodeller av CAA skulle göra det possible, till exempel för att bestämma CAA relaterade inflammatoriska statusen för dessa cerebrala artärer. Den resulterande konditionerat medium skulle också kunna användas för att bestämma effekterna av den secretome på varje kärlvägg celltyp fenotyp. Patologiska ko beredningar skulle också kunna användas för att identifiera eventuella skillnader i biokemiska signaler, såsom cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP), cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP), eller Ca2 + koncentrationer, detekterbara med fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) -baserade biosensorer. Virus levererade biosensorer har använts på hjärnan skiva preparat som innehåller experimentellt tillgängliga mogna levande nervceller med en bevarad morfologi, vilket ledde till upptäckten av stora skillnader i D1 svar mellan de pyramidala kortikala neuroner och striatala medel taggiga neuroner. 13
Modelleringen av cerebrovaskulära sjukdomar i transgena möss som uttrycker FRET-baserade andra budbärare sensorproteiner 14för avbildning av biokemiska signaler i den isolerade ko bör vidare ge ytterligare insikt i biokemi, patofysiologi och farmakoterapi av dessa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Paris VI University och en Pierre Fabre Innovation bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors - Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
- Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
- Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
- Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
- Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
- Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
- Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
- Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
- Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
- Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
- Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
- Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
- Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
- Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
- Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).
