Summary
Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie.
Abstract
Thymic Auswahl erfolgt in einem einzigartigen und Thymus - Mikro hoch organisierte was zur Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerante T - Zell - Repertoires. In - vitro - Modellen T - Linie Engagement und Entwicklung zu studieren , haben wertvolle Einblicke in diesen Prozess. Jedoch fehlt es diesen Systemen die vollständige dreidimensionale thymic milieu notwendig T - Zell - Entwicklung und sind daher unvollständig Approximationen in vivo Thymus - Selektion. Einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit Modellierung T - Zell - Entwicklung kann durch die Verwendung in situ Modelle überwunden werden , die eine intakte Thymus - Mikroumgebung schaffen , die vollständig Thymus Auswahl der Entwicklung eines T - Zellen unterstützt. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen ergänzen in - situ - Techniken existieren. Thymus-Scheiben, die Integrität der Thymus kortikalen und medullären Regionen erhalten und eine Plattform Entwicklung von überlagerten Thymozyten einer definierten Entwicklungsstadium oder endogener T c zu studierenells innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Aufgrund der Fähigkeit, ~ 20 Scheiben zu erzeugen pro Maus, präsentieren Thymus-Scheiben einen einzigartigen Vorteil in Bezug auf Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Experimenten. die Vielseitigkeit dieses Verfahren weiter verbessert die relative Leichtigkeit thymic Scheiben und Potential bei der Erzeugung von verschiedenen Thymus Subsets oder andere Zellpopulationen aus verschiedenen genetischen Hintergründen zu überlagern. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben, Isolierung und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die durchflusszytometrische Analyse. Dieses System kann auch als auch visualisieren Thymozyten Migration, Thymozyten-stromal Zell-Wechselwirkungen und TCR-Signale mit Thymus Auswahl durch Zwei-Photonen-Mikroskopie assoziiert zu studieren nicht-konventionellen T-Zell-Entwicklung angepasst werden.
Introduction
T - Zellen differenzieren durch eine Reihe von Entwicklungs Intermediate in den Thymus während welcher Zeit sie mehrere Prüfpunkte auftreten, die die Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerant T - Zell - Repertoire 1-3 gewährleisten. Positive Selektion fördert das Überleben von Thymozyten mit T - Zell - Rezeptoren (TCR) in der Lage zu erkennen, mit geringer bis moderater Affinität, Peptid durch Haupthistokompatibilitätskomplex - Moleküle (MHC) auf die kortikale Thymusepithelzellen (cTEC) 2,3 dargestellt. Negative Selektion und regulatorischen T (T reg) Zellentwicklung trägt zur Schaffung der Selbsttoleranz über die Eliminierung oder Abzweigung von Thymozyten , die stark auf Selbst Peptid reagieren presented by MHC 2,4. Unreife CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Thymozyten TCRs exprimieren, die den Auswahlprozess unterscheiden sich zu reifen T - Zell - Subpopulationen, die meisten davon sind MHC - Klasse - I-restringierte CD8 + zytotoxische passierenoder MHC - Klasse - II-restringierten CD4 + Helfer einzigen positiven (SP) T - Zellen, bevor die Thymusdrüse austretenden Effektor - Funktionen in den sekundären lymphatischen Organen 1-3 auszuführen.
Zusätzlich zu der Komplexität der T - Zell - Entwicklung ist die dynamische Migration und zelluläre Begegnungen von Thymozyten ganzen Stromazellen Netzwerk 5-9 entwickeln. Diese Stromazellen spielen verschiedene Rollen in Thymozyten Entwicklung und zwischen den Thymus kortikalen und medullären Regionen unterschiedlich verteilt , in denen positive und negative Selektion 10 auftreten. Obwohl positive Selektion in erster Linie in der Rinde nimmt, gibt es vermehrt Hinweise, dass DP Thymozyten zur Medulla migrieren und weiterhin TCR-Signale zu verlangen, bevor sie sich zu reifen T-Zellen differenzieren was darauf hindeutet, dass die Medulla notwendig, zusätzliche Signale für die Fertigstellung der positiven Selektion und Abstammung liefern kann Differenzierung 11,12. Des Weiteren,Erleichtern Deletion autoreaktiver Thymozyten 13,14 trotz der Anwesenheit von spezialisierten Mark Thymus - Epithelzellen (mTEC) , die und Gegenwart gewebe beschränkt Antigene exprimieren, ein großer Teil der negativen Selektion auftritt in der Hirnrinde in Reaktion auf ubiquitär exprimierten Selbst Peptid präsentiert von dendritischen Zellen 15,16. So müssen genaue Modelle der T-Zell-Entwicklung stellen eine äußerst Thymus Mikro organisiert, mit intakter Rinde und Mark Regionen, die die Interaktion zwischen Thymozyten und Stromazellen erleichtert und unterstützt thymocyte Migration, da diese Zellen positive und negative Selektion unterzogen werden.
Zur Ergänzung der ex vivo - Analysen von Thymozyten als Mittel zum Studium positive und negative Selektion, eine Reihe von in vitro, in situ und in vivo Modelle der T - Zellentwicklung wurden 17-22 entwickelt. Es war notorisch schwierig zu rekapitulierenpositive Selektion in vitro, aber Co - Kultur von Stammzellpopulationen oder T - Zell - Vorläufer mit Stromazellen Notch - Liganden exprimieren, insbesondere OP9-DL1 / 4 - Zellen, hat die Fähigkeit , T - Linie Engagement und begrenzte positive Selektion macht es einen unschätzbaren in - vitro - Modell zu unterstützen, Studie T - Zell - Entwicklung 23-25. Einschränkungen dieses Systems gehören jedoch die Tatsache, dass diese Zellen die einzigartige Peptid Maschinen für die Verarbeitung fehlt in Thymus-Stroma-Zellen und die dreidimensionale Thymus-Mikroumgebung gefunden.
Obwohl technisch umständlich, in situ und in - vivo - Modellen von Thymus - Auswahl einige der Barrieren in Bezug auf in - vitro - Systemen zu überwinden. Reaggregieren Thymus - Organkulturen (RTOC) enthalten Mischungen von Thymozyten und Thymus - Stroma - Zellen 18,26,27 definiert. Diese Thymus-Epithelzellen-reaggregates halten MHC-Klasse-I und II-Expression und developme unterstützennt beider herkömmlichen Zelluntergruppen T, aber immer noch kortikalen und medullären Strukturen nicht ausreichend definiert. Fötalem Thymus - Organkultur (FTOC) ist ein beliebtes Modell der T - Zell - Entwicklung , die mit Thymozyten über hanging-drop Kultur lymphodepleted Thymus Lappen oder durch Injektion von Thymozyten in lymphoreplete thymic Keulen und unterstützen effiziente Entwicklung von CD4 + und CD8 + T ausgesät werden können Zellen im Laufe der Zeit in Kultur 18,28-31. Bei Beginn der Kultur von fötalen Thymus Lappen gibt es einen Mangel von mTEZ, aber definierten kortikalen und medullären Strukturen können im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von Bedingungen zu entwickeln. Eine wichtige Überlegung ist, dass dieses Modell bevorzugt im Vergleich zu Erwachsenen-T-Zell-Entwicklung fötalen unterstützen. Schließlich ist intrathymischen Injektion von definierten Thymus-Vorstufen in erwachsenen Mäusen technisch anspruchsvoll, aber stellt klar, eine Umgebung zu unterstützen T - Zell - Entwicklung in vivo. Diese in situ und in - vivo - Modelle sind hervorragende Werkzeuge to Studie T-Zell-Entwicklung und ihre Verwendung sollte an einem Experiment-by-Experiment Basis betrachtet werden.
Thymus - Scheiben haben sich jedoch heraus kürzlich als vielseitiges, komplementärer Modell thymic Auswahl in situ mit der Möglichkeit zu untersuchen einzigartig, komplex aufzunehmen, und in der Regel einen höheren Durchsatz Experimenten. Thymus - Scheiben , die Integrität der kortikalen und medullären Regionen zu erhalten und einen Rahmen von Stromazellen bereitzustellen , die Thymozyten Migration während der Entwicklung sowie effiziente positive und negative Selektion 11,32-39 unterstützt. Thymocyte Subsets oben auf Thymus - Scheiben wandern in das Gewebe und in die entsprechenden Mikroumgebungs Nische 34,37 hinzugefügt. Das überlagerte Thymozyten aus Thymus-slice endogene Zellen über kongenen Marker oder Fluoreszenzmarkierungen unterschieden werden und kann in Kultur für mehrere Tage aufrechterhalten werden. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen können verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu studierenvon T-Zell-Entwicklung, einschließlich Thymus-Selektion, Thymozyten Verhalten (Migration und zellulären Wechselwirkungen) und Thymocyten-Lokalisierung, unter anderem. In Anbetracht der Fähigkeit ~ 20 Thymus - Scheiben zu erzeugen pro Maus, ist die Skalierbarkeit von Experimenten im Allgemeinen größer als andere in situ Modelle von Thymus - Auswahl. Obwohl die Herstellung von Thymus slices spezialisierte Ausrüstung erfordert, wie dem Vibratom und die Lebensdauer der Thymus-Scheiben in Kultur begrenzt ist, zu einem Verlust von Zellen im Laufe der Zeit über den Zelltod aufgrund und das Fehlen einer einkapselnden Membran bereitzustellen thymic Scheiben ein ausgezeichnetes Modell zur Analyse von Thymus Auswahl von synchronisierten Populationen von Thymozyten innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Herstellung von Thymus-Scheiben (einschließlich Ernten des Thymus, Agarose Einbettung von Thymus Lappen und Vibratom Schnitte des eingebetteten Gewebe), Isolation und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die Durchflusszytometrie-Analyse.
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Protocol
Hôpital Maisonneuve-Rosemont - Protokolle für alle Tierstudien wurden von der Animal Care Committee am Centre de recherche genehmigt.
1. Die Ernte Maus Thymus für Herstellung von Thymus-Scheiben und Einzelzellsuspensionen
- Euthanize die Maus mit CO 2 durch Genickbruch folgte.
- In einer Laminar-Flow-Haube, Pin mit der Maus Bauchseite zu einer Dissektion Brett. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Entfernen überschüssigen Alkohols durch Abtupfen mit Gaze ethanol vom Eintritt in den Brusthöhle zu verhindern und um das Gewebe zu beschädigen.
- Heben Sie die Haut an der Unterseite des Brustbeins mit einer Pinzette und einen Schnitt durch die Haut. Erweitern Sie den Schnitt der Haut nach oben in jedem forelimb.
- Machen Sie einen zusätzlichen Schnitt an der Basis des Brustbeins die Membran aus dem Brustkorb zu trennen. Dann schneiden Sie jede Seite des Brustkorbs in Richtung des Schlüsselbeins. Klappen Sie den Brustkorb über in Richtung des Kopfes der Brusthöhle ausgesetzt wird. Die beiden LappenThymus liegen auf der Oberseite des Herzens.
- Entfernen Sie das Bindegewebe um den Thymus Lappen mit einer Pinzette, Mikro-Dissektion Schere und / oder scharf gebogenen Schere. Verwenden Sie ein Paar feine Spitze gebogenen Pinzette die einzelnen Lappen zu heben von unten oder über Bindegewebe bleiben.
Hinweis: Verwenden Sie nicht den Thymus direkt erfassen. - Legen Sie die Thymus Lappen in einem 15 ml konischen Röhrchen mit PBS und beiseite stellen auf Eis, bis sie benötigt.
2. Agarose Embedding und Vibratom Aufschneiden von Thymic Lobes
- Bereiten Sie 4% igen Lösung für die Einbettung durch Lösen von 2 g mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in 50 ml sterilem PBS und microwaving auf eine niedrige Einstellung, bis die Agarose vollständig gelöst hat. Decken Kolben mit Alufolie und in einem Wasserbad bei 55 ° C bis zur Verwendung.
- In einem Gewebekulturabzug, herzustellen vollständigem RPMI-1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum (FBS), 4 mM L Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin enthält, und 10 & mgr; M2-Mercaptoethanol.
- 1,5 ml vollständiges RPMI-1640-Medium pro Vertiefung zu einer 6-Well-Zellkulturplatte und legen einen Zellkultureinsatz in jeder Vertiefung. Stellen Sie den Teller zur Seite in einem Inkubator bei 37 ° C, bis sie benötigt.
- Bereiten Sie einen matschigen Eiswasser-Bad mit Wasser und Eis in einem Eiskübel.
- Entfernen Sie vorsichtig alle restlichen Bindegewebe um jede feine Spitze Pinzette Thymus Lappen. Tun Sie dies, während der Thymus Lappen in PBS in einer Gewebekulturschale eingetaucht ist, nach der Übertragung auf ein Gewebe mit PBS getränkten Wischtuch, oder unter einem Binokular.
- Lassen Sie die Agarose unter 40 ° C abkühlen, wenn der Kolben nur warm anfühlt ist, zu vermeiden, dass die Gewebe Überhitzung. Gießen des abgekühlten 4% Agarose in eine Gewebeform bis zu einer Höhe von ca. 1 cm.
- Verwenden Sie ein Paar Pinzette vorsichtig den Thymus Lappen auf ein Gewebe übertragen wischen und rollen Sie sie vorsichtig, um zu trocknen, ohne das Gewebe zu schädigen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe trocknet vollständig oder es wird aus dem Agarose gleiten während des Schneidens.
- Schieben Sie die Lappen in die Agarose und positionieren sie entweder horizontal (zur Erhöhung der Oberfläche jeder Scheibe) oder vertikal (zur Erhöhung der Anzahl der Scheiben) am unteren Ende der Form. Legen Sie die Form in Eiswasser für 5-10 min die Agarose zu ermöglichen, sich zu verfestigen.
- Während dieser Zeit bereiten die Vibratom zum Schneiden von Pufferwanne Montage, die Montage des Objektplatte und Einsetzen des Vibratom Klinge. Legen Sie ein Stück Labor Band auf der Probenscheibe. Sterilisieren Sie die sauber, montiert Arbeitsplatz mit 70% Ethanol.
- Nachdem die Agarose erstarrt, invertieren die Form und drücken Sie sanft in seiner Mitte die Agarose eingebettet Lappen freizugeben.
- Mit einem scharfen Messer die überschüssige Agarose rund um die Lappen zu verlassen ~ 2 mm Agarose zu trimmen auf jeder Seite und ~ 0,5 cm an der Unterseite.
- Sichern Sie sich Agaroseblock mit einem Tropfen Gewebekleber auf das Stück Klebeband auf der Probenscheibe. Mehrere Blöcke können auf das Band geklebt werden.
- Richten Sie die Vibratom Klinge with die Spitze des Agaroseblock. Füllen Sie den Pufferwanne mit sterilem PBS, bis die Klinge und Agarose-Block (s) vollständig eingetaucht sind.
- Abschnitt die Agarose eingebetteten Gewebeschnitten mit einer Dicke von 400 bis 500 & mgr; m zu erhalten. Stellen Sie die Vibratom bis 0.225 mm / s Geschwindigkeit, Frequenz von 100 Hz und 5 ° Winkel.
- Verwenden Sie einen gebogenen Spatel die Thymus-Scheiben in eine Gewebekulturplatte mit steriler PBS zu sammeln, wie sie geschnitten werden. Entsorgen Sie die erste und die letzte Scheibe.
- Untersuchen Sie die Scheiben unter einem Lichtmikroskop mit 4-facher Vergrößerung. Wählen Sie die Scheiben mit intakten Thymusgewebes und umgebende Agarose (1A).
- Übertragen Sie die Scheiben auf der Platte vorbereitet in Schritt 2.3 durch eine Pipettenspitze vorsichtig die Thymus-Scheibe aus dem gebogenen Spatel auf die Zellkultureinsatz zu gleiten. Jeder Einsatz kann ~ 3 Scheiben aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben berühren einander nicht oder die Zellkultureinsatz Wände.
- Pflegen Sie die Platte bei 37 ° C, bis sie benötigt.
- Isolieren thymic Keulen wie in 1 beschrieben die Lappen Dissociate manuell eine Einzelzellsuspension unter Verwendung einer sterilisierten 15 ml Gewebemühle mit 5 ml steriler PBS, enthaltend 2% FBS gefüllt zu machen. Übertragen, um die Zellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x ACK - Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA) bei Raumtemperatur für 3 min roten Blutkörperchen zu lysieren.
- Das Rohr wird bis 15 ml mit PBS 2% FBS enthält. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Resuspendieren der Zellen in 10 ml PBS, enthaltend 2% FBS und Pass-Zellen durch ein 255 & mgr; m-Mesh-Filter.
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspendieren des Zellpellets in PBS, enthaltend 2% FBS bei einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen pro ml.
- Beschriften Sie die Zellen mit Zellfarbstoffe wie Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) nach Herstellerprotokolle, wenn nicht Thymozyten von Mäusen, die congenic Markern oder genetisch fluoreszierenden Reporter codiert zu unterscheiden von Scheibe körpereigenen Zellen.
- Nach dem letzten Waschen der markierten Zellen, Zellpellet in komplettem RPMI-1640 - Medium bei 1-3 x 10 6 Zellen pro 15 ul.
4. Übereinander Thymozyten auf den Thymus Scheiben
- rund um die Thymus-Scheiben auf dem Einsatz Verwenden Sie eine Pipette jede Flüssigkeit abzusaugen.
Hinweis: Achten Sie darauf, zu vermeiden, die Agarose zu beschädigen. Wenn die Agarose beschädigt wird, werden die überlagerten Thymozyten nicht durch den Verlust von Oberflächenspannung der Schichtoberfläche anschließen. - Ohne die Scheibe mit der Pipettenspitze berühren, Overlay 15 ul Thymozyten in Abschnitt 3 hergestellt, auf jede Thymus in Scheiben schneiden.
- Inkubieren Sie die plate bei 37 ° C für 2 h, damit die Zellen in die Thymus-Scheiben zu migrieren.
- Nach 2 Stunden, spülen Sie die Thymus-Scheiben 3-mal mit 1 ml PBS Überschuss überlagertem Thymozyten zu entfernen, die noch nicht in das Gewebe gewandert sind.
- Die Platte bei 37 ° C, bis die Thymus-Scheiben bereit sind, geerntet werden, in der Regel 1-72 Stunden je nach Experiment.
5. Die Dissoziation von Thymic Scheiben für die Durchflusszytometrie
- Bereiten Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen für jede Scheibe durch Zugabe von 150 ul PBS, das 2% FBS.
- 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS auf das Gewebekultureinsatz mit den Thymus Scheiben und sanft rühren mit einem gebogenen Spatel die Scheiben von der Oberfläche der Zellkultureinsatz zu lösen.
- Übertragen Sie die Scheibe aus dem Einsatz auf dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem gebogenen Spachtel.
- Manuell stören die Scheibe ein Mikrozentrifugenröhrchen Probe zerstoßen. Zugabe von 150 & mgr; l PBS, enthaltend 2% FBS auf ein Endvolumen von 300ul.
- Filtern Sie das dissoziierte Gewebe durch ein 40 um-Filter in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Die gefilterten Zellen sind bereit für die Durchflusszytometrie - Analyse gefärbt werden 40.
- Filterzellen ein zweites Mal, bevor sie auf einer Flussdurchlass Zytometer um sicherzustellen, daß all die Agarose entfernt und verstopft nicht Durchflusszytometers.
- Erwerben Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer und Analyse von Daten , wie zuvor 40 beschrieben wurde.
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Representative Results
Thymus slices Unterstützung Analyse verschiedener Aspekte der T-Zell-Entwicklung, wie beispielsweise positive und negative Selektion. Für eine erfolgreiche Versuche, die Qualität des Thymus-Scheibe von größter Bedeutung. Somit sollte thymic Scheiben untersucht werden , um die Integrität des Thymusgewebe zu gewährleisten , und dass die Agarose die Thymus - slice (1a Abbildung) intakt umgibt. Oberflächenspannung kann beeinträchtigt werden, wenn die Agarose beschädigt ist eine signifikante Abnahme in der Zahl von Thymozyten zu verursachen, die in das Gewebe wandern. Somit sollte thymic Scheiben mit Angaben der Gewebeschädigung oder Scharten / Risse in der Agarose verworfen werden (1B).
TCR transgenen (tg) Mäuse werden häufig eingesetzt thymic Auswahl zu studieren aufgrund der Expression eines definierten funktionellen TCR auf der Oberfläche eines jeden Thymozyten, die die Frequenz der positiven Selektion über Poly-C steigertlonal Populationen. Um jede Stufe der positiven Selektion zu erfassen, kann die Vorauswahl TCR tg Thymozyten oben auf Thymus - Scheiben überlagert werden, und die Entwicklung von reifen, CD4 + oder CD8 + T - Zellen SP gefolgt im Laufe der Zeit durch Durchflusszytometrie 40. Thymozyten von MHC - Klasse isoliert OT-I TCR tg Rag1-I beschränkt - / - ß2m - / - Mäuse sind an der DP - Stadium vor der Thymus - Auswahl aufgrund der Notwendigkeit von ß2m verhaftet mit zu assoziieren und die MHC Klasse I schwere Kette stabilisieren 41 , 42. Wenn auf ß2m überlagert - / - Thymus - Scheiben, so bleiben die Vorauswahl OT-I TCR tg Thymozyten in der Phase DP und erzeugen keine signifikante CD8 + T - Zellen , SP (2A, links). Wenn im Gegensatz dazu auf WT thymic Scheiben enthält endogene Liganden , die Auswahl, die Fähigkeit dieses Modells überlagert positive Selektion zur Unterstützung wird durch CD8 + T - Zell - Entwicklung bei 72 h (2A, rechts) zeigt. Quantification von CD8 + T - Zell - Entwicklung als Auslesen positive Selektion wird in 2B gezeigt.
Thymus Scheiben können auch zu studieren negative Selektion verwendet werden. Ein großer Anteil der negativen Selektion auftritt in Reaktion auf ubiquitäre Antigen 16. Zur Modellierung negativen Selektion allgegenwärtigen Antigen, total Thymozyten von OT-I TCR tg Rag1 - / - und Wildtyp (WT) Mäuse wurden mit CFSE und CTV markiert, bzw. dann in einem Verhältnis von 1: 1 - Verhältnis und überlagert auf WT Scheiben (3A). Nachdem überschüssiges Thymozyten Abwaschen wurden die Thymus-Scheiben in komplettem RPMI-1640-Medium platziert mit oder ohne 1 nM des artverwandten, Agonistpeptids des OT-I TCR, SIINFEKL (OVA-Peptid). Alle MHC-Klasse-I-Zellen, die das Antigen präsentieren, die Präsentation von ubiquitär exprimierten Antigen im Thymus zu modellieren. Nach 24 h Inkubation bei 37 ° C, wobei der Anteil von OT-I-TCR tg cells (% Live CFSE +) zu WT - Kontrollzellen (% Live CTV +) wurde durch Durchflusszytometrie (3B) verglichen. Eine Abnahme des relativen Anteils von OT-I-TCR tg Zellen darstellt Deletion von OTI TCR tg Zellen als Reaktion auf OVA-Peptid.
Es ist wichtig, dass neben den Zelleintritt in Thymus-Scheiben in der Größe von Thymus-Scheiben aufgrund der Heterogenität zu beachten, sollte man geeignete Analyse und interne Kontrollen sind für diese Variablen zu normalisieren. Hier vermischt WT Zellen mit OT-I-TCR tg Zellen und überlagert oben auf Scheiben wurden als interne Kontrolle verwendet, da diese Population nicht wesentlich durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von OVA-Peptid beeinflusst werden. Das Ausmaß der negativen Selektion von OTI TCR tg Zellen wurde basierend auf Proportionen quantifiziert und nicht als absolute Zahlen. Zuerst wird das Verhältnis zwischen OT-I TCR tg (% leben CFSE +) zu WT (% leben CTV +) Zellen auf jeder WT Thymus - Scheibe in der Gegenwart oder Abwesenheit von OVA-Peptid wurde berechnet. Jede dieser Verhältnisse wurde dann durch den Mittelwert des Verhältnisses geteilt zwischen OT-I - TCR tg (% leben CFSE +) zu WT (% Live CTV +) Zellen auf WT Scheiben in Abwesenheit von OVA - Peptid. Im Durchschnitt 80% der Zellen tg OT-I - TCR wurden in Reaktion auf ubiquitäre Antigen abgereicherten wie in 3C dargestellt.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Thymus - Scheiben von einem vertikal integrierten Thymus Lappen vorbereitet. (A) Gute Qualität Scheibe mit dem eingebetteten Gewebe und umgebende Agarose intakt. (B) Schlechte Qualität Scheibe mit Schäden aufgrund des eingebetteten Gewebe reißen während des Schneidens. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Durchflusszytometrische Analyse der positiven Selektion in Thymus - Scheiben OT-I TCR tg Rag1 - / - ß2m - / - Thymocyten wurden mit CFSE markiert und überlagert auf ß2m nicht Auswahl - / - oder WT Scheiben auswählen. Nach 72 h Inkubation bei 37 ° C wurde CD8 + T - Zell - Entwicklung durch Durchflusszytometrie analysiert. (A) Repräsentative Daten von Zelloberflächen - CD4 und CD8 - Expression auf Live - CFSE + TCR & bgr; hohe Thymozyten von ß2m - / - und WT - Scheiben. (B) Quantifizierung von lebenden CFSE + TCR & bgr; high CD8 + T - Zell - Entwicklung auf WT Scheiben im Vergleich zu nicht-Auswahlsteuerungen. Jeder Punkt steht für eine individuelle Thymus-Scheibe und die Linie stellt den Mittelwert. (*** P <0,001, ungepaarten t-Test)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die durchflusszytometrische Analyse der negativen Selektion in Thymus slices A . 1: 1 - Verhältnis von Gesamt CFSE-markierten OT-I - TCR tg Rag1 - / - und CTV-markiertem WT Thymozyten wurden WT Scheiben in Anwesenheit oder Abwesenheit von dem überlagerten OVA-Peptid SIINFEKL. Nach 24 h Inkubation bei 37 ° C wurden die relativen Anteile von überlagerten Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) Ein Schema des experimentellen Aufbaus eine Überlagerung von CTV-markierten WT - Zellen (blau) zeigt 1: 1 gemischt mit CFSE-markierte OT-I TCR tg Zellen (grün) auf einen WT Thymus - Scheibe in der Gegenwart oder Abwesenheit von OVA-Peptid. (B) Repräsentative Daten zeigt den Anteil der Live - CFSE + OT-ITCR tg Zellen und CTV + WT Zellen aus Scheiben , die mit oder ohne OVA - Peptid inkubiert wurden. (C) Die Daten wurden zwischen Scheiben normalisiert, und das relative Verhältnis von Live - CFSE + OT-I TCR tg Zellen CTV + WT - Zellen leben gezeigt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. N = 3 für jede Bedingung. (* p <0,05, ungepaarten t - Test). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben und repräsentative Ergebnisse effizienter positive und negative Selektion von überlagerten Vorselektion MHC-Klasse-I-restringierten TCR transgene Thymozyten durch Durchflusszytometrie. Dieses System wurde mit ähnlichem Erfolg verwendet , um eine positive Selektion von MHC - Klasse - II-restringierte CD4 + T - Zellen von Vorselektion DP Thymozyten 32 und, in Gegenwart von Agonist - Antigen, negative Selektion und thymic T reg Entwicklung 11,12 unterstützen, 36,38,39,43,44. Dieses Protokoll kann modifiziert werden, Thymus Auswahl in Gegenwart oder Abwesenheit von Inhibitoren zu untersuchen, definierte Peptide sowie genetisch veränderter Thymozyten oder Stroma-Zellpopulationen. Thymic Scheiben sind auch offen für die Überlagerung von Zellpopulationen andere als thymocyte Subsets. Zum Beispiel wurde es vor kurzem, dass dendritische Zellen auf Thymus-Scheiben wandern effizient in das Gewebe überlagert dargestellt und negative selectio unterstützen kannn und T reg Entwicklung 39,43. Bisherige Untersuchungen haben Vorselektion DP oder insgesamt Thymozyten verwendet, um positive und negative Selektion zu studieren. Obwohl T-Zell-Entwicklung für mindestens 4 Tage in Thymus Scheiben gehen kann, interessiert, wenn Versuche mit einer früheren Vorläuferpopulation in initiierende, sollte es berücksichtigt werden, dass eine Beschränkung dieses Systems ist, dass die Qualität der Thymus-Scheiben nach sinken beginnt 1-2 Tagen in Kultur aufgrund von Zelltod und Fehlen einer einkapselnden Membran.
Das Protokoll hierin beschrieben kann auch zur Erzeugung von Scheiben mit subtilen Änderungen aus menschlichem Thymus-Gewebe verwendet werden. Vor dem Einbetten in Agarose, Mensch sollte Thymusgewebes geschnitten in Fragmente werden, etwa die Größe eines erwachsenen Maus Thymus Lappens. Bemerkenswert ist, sind menschliche Thymus-Proben im Bindegewebe reich, und, bezogen auf murine Thymus, ist es schwieriger, gute Qualität Scheiben vorzubereiten. Unserer Erfahrung nach fötalen statt Neugeborenen menschlichenThymusgewebes ist förderlich für Schnittpräparat. Es hat sich gezeigt , dass Untergruppen lokalisieren menschlichen Thymozyten gezeigt korrekt auf menschlichen und Maus - Thymus - Scheiben 37. Thymic Auswahl überlagert menschlichen Thymozyten Subsets, wurde jedoch in der Thymus-Scheibe Modell noch nicht veröffentlicht. Die Effizienz der positiven Selektion von einer polyklonalen Population ist gering, und aufgrund des niedrigen Anteils (~ 0,5-2%) der überlagerten Thymozyten im Thymus slice, kann es schwierig sein, solche kleinen Anzahl von positiv ausgewählten Zellen beurteilen. Es kann sein, möglich, eine menschliche TCR Transgen in humanen T-Zell-Vorläuferzellen einzuführen, bevor auf die menschliche Thymus-Scheiben zu überlagern positive Selektion zur Steigerung der Effizienz. Dies schließt auch nicht die Möglichkeit der Überwachung von Veränderungen in endogene T-Zell-Populationen in der Gegenwart oder Abwesenheit von exogenen Peptiden oder anderen Zellpopulationen und Inhibitoren der TCR-Signale, unter anderen.
Dieses Protokoll kann auch ad seinApted zur Visualisierung von thymocyte Migration, TCR - Signale und zelluläre Interaktionen 12,32-38. Bis vor kurzem haben die meisten Studien von Thymozyten Verhalten in situ auf den Kortex wurde begrenzt , wie die Medulla zentral im Thymus befindet, gerade über der Nachweisgrenze durch Zwei-Photonen - Mikroskopie. Im Gegensatz dazu bieten Thymus Scheiben den einzigartigen Vorteil, dass die Scheiben intakt Thymus kortikalen und medullären Regionen haben und die Scheibenoberfläche ermöglicht den direkten Zugriff auf die Medulla durch Zwei-Photonen-Imaging. Darüber hinaus überlagert thymic Scheiben mit mit Calcium - Indikator - Farbstoffe, wie Indol markierten Zellen verwendet werden können TCR - Signale unter Verwendung von cytosolischen Calciumspiegel als Indikator für die TCR - Signale , die mit positiven und negativen Selektion durch Zwei-Photonen - Mikroskopie 11,32,36 zu überwachen, 38,39,44. Zur Herstellung von Proben für die Mikroskopie, können die Scheiben verwendet werden, direkt nach dem Schritt 4.5 des Protokolls. In diesem Fall sollte darauf geachtet werden, um geeignete Fluoreszenzmarker su zu wählenbringend für die Bildgebung.
Thymic Scheibe Organkulturen sind ein hervorragendes Werkzeug , verschiedene Aspekte der Maus und humanen T - Zell - Entwicklung in situ zu untersuchen. Jedoch erfolgreiche Anwendung dieser Technik erfordert besondere Aufmerksamkeit kritischen Schritte in dem Protokoll. Um die Anzahl der Thymus-Scheiben für die Hochdurchsatz-Experimenten erhalten, das Alter der Maus maximieren verwendet wird, muss über die gesamte Lebensdauer der Maus in Betracht, da die Größe der Thymus Veränderungen getroffen werden. Wir verwenden in der Regel 4-8 Wochen alten Mäusen, die ~ 20 Thymus-Scheiben pro Maus erzeugen. Jedoch können fötale, neonatale oder älteren Mäusen Thymi theoretisch verwendet werden, um eine begrenzte Anzahl von Schichten zu erzeugen, auf den experimentellen Anforderungen des Benutzers abhängig. Für eine gute Qualität Scheiben zu erhalten, ist es von größter Bedeutung alle Bindegewebe rund um die Thymus Lappen vor dem Einbetten in Agarose zu entfernen. Verbleibende Bindegewebe wird durch die Vibratom Klinge während des Schneidens nicht effizient geschnitten und die Thymus beschädigenLappen und die daraus resultierenden Scheiben. Der Großteil des Bindegewebes sollte während Thymus Ernte (Schritt 1.5) und ermöglicht die Lappen aus der Brusthöhle ohne wesentliche Manipulation des Gewebes selbst entfernt werden, entfernt werden. Nachdem die Lappen zu isolieren, entfernen Sie vorsichtig jegliches restliche Bindegewebe, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Darüber hinaus ist das eingebettete Gewebe umgibt die Integrität der Agarose Aufrechterhaltung Notwendigkeit für Thymozyten effektiv auf der Scheibenoberfläche überlagert. Somit ist es wichtig, sowohl den Thymus slice und die umgebende Agarose zu inspizieren, wenn die Thymus-Scheiben für die in dem Experiment Verwendung auswählen. Die Vibratom ist in der Regel außerhalb der Gewebekultur Haube liegt, das potenzielle Risiko einer Kontamination zu erhöhen. Reinigen des Vibratom gründlich zwischen den Experimenten und Sprühen der Arbeitsbereich und Vibratom mit 70% Ethanol vor dem Schneiden kann das Potenzial für eine Kontamination zu begrenzen. Es ist auch wichtig steriles PBS für die Schritte zu verwenden, 2,13 und 2,15, wie in der genannten protokoll. Schließlich ist es auch entscheidend, überlagerte Thymocyten zu unterscheiden, die in das Gewebe von den Zellen migrieren, die in den Thymus endogen sind. Dies kann durch Markieren der Zellen überschichtet mit Fluoreszenzfarbstoffen erreicht werden, wie in Schritt 3.7 erwähnt. Alternativ Thymozyten von Mäusen congenic Marker oder genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter exprimieren , können 45,46 verwendet werden. Im allgemeinen sind jedoch thymic Scheiben leicht zu manipulieren und können an die spezifischen experimentellen Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden, unterstützen breite Anwendbarkeit, die erst begonnen werden, erforscht.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated - T12) | Polyciences | 18986 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200 mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
References
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