Abstract
Den cerebral arteriel cirkel (Circulus arteriosus cerebri) eller kreds af Willis (CoW) er en kredsløbssygdomme anastomose omkring optiske chiasma og hypothalamus, der leverer blod til hjernen og de omkringliggende strukturer. Det har været impliceret i flere cerebrovaskulære lidelser, herunder cerebral amyloid angiopati (CAA) associeret vaskulopatier, intrakraniel aterosklerose og intrakranielle aneurismer. Undersøgelser af de molekylære mekanismer bag disse sygdomme til identifikation af nye lægemiddelkandidater til forebyggelse kræver dyremodeller. Nogle af disse modeller kan være transgene, mens andre vil involvere isolering af det cerebro-vaskulære gebet, herunder CoW.The her beskrevne fremgangsmåde er velegnet til CoW isolering i nogen mus afstamning og har et stort potentiale for screening (ekspression af gener, proteinproduktion, posttranslationelle protein modifikationer, secretome analyse, etc.) undersøgelser af de store skibe med musen cerebralekar. Den kan også anvendes til ex vivo undersøgelser, ved at tilpasse organbadet system udviklet for isolerede mus olfaktoriske arterier.
Introduction
Den cerebral arteriel cirkel (Circulus arteriosus cerebri), også kendt som kredsen af Willis (CoW), løkke af Willisor Willis polygon) blev først beskrevet af Thomas Willis i 1664. Det er en kredsløbssygdomme anastomose placeret omkring den optiske chiasma og hypothalamus, der kan betragtes som et centralt knudepunkt tilfører blod til hjernen og omgivende strukturer. Blod ind denne struktur via den interne carotis og vertebrale arterier, og det strømmer ud af cirklen via den indvendige midten og posteriore cerebrale arterier. Hver af disse arterier har venstre og højre grene på hver side af cirklen. Basilar, post kommunikerer, og anterior kommunikerer arterier komplet cirklen (figur 1 og figur 2). Risikoen for nedsat blodgennemstrømning i nogen af de udadgående arterier minimeres ved sammenlægning af blod ind i cirkel fra carotis og cerebrale arterier, hvilket sikrer, at tilstrækkelig blod tilføres til Bregn. Denne struktur fungerer også som den vigtigste rute for sikkerhedsstillelse blodgennemstrømningen i alvorlige okklusive sygdomme i det indre halspulsåre.
Flere typer af cerebrovaskulære sygdomme har deres oprindelse i koen. De mest almindelige er cerebral amyloid angiopati (CAA) associeret vaskulopatier, intrakraniel aterosklerose og intrakranielle aneurismer. 1, 2, 3 Disse lidelser kan føre til hypoperfusion grund vasodilation, og intracerebral og / eller subaraknoidal blødning i sidste ende omsætte til iskæmiske eller hæmoragisk slagtilfælde eller i bedste fald en forbigående iskæmisk anfald. Nylige fremskridt i diagnostiske procedurer, herunder Neuroimaging, eventuelt kombineret med angiografi, har gjort det muligt at diagnosticere disse store cerebrovaskulære sygdomme klinisk, uden behov for en hjerne biopsi. Ikke desto mindre er effektive og specifikke behandlinger (farmakologiske eller endovaskulære) øjeblikket mangler, og der er derfor behov for at definere nyemolekylære mål.
Identifikationen af nye lægemiddelkandidater til forebyggelse af disse sygdomme hos mennesker vil kræve dyremodeller og måder at isolere cerebro-kar herunder koen. Sådanne modeller skal fremlægge dokumentation for og spor til de specifikke ændringer, herunder inflammatoriske forandringer, der forekommer i væggene i de store skibe i dyremodeller af intrakraniel arterie aneurisme, CAA eller intrakraniel åreforkalkning. 4, 5, 6
Vi har etableret en metode til mus CoW isolation for at lette undersøgelser af fartøj betændelse i Alzheimers sygdom (AD) og relaterede sygdomme, såsom CAA. Denne metode til isolering af muse koen blev udviklet til vurdering af inflammatoriske cerebrovaskulær genekspression under sygdomsprogression. Sammen med påvisningen af amyloid beta deponering inden væggene af leptomeningeal og pial arterier, kunne denne metode gør det lettere at afskrækkemine det mulige forhold mellem inflammatorisk genekspression i cerebro-kar væg og Ap-peptid akkumulation. Det vaskulære netværk i hjernen, herunder leptomeningeal og pial i subarachnoidealrummet, er en udvidelse af de store arterier danner kredsen af Willis. Den her beskrevne metode kan anvendes til at isolere CoW enhver muse afstamning og kan anvendes til alle typer af screening (fx genekspression, proteinproduktion og posttranslationelle protein modifikationer) på de store fartøjer af muse cerebro-vaskulære gebet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med EF-standarder for pasning og anvendelse af forsøgsdyr, med godkendelse af den lokale etiske komité for dyreforsøg (Ile de France-Paris-udvalget, Authorization 4270).
1. Anæstesi
- Indgyde en dødelig dosis af pentobarbital (op til 1 mg / 10 g legemsvægt) intraperitonealt (27-gauge nål og 1 ml sprøjte) i voksne mus før operation.
2. Fartøjets Perfusion
BEMÆRK: Der er ingen grund til at anvende dyrlæge salve til øjnene under fartøj perfusion. Denne procedure er hurtig (5-10 minutter), og slutter i dyrets død. Bekræft manglende reaktion med en tå knivspids.
- Brug af iris saks, lave et snit, omkring 4 cm lange, i maveregionen og bughinden, lige under brystkassen.
- Lave et lille snit (nogle få millimeter dyb) i mellemgulvet og derefter continue snittet af membranen langs hele længden af ribben bur for at blotlægge pleurahulen.
- Løft brystbenet væk og klemme spidsen af brystbenet med arterieklemmen; placere arterieklemmen på halsen. trim omhyggeligt fedtvæv forbinder brystbenet til hjertet.
- Passere 15-gauge perfusion nål gennem den venstre ventrikel ind i hjertespidsen.
- Endelig kan du bruge en saks til at klippe en af leveren lapper til at oprette en stikkontakt.
BEMÆRK: En alternativ afsætningsmulighed kan skabes ved hjælp af iris saks til at skabe et snit til højre atrium. - Perfundere dyret med 25 til 50 ml phosphatbufret saltvand (PBS) med en pumpe drives ved en hastighed på 2,5 ml / min. Leveren skal blanchere som blodet er erstattet med PBS.
- Efter ca. fem minutter, når fluidet fra leveren er fuldstændig klar, stoppe perfusionen.
- Hvis der er planlagt immunofarvning eller almindelig farvning, perfundere dyret med 50 ml paraformaldehyd(PFA; 4% i PBS) i 15 min.
BEMÆRK: Forsigtig, PFA dampe er giftige. Perfusion af dyret med PFA bør udføres i et ventileret stinkskab.
3. Isolering af hjernen og Circle of Willis
- Isolering af hjernen
- Fjern hovedet med et par kirurgiske sakse.
- Foretag en midtlinjeincision med iris saks, langs huden fra halsen til næsen.
- Skær huden for at eksponere kraniet og fjerne eventuelle resterende muskler og fedtvæv med iris saks.
- Anbring den skarpe ende af iris saks ind i foramen magnum på den ene side og omhyggeligt skub dem langs den indre overflade af kraniet til den ydre øregang (også kendt som øregangen).
- Reproducere snittet beskrevet i 3.1.4 på den kontralaterale side og gøre en midtlinje skåret langs den indre overflade af den inter-parietal knogle til starten af den sagittale sutur.
- Plant irissaks i den frontale knogler, lige mellem øjnene, i det sagittale sutur og derefter åbne dem at opdele kraniet i to.
- Løft hjernen, opsigtsvækkende olfaktoriske pærer og bruge iris saks at afskære nerve forbindelser på dens ventrale overflade.
- Fjern hjernen og læg den i en 60-mm petriskål indeholdende iskold PBS for rå isolation. Helt fordybe hjernen i PBS. Hvis hjernen blev fikseret med 4% PFA (til efterfølgende sektionering og immunfarvning eller almindelig farvning), holde det i et bad af 4% PFA ved 4 ° C i 24 timer.
- Isolering af kredsen af Willis
BEMÆRK: En dissektionsmikroskop er påkrævet for CoW isolation. Hjernen bør opbevares ved 4 ° C under hele proceduren.- Sæt hjernen på hovedet (dvs. på dens dorsale overflade) til at visualisere koen.
- Brug en lille pincet til at få fat i de forreste cerebrale arterier (ACA) i bunden af de olfaktoriske lapper (
- Brug de skarpe ender af pincet til at løfte og fjerne de store arterier, der danner koen fra cortex.
- Løft starten af de posteriore kommunikere arterier (PCA) for at afbryde dem fra hjernen, ved at gribe de midterste cerebrale arterier (MCA) med tangen. Saml de forreste arterier (ACA og MCA) og træk dem forsigtigt over den optiske chiasm i en anterior-dorsal retning. For at undgå forstyrrelser af ko, afbryde proceduren til at beskæftige sig med de andre arterier.
- Gentag trin 3.2.2 og 3.2.3 for de overlegne og posteriore cerebellare arterier (SCA) / (PCA) (c, figur 1) og for det basilar arterie (BA) (d, figur 1), trække dem i en dorsal- anterior retning. Stopper ved slutningen af fremgangsmåden beskrevet in 3.2.4.
- Fjern hele CoW ved at trække forsigtigt med pincet. Placer ko i en 60-mm petriskål fyldt med iskoldt PBS og fjerne eventuelle resterende knyttet hjernevæv med to pincet, holder koen på plads med små ben.
- Hold høstet ko ved -80 ° C til efterfølgende bearbejdning til RNA-oprensning (RNA ekstraktionsudbytterne store mængder RNA - ca. 500 ng) eller protein ekstraktion.
Bemærk: Koen kan opretholdes ex vivo i 24 timer, ved at tilpasse orglet bad system udviklet til isolerede mus olfaktoriske arterie 7.
Figur 1: Skematisk diagram af en ventrale View af Mouse Brain Fremhævning koen koen er dannet af de to interne halspulsårer (MCA), som er afledt af de to forreste cerebrale arterier (ACA);. basilararterie (BA) filialer i den bageste (PCA) og overlegen (SCA) cerebrale arterier, og to vertebrale arterier (VA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBS-perfunderet mus bliver dræbt, og koen er isoleret som beskrevet i afsnit 3.2 i protokollen. Når dissektion udføres korrekt, bør koen kommer ud i et stykke og skal være lidt gennemsigtig på grund af fraværet af tilbageværende blod i karrene.
Figur 2: Mus CoW efter Isolation. (A) Oversigt over ko i en 10 cm petriskål. (B) Nærmere oplysninger om de forskellige grene af koen. MCA for mellemledere cerebrale arterier, ACA for anteriore cerebrale arterier, BA for basilar arterie, PCA for bageste cerebrale arterier og SCA for overlegne cerebrale arterier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Niveauer af mRNA kan vurderes ved RT-qPCR med normalisering i forhold til en reference gentranskript (her, den for GAPDH). Typiske resultater er vist i figur 3A og B.
Figur 3:. Expression af neuronal og kontraktile gener i mus Circle of Willis og Brain De RT-qPCR resultater blev normaliseret mod dem for en reference gen (GAPDH). De er udtrykt som middelværdien ± SD af 6 til 12 uafhængige forsøg; Sammenligning af ko med hjernen: ns, ikke signifikant, *, P <0,05, ** P <0,005, og ***, P <0,001 (A) Ekspression af kontraktile gener:. SMA (glatmuskelactin), smoothelin, SM-MHC (glat muskulatur-myosin tung kæde 11) og E-selectin (B) Ekspression af neuronale gener:. Mog (myelin oligodendrocyt glycoprotein) og Map2 (mikrotubulus-associeret protein 2).
Ekspressionsmønsteret for den endotel markør E-selectin i hjernen mangler Koen er meget lig den, der opnås for rå prøver, hvilket muligvis afspejler eksistensen af en hjerne kapillær netværk. Tabel 1:. Mean overgangssted for ekspression af neuronal og kontraktile gener i mus Circle of Willis og Brain Beregningerne er baseret på en sammenligning af den præcise cyklus bestemmes af overgangssteder (CP) på et konstant niveau af fluorescens. Overgangsstedet er cyklussen nummer, der svarer til den maksimale anden afledede af amplifikationskurven. Højere Cp værdier er forbundet med lavere niveauer af udtryk. For et givet gen, er ekspression for at være upåviselig hvis CP overstiger 35. (A) Cp af referencen genet: GAPDH; og af kontraktile gener: SMA, smoothelin, SMMHC og E-selectin (B) Cp af referencen genet:. GAPDH; og neuronale gener: Mog og Map2. EN. Mean Cp GAPDH SMA Smoothelin SM-MHC E-Sel Betyde SD N Betyde SD N Betyde SD N Betyde SD N Betyde SD N Ko 20.86 0,93 12 22.02 0,67 12 25.29 1,89 12 23,37 0,80 12 30,56 1,66 12 Hjerne 18.71 0,72 6 33,91 2,06 6 31.08 3.17 6 26.05 0,73 6 28.45 0,63 6 B. <td> Mean Cp GAPDH Mog MAP2 Betyde SD N Betyde SD N Betyde SD N Ko 21.04 0,41 6 32.13 1,63 6 30,21 0,85 6 Hjerne 19.09 0,49 6 26,43 0,88 6 23.30 0.99 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en reproducerbar protokol til isolering af kredsen af Willis. De mest almindelige cerebrovaskulære lidelser, der involverer koen er CAA-associerede vasculopatier, intrakraniel åreforkalkning og intrakranielt aneurisme, som alle påvirker væggene i blodkar. Risikofaktorerne er velkendte, men den molekylære patogenese af disse cerebrale lidelser stadig dårligt forstået og specifikke biologiske markører til at forudsige deres forekomst mangler. Der er stor interesse for metoder til isolering koen fra transgene mus til at linke makroskopiske observationer med molekylære ændringer. For eksempel ved at inducere konsistente aneurismer i en musemodel, hvori et bestemt gen slås ud (som beskrevet af Hosaka et al. 8) og analysere ko, bør det være muligt at bestemme, om behandlinger rettet mod proteinet kodet af dette gen kunne forebygge intrakranielle aneurismer og / eller subaraknoidal blødning. Obviously kunne denne fremgangsmåde også anvendes til at analysere effekten af et bestemt lægemiddel på progression af CAA-associeret vasculopatier i de forskellige transgene musemodeller for AD.
Det er lettere at isolere muse arterier end at rense hele muse mikrokar, men sådan prøveudtagning er imidlertid vanskeligere i mus end i rotter. Faktisk er rotte CoW indlejret i meget stivere meninges, hvilket gør det muligt at isolere hele strukturen på én gang. Ud over problemet med den lille størrelse af fartøjer i mus, denne procedure er også vanskelig på grund af gennemsigtigheden af de fartøjer, efter deres perfusion med PBS før fjernelsen af hjernen. Vi anbefaler derfor at praktisere uden infusion, begyndende fra trin 3 efter anæstesi for at gøre det lettere at skelne blodkarrene. Endelig, som mus cerebrale kar er meget fint og knækker let, at dissektion skal udføres meget omhyggeligt, uden farende, for at sikre, at hele strukturenisoleres i et stykke, ved først at tage fat i ACA. Renheden af CoW præparat kan evalueres ved at sammenligne niveauerne af ekspression af de neuronale og fartøjets gener. Med praksis, en enkelt CoW giver kun tilstrækkelig RNA for studiet af 5 - 10 genekspressioner. For storstilet screening bør flere mus køer samles.
Gauthier et al. 9 beskrevet en fremgangsmåde til isolering små stykker af mikrokar (baseret på anvendelsen af collagenase / dispase at fordøje fragmenter af hjernen og af glasperler til fælde dem), som giver glatte muskulatur eller endotelceller, der kan opretholdes i kultur, når anbringes i et passende medium. Fordelen ved vores metode er, at den isolerer store skibe, uden at ændre fartøjets struktur. Dissektion af specifikke grene af koen kan også være af interesse, for at bestemme korrelationen mellem genekspressionsprofilen af en bestemt gren og eventuel modtagelighed for cerebrovaskulære diseases, såsom hjerne-aneurisme. Sådanne tilgange kan give en forklaring på, hvorfor nogle ACA anatomiske og genetiske variationer er korreleret med en højere forekomst af ACA aneurismer. Denne dissektion kræver tryk, der skal udøves med pincet ved bunden af hver specifik gren, at dissociere det fra de andre grene, ved starten af koen isolation procedure.
Således, ud over at gøre det muligt at udlede celler fra koen 10 eller til at screene for genekspression 11 og proteinproduktion 12 eller posttranslationelle protein modifikationer, denne metode kan anvendes til ex vivo-undersøgelser, ved blot at tilpasse organbadet systemet udviklet til isoleret muse olfaktoriske arterier. 7 efter inkubering af hele ko i dyrkningsmedium indeholdende antibiotika, kan opnås og analyseres secretome frigivet af denne specifikke struktur. En analyse af denne secretome i musemodeller for CAA ville gøre det possible, for eksempel for at bestemme CAA-relaterede inflammatorisk status for disse cerebrale arterier. Det resulterende konditionerede medium kunne også anvendes til at bestemme virkningerne af den secretome på hver karvæggen celletype fænotype. Patologiske COW præparater kunne også anvendes til at identificere eventuelle forskelle i biokemiske signaler, såsom cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP), cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) eller Ca2 + koncentrationer detekterbare med fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) -baserede biosensorer. Virus-leveret biosensorer er blevet brugt på hjernens slice præparater indeholdende eksperimentelt tilgængelige modne levende neuroner med et bevaret morfologi, hvilket fører til påvisning af afgørende forskel D1 respons mellem de pyramideformede kortikale neuroner og striatale medium piggede neuroner. 13
Modelleringen af cerebrovaskulære sygdomme i transgene mus, der udtrykker FRET-baserede anden messenger sensor proteiner 14til billeddannelse af biokemiske signaler i den isolerede koen skulle yderligere give yderligere indsigt i biokemi, patofysiologi, og farmakoterapi af disse sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Paris VI University og en Pierre Fabre Innovation tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors - Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
- Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
- Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
- Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
- Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
- Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
- Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
- Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
- Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
- Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
- Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
- Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
- Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
- Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
- Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).
