Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Geautomatiseerde analyse van Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54359
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University, 2Computing Research and Education Building (CoRE), Rutgers University

Summary

Een efficiënte en eenvoudige methode voor het computer-gebaseerde analyse van nematode zwemmen gedrag in de vloeistof wordt beschreven. De methode vereist weinig tot geen investering voor C. elegans laboratoria. De gebruikte hardware is standaard, en de computer software voor de gedragsanalyse (celest) is een open source is.

Abstract

Ontrafeling van de neuronale en neuromusculaire circuits die gedrag te reguleren blijft een grote uitdaging in de biologie. Het aaltje Caenorhabditis elegans heeft zich bewezen als een onschatbare modelorganisme in het helpen om deze uitdaging aan te pakken, van inspirerende technologische benaderingen, de bouw van het menselijk brein connectoom, om daadwerkelijk licht werpen op de specifieke moleculaire bestuurders van elementaire functionele patronen. Het grootste deel van de gedragsstudies in C. elegans zijn uitgevoerd op vaste substraten. In vloeibare, dieren vertonen gedragspatronen die beweging op verschillende snelheden in 3D, evenals gedeeltelijke lichaamsbewegingen, zoals een achterste krul zonder anterior vormverandering, die nieuwe uitdagingen voor kwantificering voeren omvatten. De stappen van een eenvoudige procedure, en het gebruik van een software die zorgt voor een hoge-resolutie analyse van C. elegans zwemmen gedrag, worden hier gepresenteerd. De software, genaamd Celest, maakt gebruik van een gespecialiseerd computerprogramma dat tracksmeerdere dieren gelijktijdig en voorziet in nieuwe maatregelen van C. elegans motoriek in vloeibare (zwemmen). De maatregelen zijn vooral geworteld in dierlijke houding en op basis van de wiskunde gebruikt in computer vision en patroonherkenning, zonder computationele eisen voor drempel cut-offs. Het computerprogramma kan worden gebruikt om zowel de algehele beoordeling zwemmen bekwaamheid in honderden dieren gecombineerde kleine partij proces, alsmede nieuwe fenotypes zelfs in goed gekarakteriseerde genetische mutanten onthullen. De voorbereiding van de monsters voor analyse met Celest is eenvoudig en low-tech, waardoor grote aanpassing door de wetenschappelijke gemeenschap. Gebruik van de rekenkundige benadering beschreven derhalve bijdragen tot een beter inzicht in het gedrag en gedragsproblemen circuits in de C. elegans model.

Introduction

Het definiëren van hoe genetica, epigenetica, ervaring en milieu invloed gedrag is een belangrijke uitdaging in de moderne biologie. Eenvoudig, genetisch vatbaar modellen die computationeel kan worden gevolgd en gemeten kunnen kritische bijdragen in de richting van dit doel. Het aaltje Caenorhabditis elegans is een dergelijk model. Het doel van dit artikel is om aan te tonen hoe C. elegans zwemmen motoriek kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd om informatie te halen over acht nieuwe kenmerken met biologische relevantie.

C. elegans heeft een relatief korte levensduur van ongeveer 2-3 w en reproductieve periode van ongeveer 4 dagen bij 20 ° C 1,2. In standaard laboratorium culturen, wordt dit microscopische nematode gekweekt op Petri platen die Nematode Growth Media (NGM) die verspreid met een bacteriële voedselbron 3,4. WT N2 dieren actief te bewegen in een elegante sinusvormige golven op-agar gevulde platen; ze veranderen beweging rates bij roaming (voedsel zoekende), woning (browsing), of die herstellen van een maaltijd (inactief verzadiging rust) 5. Impairment 6 of 7-12 kunnen ook drastisch veranderen beweging op platen.

Genen die gedrag moduleren, healthspan of veroudering, kan functioneel worden gekarakteriseerd door het analyseren van C. elegans bewegingspatronen of de motoriek. Een benadering voor healthspan meten is volwassenen ouder worden ingedeeld in drie categorieën (bijvoorbeeld A, B en C) volgens hun voortbeweging op platen met krachtige fysieke activiteit is klasse A en klasse C verlamming waarbij 7,8,13. Hoewel een dergelijke kwalitatieve sorteren is het nuttig om de verschillen in fysieke fitheid te onthullen, de categorieën zijn breed zonder duidelijke grenzen en zo hun scoring is onderhevig aan vertekening experimentator.

Een groeiend aantal trackers hebben de objectiviteit, verfijning verheven, en de precisie van de analyse van C. elegans bewegingop vaste media 14-18. C. elegans voortbeweging op platen wordt meestal beperkt tot het vlak waarin het dier contact met het oppervlak van de media maakt. (C. elegans kan ook exploratie induceren door het opheffen van het hoofd van de rest van het lichaam die nog in contact met een vast oppervlak, het positioneren van het lichaam in verschillende vlakken. Echter, dit gedrag is ongebruikelijk.) Bij plaatsing in vloeibare, deze nematode initieert een golvend beweging, of zwemmen, die meer uitgebreide dimensionale beweging, een groter bereik van de snelheid en de diepte van de beweging, en een verhoogde incidentie met de leeftijd van de anterior bewegen anders posterior beschikt in vergelijking met de dieren op vaste oppervlakken. Als een snelle analyse van de fysieke fitheid en de reactie op nieuwe omgeving, kan een onderzoeker een individueel dier te plaatsen in een vloeibare daling van het thuispubliek de frequentie van het lichaam bochten onder het ontleden scope. Video opname te kunnen huidige en toekomstige bezettingen van het zwembad kracht van het vergemakkelijkendier. Echter beperkt de handmatige benadering het aantal functies die kunnen worden gemaakt, en is volledig beperkt tot het maken van één dier tegelijk.

Locomotion in vloeistof is minder onderzocht dan beweging op vaste media. Inderdaad, er zijn maar weinig software-opties die robuust en eenvoudig te implementeren in het laboratorium om de motoriek in vloeibare 19-24 te meten zijn. De software Celest (C. elegans Swim Test) biedt eenvoud in gebruik en wiskundige-gebaseerde maatregelen die gegevens (kromming scores) leveren direct relevant zijn voor de aard van de beweging 8; (gedetailleerde beschrijving van de kenmerken en voordelen in Restif et al. 8). Bovendien computeranalyse maakt de opheldering van fenotypische kenmerken die onmogelijk het menselijk oog te scoren zijn. Hier, data dat de resolutie van deze analyse aanpak illustreren worden gepresenteerd en een eenvoudig te implementeren protocol te zwemmen proeven op te nemen voor verdere celest analyse wordt beschreven.

Protocol

1. Nematode Groei en Handling

  1. Grow C. elegans op standaard Petri platen met NGM gespot met OP50-1 Escherichia coli als voedselbron 1-3.
  2. Houd kweken in een incubator die de gewenste temperatuur handhaaft. C. elegans groeit goed van 15 tot 25 ° C, waarbij 20 ° C de standaard groeitemperatuur.
    OPMERKING: zwemmen is een robuuste fenotype echter zwemmen kracht kan worden beïnvloed door omgevingsfactoren zoals vervuiling op platen en oververhitting van culturen en glijbanen. Grote inspanningen om een ​​stabiele omstandigheden te handhaven moeten worden gemaakt.
  3. Gebruik een zelfgemaakte nematode pick gemaakt van een platina draad vlam-afgedicht in een glazen staaf om de overdracht van enkele dieren 4 te behandelen.

2. Stel voor Swim Analysis

  1. Een geïntegreerd systeem, bestaande uit een stereomicroscoop, digitale CCD camera en digitale video-opname software. De Celest software can worden op een afzonderlijke computer.
    1. Bedek de microscoop met een donkere doek (bijvoorbeeld, vilt) om verblinding in het zwemmen daling gebied op de microscoop dia te voorkomen en het verbeteren van de beeldkwaliteit.
    2. Stel de microscoop werkafstand en vergroting volle zicht van het zwemmen gebied, en de basis spiegel scherpe contrast van de dieren tegen de achtergrond te krijgen. Stel de verlichting op donkere-veld om de lichamen van de volwassenen te visualiseren als wit tegen de zwarte achtergrond, die zeer goed werkt voor computational visualisatie en het bijhouden van de swim-analyse software.
    3. Zorg ervoor dat het werkgebied, microscoopglaasje te houden, en zwemmen dalen zeer schoon. Puin kan interfereren met de analyse door het afsluiten van het vrij zwemmen volwassenen en dunne draden van vezels kan worden gedetecteerd als nonmoving dieren tijdens het volgen.

3. Animal Voorbereiding voor Analyse van de fysieke fitheid in Liquid

  1. Pipetteer 60 ul of 1x M9 buffer in een 10 mm ring tevoren op een microscoopglaasje. Zorg ervoor dat de druppel volledig dekt de binnenruimte van de ring. De software haalt meer zwemmen informatie met behulp van dit druppelgrootte die op een dia dan wanneer gebruik te maken van platen met meerdere putjes.
  2. Pick alleenstaande nematoden en breng ze in de daling van 1x M9 buffer, het minimaliseren van het transport van bacteriën die de vloeistof kan vertroebelen. Minimaliseren bacteriën door eerst de dieren voor overdracht naar een kant van de plaat die niet veel bacteriële gazon bevat plaatsen, hen te laten kruipen, en dan zachtjes te tillen.
    1. Bij het overbrengen van de nematoden in de druppel Gebruik een dissectie ruimte nabij het analysestation de duur van zwemmen te verminderen, die het gedrag van de dieren 25 kunnen beïnvloeden.
    2. Plaats slechts 4 volwassenen in de daling als ze krachtig bewegen en cross paden vaak. Als leidraad te minimaliseren overlappende zwemmers (die geautomatiseerde analyse verwart), overweeg dan het plaatsen van4 dieren per druppel wanneer ze zijn zo actief als jonge, gezonde WT volwassenen en 5 dieren per druppel als ze ouder zijn en vertonen minder kracht.
      LET OP: Gezonde WT nematoden instinctief beginnen zwemmen snel na in vloeistof wordt geplaatst. Met behulp van een nematode pick voorzichtig scheiden van de volwassenen in de drop als ze klonteren.

4. Analyse van de fysieke fitheid in Liquid - Video-opname van het Zwemmen

  1. Plaats de slede geladen met volwassenen op de basis van de microscoop hun zwemmen opnemen. 30 s video capture gegevens van het gedrag van een individueel dier in vloeibare (Video 1), en bemonstering van een groot aantal van die dossiers is eenvoudig te realiseren wanneer geholpen door Celest software 8,26; echter langere periodes zwemmen kan ideaal zijn voor andere specifieke gedragsstudies 25 zijn. Belangrijk is, zorg ervoor om dezelfde vergroting in alle opnamen te handhaven, omdat vergroting verschillen affect zwemmen analyse en wil vooringenomenheid vergelijking.
    LET OP: Deze stappen zijn bedoeld als leidraad met behulp van de digitale video-opname software in de tabel van Materialen vermeld; VirtualDub open access software kunnen vervangen, hoewel we dit niet hebben getest.
    1. Gebruik de volgende instellingen als leidraad voor een succesvolle zwemmen analyse: beeldgrootte van 696 x 520 pixels, beeldresolutie van 0,02 mm / pixel, en een tarief van 18 frames / s. Hogere resolutie versies van deze instellingen kunnen vergemakkelijken volgen, maar zal geen invloed op de door het programma berekend maatregelen.
      OPMERKING: De zwem zone door de 60 ul druppel van 1 x M9 buffer op het objectglaasje niet veel diepgang, die naar boven en naar beneden minimaliseert zwembeweging.
  2. Onder Instellingen, ga naar 'opnemen', stelt 'Limit Sequence Grootte' tot '545 frames op schijf'. Onder dezelfde post, vakje van de 'Use Recording Manager'. Klik op de 'Bewerken huidige Recording script ... 'knop, en onder' Commando ', selecteer' Grab Frame ', en onder' Stop condities ", voert u 'Stop na 0: 00: 30.00'.
  3. Om op te nemen, selecteert u 'Nieuwe Sequence in het RAM' onder het huis kop en druk op de rode knop 'Opnemen'. De software zal 545 frames meer dan 30 s grijpen met de digitale camera en houd ze in het RAM-geheugen.

5. Analyse van de fysieke fitheid in Liquid - Video Treatment

  1. Versnippering van de video in een opeenvolging van beeldframes door op de weg naar huis en het selecteren van 'Export volledige sequentie naar ...' in de video-opname software.
    LET OP: De digitale video-opname-software kan de frames als .bmp, .jpg, .tif of .png, die allemaal kunnen worden gelezen door de swim-analyse programma hier gepresenteerde slaan. Merk op dat .tif-bestanden gebruiken meer opslagruimte, maar een aantal formaten zoals .jpg kan de beeldkwaliteit afnemen.
  2. Start het zwemmen analyseprogramma van MATLAB by te klikken op de knop Uitvoeren.
  3. Op het startscherm van de swim-analyse-programma, gebruik dan de 'one video toevoegen' of 'Zet meerdere video's' knoppen om sequenties van afbeelding te uploaden frames een voor een of in groepen, terwijl het bevestigen van relevante labels zoals genotype, de datum, het proces en de duur . De software maakt een database van de gemerkte sequenties.
  4. Enable gelijktijdige volgen van meerdere dieren in de geüploade sequenties door te klikken op '1. Process video's '. In het nieuwe scherm, selecteert u de gewenste video's in het linkervak ​​en klik op 'toevoegen aan de lijst'. Voor elke video, klikt u op de naam in de rechterbovenhoek lijst naar het eerste beeld van de video weer te geven in de rechterbenedenhoek. Bakenen de zwem zone door het selecteren van 3 punten binnen de ring, en start de verwerking door te klikken op 'Proces alle bovenstaande video's'. Bekijk de voortgang van de behandeling in het midden onderaan.
  5. Eenmaal voltooid, 'Close' de video processing scherm.

6. Analyse van de fysieke fitheid in Liquid - Meting

  1. Klik op '2. Compute maatregelen 'om een ​​nieuw scherm waar de bewerkte video's kunnen worden geüpload, een voor een te openen, te valideren of het volgen van enkele dieren te verwerpen. Video's die zijn verwerkt zal verschijnen in de lijst aan de linkerkant waar de video naam kan worden geklikt om die video te uploaden.
  2. Gebruik deze handmatige stap om zich te concentreren op de gebieden van gemiste tracking (rode blokken) in tegenstelling tot een succesvolle volgen (groene blokjes).
    Opmerking: Als alternatief kan men beroep doen op de geautomatiseerde productie van geldige volgen omdat de software een robuust volgsysteem (94,1% geldigheidsduur waargenomen bij 2020 dieren 404 video 8).
    1. Zoek de 'Geldigheid van de gesegmenteerde lichaam' in de eerste kleur balk over het scherm in de onderste helft. Het percentage 'Valid frames' is in groen, en het percentage 'Afgewezen frames' is in het rood. ≥80% van geldige frames impliceren dat de tracking informatie gebruikt om maatregelen te berekenen komt van ten minste 432 frames van 540 in een 30 s zwemmen proef opgenomen met 18 frames / s.
    2. Gemakkelijk te navigeren en blokken van geldige wijzigen / afgewezen frames met behulp van de 'Next blok', 'Switch geldigheid', 'Split block', en opties 'Isoleer kader'. In het zeldzame geval dat 2 dieren gekruist paden in een uncrowded zwemmen zone, schakelen hun identificatienummers over een bepaald frame bereik met de 'Switch' knop.
    3. Bekijk hier de staafdiagrammen in de onderste helft van het scherm voor meer informatie over het volgen en overlappende optredens. De lengte van de gesegmenteerde lichaam (lichaamslengte dier per frame) correleert met overlappende incidentie.
  3. Als er een heldere vlekken op de video interfereren met de analyse, aan te passen heldere gebieden in de swim-zone door de functie 'Glare zones' te selecteren.
  4. Klik op 'Opslaan en Compute maatregelen "om de geldigheid ingang voor sparenladen van een andere bewerkte video. In dit stadium software berekent, op de achtergrond (niet zichtbaar voor de gebruiker), kromming kaarten van het zwemmen prestaties van individuele dieren en de onderstaande parameters (Video 2).
    OPMERKING: De parameters gemeten die gericht hier worden beschreven in tabel 1. The Wave initiatie tarief, body wave nummer, asymmetrie, stretch, en curling worden berekend op basis van de kromming kaarten die de software berekent voor de dieren; De rijsnelheid, borstel slag, en activiteit index parameters zijn niet gebaseerd op kromming kaarten.
  5. Klik op 'Sluiten' om het scherm 'Compute maatregelen "te verlaten.

7. Analyse van de fysieke fitheid in Liquid - Output van de resultaten

Opmerking: De software kan melden op meerdere maatregelen van het zwemmen beweging, die ingaat op openlijke tot zeer subtiele gedragskenmerken niet gemakkelijk gescoord door oog (Video's 3 en 4). hier defocus ligt op 8 parameters die doorgaans een goed dynamisch bereik te laten zien: Golf initiatie rate, Body wave nummer, Asymmetrie, Stretch, Curling, Rijsnelheid, borstel slag, en activiteit index.

  1. Op het beginscherm van het programma, klik op '3. resultaten weergave 'om de analyse uitgang te verkrijgen.
  2. Maak steekproef groepen voor statistische verwerking door het selecteren van de gewenste geanalyseerde sequenties van frames in het linkervak ​​en ze te verplaatsen naar een nieuwe of bestaande sample groep door op de knop 'Voeg toe aan de geselecteerde sample' of 'Voeg toe aan nieuwe Sample' knoppen.
  3. Klik "Show grafieken voor deze monsters 'naar een tweede scherm dat de grafieken en kengetallen van de monsters voor elk van de 8 parameters weergegeven door selectie op de bovenkant van het scherm.
    1. Pas desgewenst de weergave van de grafieken in de linkerbovenhoek van het scherm met behulp van de 'Kleuren', '# van histogrammen' en '# wormen' selectors.
  4. Gebruiken'2D histogrammen om combinaties van twee parameters plot via de' Measure op de X-as 'en' Meet op de Y-as 'drop down menu aan de linkerkant van het scherm. Klik op 'Sluiten' om af te sluiten en terug te keren naar het scherm 'Toon resultaten'.
  5. Gebruik de 'Exporteren ...' knop in de linkerbovenhoek van het scherm om gedetailleerde numerieke gegevens op te slaan als CSV-bestand te openen en verder te manipuleren in een spreadsheet-programma.
  6. 'Sluiten' scherm 'Toon resultaten' om terug naar het beginscherm te gaan en klik op 'Stoppen' om het opslaan van de database met de geanalyseerde videofragmenten te garanderen.

Representative Results

Door het analyseren van motoriek in vloeibare (zwemmen), kunnen fenotypes die niet direct duidelijk op vaste media (kruipen) worden toegelicht. Tot zwemmen motoriek kwantificeren we ontwikkelden specifieke software die tien nieuwe parameters van het zwemmen gedrag 8 meet. De acht meest bruikbare van deze parameters worden in detail beschreven in tabel 1. Deze parameters worden genoemd Wave initiatie rate, Body wave nummer, Asymmetrie, Stretch, Curling, Rijsnelheid, borstel slag, en activiteit index. Studies toelichten van de kracht van de software hebt gedefinieerd de functionele achteruitgang van honderden verouderende volwassenen met WT, gedrags- of levensduur mutant achtergronden 8, en hebben het goed bestudeerde levensduur mutanten leeftijd-1 (hx546) en daƒ-16 (mgDƒ50) geanalyseerd, die mutaties herbergen de normale insuline-signaleringsroute verstoren. Het gen leeftijd-1 codeert voor een phosphatidylinositide 3-kinase (PIK3) Katalytische subunit, en, als het herbergt de mutatie hx546, veroorzaakt levensduurverlenging en stressbestendigheid 27-29. Het gen daƒ-16 codeert voor een forkhead box O (FOXO) transcriptiefactor die de levensduur verkort en schaadt de reactie op stress wanneer verwijderd 30-33.

Bepaalde parameters van het zwemmen zoals Wave initiatie rate, Rijsnelheid, borstel slag en activiteit index geleidelijk af met de leeftijd, zelfs in gunstige genetische achtergronden (figuur 1). In lijn met de huidige kennis, langlevende leeftijd-1 (hx546) mutanten liet een meer krachtige fysieke prestaties dan WT op geavanceerde en zeer oude leeftijden. Ook zoals verwacht, kortstondige daƒ-16 (mgDƒ50) mutanten weergegeven gecompromitteerd prestaties, vooral bij zeer oude leeftijd. Opmerkelijk was het alleen onder het toezicht van de Celest computer vision en wiskundige algoritme pakket dat de superior zwem prestaties oud-1 (hx546) mutanten detecteerbaar was bij het begin van de volwassenheid. Dat leeftijd-1 (hx546) leidt tot verbetering van fysieke prestaties bij jonge volwassenheid suggereert dat deze mutatie beïnvloedt normale ontwikkeling en / of jonge volwassenen fenotype op een niet eerder gewaardeerd (figuur 1).

Body wave nummer, Asymmetrie, Stretch en Curling parameters trendparameters omhoog met de leeftijd in WT en veroudering mutant volwassenen (figuur 2). Interessant is het resolutieniveau van de software geopenbaard fijnere gedragskenmerken zoals aanhoudende symmetrie oud-1 (hx546) mutanten gedurende hun levensduur en het onvermogen van extreme oude daƒ-16 (mgDƒ50) mutanten te rekken en krullen voorzover dezelfde -leeftijd WT en leeftijd-1 (hx546) volwassenen.

Naast de algemene onvermijdelijke verlies van fysische performance gevolg van leeftijd, elke individuelen toont een uniek patroon progressie door het verouderingsproces, zelfs wanneer genetica en milieu vrijwel homogeen 7. (Door het regelen genetica en omgeving, de mogelijke verstorende effecten van deze factoren geminimaliseerd, onthullen de belangrijke bijdrage van stochasticity aan leeftijd gerelateerde degeneratie.) Een gesynchroniseerd C. elegans populatie van vergelijkbare genetische achtergrond bewaard in een gecontroleerde omgeving bevat nog een mix van verschillende klassen van individuen naar hun veroudering eigenaardigheden. Hoewel alle beginnen als gezonde volwassenen, sommige snel verliezen hun fysieke conditie (slechte agers, klasse C), terwijl anderen beweren kracht voor een langere periode (sierlijke agers, klasse A). Bad agers dus lijkt een aanzienlijk kortere healthspan dan sierlijk agers hebben.

Zoals verder beschreven in onze studie 8, sierlijke agers onderhouden jeugdige fysieke fitness zoals waargenomen in vergelijking met de swim-profiel van veel jongere volwassenen (figuren 3, 4 en 5). Deze aanhoudende fitness is vergelijkbaar met de fysieke prestaties van langlevende leeftijd-1 (hx546) mutanten op post-reproductieve leeftijd (D 11) (figuren 1 en 2). Integendeel, slechte agers dramatisch verloren veel van hun fysieke capaciteit snel na reproductie, presteren op niveaus vergelijkbaar met die van extreme oude progeric daƒ-16 (mgDƒ50) volwassenen (figuren 1-4). Deze overeenkomsten kunnen door grove vergelijking worden getrokken, maar met name handtekeningen zijn direct merkbaar bij de loep. Bijvoorbeeld, hoewel er enige correlatie tussen de mate van zowel rek en curling in extreme oude wildtype en veroudering mutanten (figuur 2), deze relatie is niet waargenomen in slechte gers (figuren 4 en 5), die een hogere neiging vertonen te krullen up maarniet te rekken in de geteste monsters. De software presenteren we aldus toegevoegde dimensie aan de analyse van de lichamelijke conditie of motorische capaciteit door het gereedschap naar geavanceerdere studies die niet eerder waren traceerbaar. Samengevat, Celest biedt uitgebreide uitlezingen in de vorm van acht nieuwe maatregelen hier uitgelicht, waardoor de gedrags-vingerafdruk van specifieke genetische, epigenetische definiëren en achtergronden van het milieu, waardoor de identificatie van de unieke en gemeenschappelijke parameter patronen die kunnen worden de handtekeningen van specifieke voorwaarden ( milieu, farmacologische, voedingswaarde), biologische processen, of organisme staten zoals healthspan.

Figuur 1
Figuur 1: celest Software Rapporten over Wave Initiation Rate (A), Activity Index (B), Penseelstreek (C) en Travel Speed (D) voor WT, leeftijd-1 (hx546) en daƒ-16 (mgDƒ50) Volwassenen op D 4 (jong volwassenheid), 11 (post-voortplanting) en 20 (extreme oud). '#' In 'nummer' y-as betekent. WT's zijn gekleurd in grijs, leeftijd-1 in groen en daƒ-16 in het rood. Error bars zijn de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Dezelfde leeftijd WT en veroudering mutanten werden vergeleken voor statistische significantie via een ANOVA gevolgd door meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 in elke data wijzen uit vier onafhankelijke studies. Merk op dat hier, en in figuur 2, is elke afzonderlijke 30 s video gemaakt met 4 dieren en voor elk onderzoek we scoren in totaal 16 dieren 4 swim's, dit gebeurt voor 4 biologische replicaten per gegevenspunt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 2
Figuur 2: Software Rapporten over Body Wave Number (A), Asymmetrie (B), Stretch (C), en Curling (D) voor WT, leeftijd-1 (hx546) en daƒ-16 (mgDƒ50) Volwassenen op D 4 (jonge volwassenheid), 11 (post-voortplanting) en 20 (extreme oud). '#' In 'nummer' y-as betekent. WT zijn gekleurd in grijs, leeftijd-1 in groen, en daf-16 in het rood. Error bars zijn de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Dezelfde leeftijd WT en veroudering mutanten werden vergeleken voor statistische significantie via een ANOVA gevolgd door meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. *, P = 0,01 - <0,05; **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 in elk meetpunt uit vier onafhankelijke, 30 s zwemmen proeven.e.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Software Rapporten over Wave Initiation Rate (A), Activity Index (B), Penseelstreek (C), en Travel Speed (D) voor jonge WT volwassenen (D 4), en met hetzelfde leeftijd Sierlijk en Bad agers (D10 en 11). '#' In 'nummer' y-as betekent. Young betreffende AM zijn gekleurd in grijs, klasse A bevallige agers in groen, en klasse C slechte agers in het rood. Error bars zijn de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Klasse A sierlijke agers en klasse C slechte agers werden vergeleken met D 4 jonge volwassenen met behulp van one-way ANOVA gevolgd door meerdere vergelijkingstest Dunnett's. ****, P <0,0001. n = 27 in elk meetpunt van twee onafhankelijke, 30 s zwemmen proeven. Graph is enigszins gewijzigd ten opzichte van Restif et al. (2014) 8, die onder de Creative werd gepubliceerdCommons (CC BY) licentie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Software Rapporten over Body Wave Number (A), Asymmetrie (B), en Curling (C) voor jonge WT volwassenen (D 4), en met hetzelfde leeftijd sierlijk en Bad agers (D 10 en 11). '#' In 'nummer' y-as betekent. Young betreffende AM zijn gekleurd in grijs, klasse A bevallige agers in groen en klasse C slechte agers in het rood. Error bars zijn de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Klasse A sierlijke agers en klasse C slechte agers werden vergeleken met D 4 jonge volwassenen met behulp van one-way ANOVA gevolgd door meerdere vergelijkingstest Dunnett's. **, P = 0,001 - <0,01; ****, P <0,0001; et al. (2014) 8, die onder de Creative Commons Naamsvermelding (CC BY) licentie http werd gepubliceerd: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Software Verslag over Stretch voor jonge WT volwassenen (D 4), en met hetzelfde leeftijd Sierlijk en Bad agers (D 10 en 11). Young betreffende AM zijn gekleurd in grijs, klasse A bevallige agers in groen en klasse C slechte agers in het rood. Error bars zijn de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Klasse A sierlijke agers en klasse C slechte agers werden vergeleken met D 4 young volwassenen met behulp van one-way ANOVA gevolgd door meerdere vergelijkingstest Dunnett's. n = 27 in elke data wijzen uit twee onafhankelijke studies. Graph is enigszins gewijzigd ten opzichte van Restif et al. (2014) 8, die onder de Creative Commons Naamsvermelding (CC BY) licentie http werd gepubliceerd: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

video 1
Video 1: Zwemmen van een representatieve groep van C. elegans volwassenen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

video 2
Video 2: celest Software Berekening van de individuele kromming Kaarten van de Swim Performances van de geteste dieren. Kromming kaarten worden berekend op de achtergrond; zij niet in de software-interface met de gebruiker. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

video 3
Video 3: Software berekening van zwemmen Maatregelen op basis van individuele Maps kromming. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

video 4
Video 4: Software Berekening van de Swim Maatregelen die niet afhankelijk zijn van CurvatureMaps. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

Het gebruik van C. elegans als een modelsysteem blijft toenemen als gevolg van de genetische maakbaarheid, experimentele tractability en anatomie geannoteerde om minutieuze details. Zo wordt de neuronale structuur en de connectiviteit van het C. elegans hermafrodiet duidelijk in kaart gebracht 34-36, aanzienlijk vergemakkelijken onderzoeken van specifieke neuronale circuits die bepaalde gedragingen te controleren. 302 neuronen vormen de volwassen hermafrodiet het zenuwstelsel, die een breed scala van zintuiglijke input in basic gedrags-uitgangen, zoals motoriek te verwerken. De structuur van de complexere mannelijke zenuwstelsel is ook beschreven 37, waardoor seksespecifiek schakelingen worden aangepakt. 37

C. elegans gedrag is uitgebreid bestudeerd standaard kweekplaten met vaste media. Aangezien WT C. elegans beweegt voorspelbare sinusvormige golven op agar-platen gevuld, afwijkingen van dealgemene patroon kan worden gedetecteerd door het oog en scoorde handmatig. Deze benadering is echter afhankelijk criterium de experimentator en is arbeidsintensief. Hardware en software tools die ontworpen zijn op te sporen en te meten C. elegans motoriek op vaste media verwijder de subjectiviteit vooringenomenheid en zorgen voor grootschalige studies, waardoor meer geavanceerde biologische vragen die moeten worden aangepakt. De recente gedrags-database die door de Schafer lab 16 is een uitstekend voorbeeld van de analytische uitbreiding en diepte die is bereikt met een computationeel systeem voor vervoer op platen.

Wanneer WT C. elegans wordt geplaatst in vloeistof, het dier snel aanpast haar ontwerpresolutie aan de nieuwe omgeving, het initiëren van een duik. C. elegans zwemmen maakt gebruik van een groter bereik van de beweging dan kruipen en kan onregelmatiger 8 zijn. Software zoals Celest is bedoeld om de kloof voor een gedetailleerde analyse van C. elegans te vullen gedrag in vloeibare, PermiVoorbereidingen kwantificering van motion-geassocieerde parameters die niet gemakkelijk worden gemeten door de VN-gesteunde oog, of dat kan sneller dan handmatige scoring worden bereikt. In 8 harde h kon een individu tot verwerken tot 200 video's, ~ 1000 records per dag.

De software definieert zwemmen beoordelen van parameters die dienen als een uitgebreide vingerafdruk van de fysieke fitheid en gedrag. In aanvulling op het verrijken van inzicht in de complexe aspecten van C. elegans gedrag in vloeibare en hun onderliggende moleculaire pathways, kan deze software worden gebruikt om meerdere aspecten van de biologie, waaronder farmacologische reacties, veroudering, en verschillend gedrag te verkennen. Hier gepresenteerde overzicht van de gekwantificeerde veranderingen die optreden in de fysieke prestaties van C. elegans volwassenen ze ouder is een voorbeeld van een dergelijke toepassing van de software (voor een nadere uiteenzetting Zie Restif et al. 8). In de context van veroudering, wat gemeten parameters afgenomen terwijlanderen verhoogd of niet consequent veranderen in wild type. Trends bevestigd grotendeels door de rekenkundige profiel van levensduur mutanten en de relatieve profielen sierlijke en slechte ager cohorten van dezelfde leeftijdsgroepen bewaard in uniform omgevingsomstandigheden. De hoge resolutie van de software kan ook zien subtiele fenotypen onbekende in uitgebreid gekarakteriseerd mutanten (bijvoorbeeld leeftijd-1 (hx546) in figuur 1).

Er zijn een aantal bijzonder kritische stappen van het beschreven protocol. Het handhaven van een constante temperatuur omgeving tussen het zwemmen milieu en de druk plaat cultuur is belangrijk voor zwemmen reproduceerbaarheid, zodat onderzoekers sterk worden aangemoedigd om te gaan naar grote moeite om willekeurige veranderingen in temperatuur te voorkomen. Swim media moet op dezelfde temperatuur als de platen. Ook zal aandacht voor de druppelgrootte voor het zwemmen te zorgen reproduceerbaarheid. Tot slot is het verstandig om na te denken invooraf over het lossen van de grote videobestanden die zich ophopen. Het verwerken van afbeeldingen op een site met uitzondering van de video-opname computer is aan te bevelen.

Het gebruik van de software hier gepresenteerde voor zwemt analyse heeft bepaalde beperkingen. Ten eerste, hoewel de programma's tegelijkertijd meerdere dieren kan volgen, als er meer dan vijf dieren gezamenlijk worden geanalyseerd, er een grotere kans dat de dieren zwemmen in elkaar in de videobeelden. Wanneer het programma niet ondubbelzinnig bepalen welk dier was dat zij censureert die gegevensframes. Hoewel dit programma functie zorgt ervoor dat gegevens voor individuele dieren zijn van hoge kwaliteit, beperkt het debiet. Ten tweede moet de afbeeldingen redelijk schoon zijn, die vrij is van stof, vlekken en schittering van verlichting, zoals bijbehorende signalen ook de beeldanalyse kan verwarren. Zoals vermeld in protocol punt 2.1.1, een zeer low-tech investeringen die sterk beeld vast te leggen kan helpen door het elimineren van complicaties met fluctuaties in milieu-verlichting is op het podium met een donkere doek die niet toestaat omgevingslicht naar het podium te bereiken dekken. Ten derde, wordt het programma geoptimaliseerd voor dieren die het volwassen stadium. Jonge larven zwemmen erg snel en hebben kleine lichamen, die fout in het programma vergroot. Ten vierde, een deel van de software maakt gebruik van MATLAB, en als er versie-upgrades en / of upgrades van het besturingssysteem, kunnen sommige programma koppelingen worden verstoord. Op dit moment is de software geoptimaliseerd voor gebruik op MATLAB 2015b en Mac OS-versie 10.10, maar we verwachten binnenkort een software-versie die meer bestand tegen dergelijke veranderingen te posten. Tenslotte kan de videobestanden grote snel geworden, en vereisen opslagruimte toe te wijzen.

Kortom, hier wordt gepresenteerd is een eenvoudige methode die gemakkelijk door een laboratorium kan worden uitgevoerd zonder veel investeringen video's van C. elegans zwemmen voor celest analyse te maken. Kenmerken van de software-pakket zijn onder andere vergaande automatisering van het volgen door middel vananalyse, simultane multi-dier volgen en gebruik van wiskundige basen (bijv kromming maatregelen) kwantificatie van de meeste beweging parameters. De software is open source, met code en demo's publiekelijk verkrijgbaar zoals beschreven in Restif et al. 8. Hoewel het programma is voorzien van geavanceerde computer vision analyse voor het bijhouden, andere gepubliceerd tracking systemen (bijvoorbeeld Greenblum et al., 2014 38) zijn compatibel met de parameter analyse van de software hier gepresenteerd. Toekomstige verbeteringen zullen worden gericht op het omzetten van de software in een robuuste behuizing die geen gebruik van de specifieke versie van de bovenstaande besturingssystemen (ook aangeduid in de Tabel Materials) niet beperkt.

Acknowledgments

Celest ontwikkeling werd ondersteund door NIH subsidies R21AG027513 en U01AG045864. Gegevens en een aantal korte video voorstellingen worden aangepast van Restif et al. (2014) 8, die onder de Creative Commons Naamsvermelding (CC BY) licentie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ werden gepubliceerd. Wij danken Ricardo Laranjeiro voor manuscript hulp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT
N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Printed Microscope Slides  Thermo Fisher Scientific Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM) For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST Driscoll Lab, Rutgers University C. elegans Swim Test Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB www.mathworks.com/downloads MatLab version 2015b (best) The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.  
Mac OS www.apple.com Version 10.10 Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope  Zeiss Stemi 2000-C 
Transmitted Light Base Diagnostic Instruments TLB 3.1
Digital CCD Camera QImaging Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software Norpix Streampix Version 3.17.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Jove Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5103/an-introduction-to-caenorhabditis-elegans (2016).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Gallagher, T., Kim, J., Oldenbroek, M., Kerr, R., You, Y. J. ASI regulates satiety quiescence in C. elegans. J Neurosci. 33 (23), 9716-9724 (2013).
  5. Brown, A. E., Yemini, E. I., Grundy, L. J., Jucikas, T., Schafer, W. R. A dictionary of behavioral motifs reveals clusters of genes affecting Caenorhabditis elegans locomotion. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 791-796 (2013).
  6. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  7. Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003702 (2014).
  8. Ibanez-Ventoso, C., et al. Modulated microRNA expression during adult lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (3), 235-246 (2006).
  9. Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat Commun. 6, 8919 (2015).
  10. Hsu, A. L., Feng, Z., Hsieh, M. Y., Xu, X. Z. Identification by machine vision of the rate of motor activity decline as a lifespan predictor in C. elegans. Neurobiol Aging. 30 (9), 1498-1503 (2009).
  11. Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
  12. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N., Driscoll, M. In vivo spectrofluorimetry reveals endogenous biomarkers that report healthspan and dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 4 (3), 127-137 (2005).
  13. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  14. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  15. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS One. 8 (7), e69653 (2013).
  16. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. J Vis Exp. (69), e4094 (2012).
  17. Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (5), 1539-1549 (2008).
  18. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  19. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  20. Schreiber, M. A., Pierce-Shimomura, J. T., Chan, S., Parry, D., McIntire, S. L. Manipulation of behavioral decline in Caenorhabditis elegans with the Rag GTPase raga-1. PLoS Genet. 6 (5), e1000972 (2010).
  21. Fang-Yen, C., et al. Biomechanical analysis of gait adaptation in the nematode Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20323-20328 (2010).
  22. Buckingham, S. D., Partridge, F. A., Sattelle, D. B. Automated, high-throughput, motility analysis in Caenorhabditis elegans and parasitic nematodes: Applications in the search for new anthelmintics. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 4 (3), 226-232 (2014).
  23. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. J Exp Biol. 211 (Pt 23), 3703-3711 (2008).
  24. Restif, C., Ibanez-Ventoso, C., Driscoll, M., Metaxas, D. Tracking C. elegans swimming for high-throughput phenotyping. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1542-1548 (2011).
  25. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  26. Johnson, T. E., Tedesco, P. M., Lithgow, G. J. Comparing mutants, selective breeding, and transgenics in the dissection of aging processes of Caenorhabditis elegans. Genetica. 91 (1-3), 65-77 (1993).
  27. Morris, J. Z., Tissenbaum, H. A., Ruvkun, G. A phosphatidylinositol-3-OH kinase family member regulating longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Nature. 382 (6591), 536-539 (1996).
  28. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  29. Ogg, S., et al. The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  30. Ziv, E., Hu, D. Genetic variation in insulin/IGF-1 signaling pathways and longevity. Ageing Res Rev. 10 (2), 201-204 (2011).
  31. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  32. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  33. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  34. Varshney, L. R., Chen, B. L., Paniagua, E., Hall, D. H., Chklovskii, D. B. Structural properties of the Caenorhabditis elegans neuronal network. PLoS Comput Biol. 7 (2), e1001066 (2011).
  35. Jarrell, T. A., et al. The connectome of a decision-making neural network. Science. 337 (6093), 437-444 (2012).
  36. Greenblum, A., Sznitman, R., Fua, P., Arratia, P. E., Sznitman, J. Caenorhabditis elegans segmentation using texture-based models for motility phenotyping. IEEE Trans Biomed Eng. 61 (8), 2278-2289 (2014).

Tags

Neuroscience zwemmen gedrag motoriek, Veroudering sarcopenie het volgen
Geautomatiseerde analyse van<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Gedrag Met behulp van Celest Software
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ibáñez-Ventoso, C.,… More

Ibáñez-Ventoso, C., Herrera, C., Chen, E., Motto, D., Driscoll, M. Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software. J. Vis. Exp. (118), e54359, doi:10.3791/54359 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter