Summary
Artärstelhet är en nyckelfaktor för hjärt-kärlsjukdom och pulsvågshastighet (PWV) kan betraktas som en surrogat index för artärstelhet. Detta protokoll beskriver en bildbehandlingsalgoritm för beräkning av PWV i möss baserade på ultraljud bildbehandling som är tillämplig på olika arteriella platser.
Abstract
Arteriell stelhet kan utvärderas genom att beräkna pulsvågshastigheten (PWV), dvs den hastighet med vilken pulsvågen färdas i en ledning kärl. Denna parameter alltmer undersöks i små gnagarmodeller där det används för att bedöma förändringar i vaskulär funktion i samband med vissa genotyper / behandlingar eller för att karakterisera hjärt sjukdomsprogression. Detta protokoll beskriver en bildbehandlingsalgoritm som leder till icke-invasiv artär PWV mätning i möss med hjälp av ultraljud (US) avbildningar. Den föreslagna tekniken har använts för att bedöma bukaorta PWV hos möss och utvärdera dess åldersrelaterade förändringar.
Bukaorta amerikanska skannar erhålls från möss enligt gasformig anestesi med hjälp av en specifik USA-enhet utrustad med högfrekventa amerikanska sonder. B-mode och Pulse-Wave Doppler (PW-doppler) bilderna analyseras för att erhålla diameter och medelhastigheten momentana värden, respektive. För detta ändamål är kantavkänning och kontur spårning tekniker som används. Den enda slag innebär vågformer diameter och hastighets är tid linje och kombineras för att uppnå diameter hastighet (Lnd-V) slinga. PWV värden erhålles från lutningen på den linjära delen av slingan, vilket motsvarar den tidiga systoliska fasen.
Med den nuvarande modellen, anatomisk och funktionell information om musen bukaortan kan vara icke-invasivt uppnåtts. Kräver bearbetning av amerikanska avbildningar, kan det utgöra ett användbart verktyg för icke-invasiv karakterisering av olika arteriella platser i musen när det gäller elastiska egenskaper. Tillämpningen av föreliggande teknik kan lätt utvidgas till andra vaskulära områden, såsom halspulsådern, vilket ger möjligheten att få en multi-site artärstelhet bedömning.
Introduction
Musmodeller i allt högre grad används för undersökning av kardiovaskulär sjukdom (CVD) och i synnerhet används i longitudinella studier som medger karakterisering av olika faser av sjukdomsutveckling 1. Elastiska egenskaperna hos stora artärerna är relaterade till olika patologiska tillstånd; från en teknisk synvinkel, kan bedömas artärstelhet genom att mäta pulsvågshastighet (PWV), som representerar den hastighet med vilken pulsvågen färdas i en ledning kärl 2. På grund av dess kliniska betydelse, är det allt mäts även i prekliniska små djurmodeller 3.
Olika tekniker finns tillgängliga för att bedöma PWV i möss. Invasiva metoder är baserade på användning av kateterspetstryckomvandlare. PWV bedöms genom att förvärva trycksignaler vid två olika arteriella platser och dividera avståndet mellan de två mätnings siter av tidsförskjutningen mellan signalerna 4. Den största nackdelen i samband med dessa typer av tekniker är att de kräver djuroffer för utvärdering av avståndet mellan de två platserna mätning och således kan inte användas i longitudinella studier. För att övervinna denna begränsning, icke-invasiva metoder, baserade på olika avbildningstekniker, har utvecklats. Tidigare studier har rapporterat bedömningar PWV hos möss som erhållits genom tillämpning av transittiden metoden på anslags kodade magnetresonansdata 5 och pulserande dopplersignaler 6. Emellertid är PWV värde som erhålls med dessa metoder en regional utvärdering av arteriell stelhet. I själva verket, representerar det ett genomsnittligt värde, som står för olika artärer i termer av storlek och elastiska egenskaper. Dessutom är dessa typer av utvärderingar kräver bedömning av avståndet mellan de två mätningarna platserna som är en källa till fel som skulle kunna influence det slutliga resultatet.
PWV kan bedömas med hjälp av diameter hastighet (Lnd-V) slinga 7. Denna metod är baserad på en samtidig utvärdering av diametervärden och flödeshastighet i ett valt kärl. Enligt detta tillvägagångssätt, är LND-V-slinga erhålls genom värden plottning naturliga logaritmen diameter vs betyder hastighetsvärden och PWV uppskattas genom att beräkna lutningen av den linjära delen av det erhållna slingan som motsvarar den tidiga systoliska fasen. När det gäller det praktiska genomförandet av denna metod har tidigare verk redan rapporterat resultat om dess tillämpning i ett in vitro set-up system 7 och dess användning för bedömning av både hals och lårbens PWV hos människor 8.
Det främsta syftet med denna studie är att ge en detaljerad beskrivning av en bildbehandlingsalgoritm som ger en icke-invasiv artär PWV mätning i möss med användning av US bilderna bara. Det föreslagna tillvägagångssättet gör det möjligt att utvärdera den lokala artärstelhet med hjälp av behandlingen av både B-mode och Pulsed-Wave Doppler (PW-doppler) bilder och kan appliceras på artärer av central betydelse, såsom bukaortan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök utfördes i enlighet med det europeiska direktivet (2010/63 / UE) och den italienska lagen (D.Lvo 26/2014), och det följde principerna för försöksdjurs vård. The Local etiskt godkännande panel godkände studien.
1. Imaging ordningen
- Placera musen i en anestesi induktion kammare fylld med 2,5% isofluran i ett L / min rent syre. Kontrollera djupet av anestesi genom okänslighet till tå nypa.
- Placera djuret på en temperaturstyrd bräda i ryggläge. Fukta djurets ögon med ögonsalva, för att undvika dem körs torr. Supply bedövningsmedel gasflöde (1,5% isofluran) genom att placera musens nos i den särskilda noskonen. Vid behov, justera andelen isofluran från fall till fall, beroende på djuret under studien. Fäst styrelsen temperaturen vid 40 ° C.
- Belägga fyra benen av djuret med ledande pasta och tejpa fast dem på EKG-elektroder inbäddade istyrelse. Mäta kroppstemperaturen med en rektal sond smörjas med vaselin. Kontrollera att alla fysiologiska mätningar (EKG och andningssignalen samt temperatur) är korrekt förvärvas och visas.
- Ta bort hår kemiskt från buken med hårborttagningskräm och päls det med akustisk koppling gel.
- Placera (13-24 MHz) US sonden i den mekaniska armen.
- Fäst amerikanska sonden parallellt med djuret och justera sin position för att få longitudinella bilder av bukaorta med regionen av intresse som ligger i fokus zonen.
- Samla anatomisk information.
- Klicka på knappen möjliggör hög bildhastighet EKG-gated förvärv 9 väljer en bildhastighet förvärv lika med 700 fps och börja förvärvet. Obs: På detta sätt kan förvärvas anatomiska bilder av fartyget i samband med en enda hjärtcykel.
- Samla flödeshastighetsinformation. </ Strong>
- Genom att använda samma scan projektion, klicka på PW-Doppler-knappen, placera provvolymen i mitten av kärlet och få bilder säkerställer att cine slingan inte är kortare än 3 s. Erhålla dessa uppgifter upprätthålla vinkelkorrektionen så liten som möjligt, anpassa den från fall till fall på grundval av den amerikanska projektionen erhålls.
- Ta bort djuret från det temperaturreglerade och invänta fullständig återhämtning.
OBS: I vår erfarenhet är detta tar ca 10 min. Lämna inte och djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
2. Efterbehandling
- Export B-mode och PW-Doppler bilder som DICOM-filer och spara dem på en persondator. Omvandla PW-Doppler DICOM-filer till TIFF-bilder.
- Process B-mode bilder.
- Importera motsvarande DICOM-fil genom att använda den dedikerade grafiskt användargränssnitt (GUI).
- För att initiera konturer, dra en linje nära den bortre väggen av kärlet (enkelklick för att starta det och dubbelklicka för att avsluta det) och dubbelklicka nära nära väggen. En linje parallellt med att nära den bortre väggen visas automatiskt. Applicera algoritmen på en enskild bildruta genom att trycka på "ANALYSE" -knappen.
- Kontrollera resultatet. Om kanterna har korrekt identifierats (dvs., Har utvecklingen av det initierade punkter detekteras både bakre och främre vägg), tillämpa algoritmen på hela cine-slinga genom att klicka på "GO" -knappen. Om kanterna inte korrekt identifierats, rensa dem genom att klicka på "Clear Contour" och initiera dem igen genom att upprepa punkt 2.2.2.
OBS! Algoritmen är baserad på kantdetektion och konturspårningstekniker och har tidigare beskrivits i detalj 10. - Erhålla det slutliga resultatet genom att trycka på "RECORD" -knappen och spara corresponding .mat fil som innehåller värden momentana diameter relaterade till en enda hjärtcykel.
- Öppna GUI för genomförande LND-V-slinga.
- Klicka på "HASTIGHET" -knappen för att starta PW-doppler bildbehandling som leder till en enda slag innebär hastighetskurvan.
- Identifiera PW-doppler spår och leta reda på raden som motsvarar ett hastighetsvärde lika med noll genom att trycka på "WHITE LINE" -knappen.
- Utför hastighetskalibrering och kalibrering genom att använda "HASTIGHET" och "TIME" knappar (i kalibreringspanelen), respektive. Genom att trycka på dessa knappar gör att man kan dra en linje vars längd motsvarar kalibreringsfaktorn införas.
- Välj en ROI som innehåller de fysiologiska signaler genom att använda "ROI PHYSIO" -knappen manuellt.
- Välj en ROI som innehåller PW-doppler spår genom att trycka på "ROI SIGNAL" -knappen manuellt.
- click på "ANALYSE" -knappen och kontrollera om kuvertet identifieras. Om resultatet inte är tillfredsställande, ändra tröskeln (genom att skriva det nya värdet i "hastighetströskeln" redigerbar textfält) och tryck på "ANALYSE" igen. Tune tröskeln från fall till fall, beroende på kvaliteten på bilderna. Tryck på "UTFORMA" -knappen.
- Leta reda på R-topparna i EKG-signalen och dela hastighets enveloppsignalen detta genom att klicka på "Uppdatera" -knappen. Välj slag som inte är skadade av buller eller belägna i inandningsfasen genom att klicka på "VÄLJ BEATS" -knappen. På detta sätt få en enda slag medelhastighet vågform.
- Använd Fast Fourier Transform metod för att interpolera de utvalda slag i frekvensdomänen och göra dem alla består av samma antal poäng, som beskrivs i referens 11. Utför denna operation automatiskt genom att trycka på RETurna tangent på datorns tangentbord när beats har valts ut. Om "medelhastigheten" är markerad enda slag medelhastighet signal uppnås genom att dividera den maximala hastigheten kurvan med två, hypothesizing en parabolisk hastighetsprofil 12. Tryck på "OK" -knappen.
- Klicka på "diameter" -knappen. Interpolera vågform den inre-beat diameter i tidsdomänen i syfte att erhålla en signal enda-beat diameter med samma prov frekvens som den enda-beat hastighetssignalen genom att trycka på "INSKJUTA" -knappen. Klicka på "OK" -knappen.
NOTERA: För att få den inre-beat diameter och genomsnittlig hastighetskurvor med samma prov frekvens och samma antal datapunkter, är de interpoleras i frekvensdomänen. - Välj "Andra derivat" strategi som justeringsmetod (ovanför diagrammet visar vågformer diametern och hastighets) och klicka på "Uppdatera" button. De två kurvorna blir automatiskt tidsjusterad med den andra derivatan metod 14.
- Bygga slut Lnd-V-slinga genom att plotta den naturliga logaritmen av värden de enda takt diameter mot enkel slag innebär hastighetsvärden. Detta görs automatiskt när de två vågformerna är i linje. Notera: De punkter som ingår mellan 5% och 90% av det maximala värdet av den inre-beat betyda hastighetskurvan automatiskt beläget och en linjär interpolering på dessa punkter tillämpas för att utvärdera lutningen för den linjära delen av slingan.
- Beräkna PWV i enlighet med följande ekvation 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det föreslagna tillvägagångssättet har applicerats till möss bukaorta i en tidigare studie 11. Följande figurer visar resultaten av tillämpningen av det beskrivna tillvägagångssättet på verkliga möss bilder. Dessa data är från ett enda djur (vildtyp möss, 13 veckor gamla, stam: C57BL6, vikt: 33 g) Särskilt Figur 1 visar resultatet av analysen av de amerikanska bilderna. Kantdetektion och kontur spårning tekniker tillämpas på B-mode bilder som förvärvats med hög bildhastighet EKG-gated modalitet ge vågform diametern; Å andra sidan, leder identifieringen av PW-dopplersignalen kuvert till enda slag medelhastighet kurva bedömning. Utvärderingen av den inre-beat medelhastighet vågformer omfattar medelvärdet av data från olika hjärtcykler. För data som visas, standardavvikelsen för de hastighetskurvorna (beräknas som genomsnittet av standardavvikelsen erhålls vidvarje tidpunkt) är 0,0137 m / sek.
Single-beat diameter och medelhastigheten vågformer interpoleras i både frekvens- och tidsdomänen och sedan tid i linje (Figur 2A). LND-V-slinga erhålls genom att plotta värdena den naturliga logaritmen diameter vs. hastighetsmätningar medelvärden, såsom visas i figur 2B. PWV bedöms genom att beräkna lutningen av den linjära delen av slingan, som är känd för att motsvara den tidiga systoliska fasen. Detta parti automatiskt identifieras som den som motsvarar den uppåtgående linjen av medelhastighetskurvan. Dessa siffror visar att bildbehandlingsoperationer som krävs för att genomföra den föreslagna tekniken leder till en slutlig Lnd-V-slinga som liknar den som erhölls hos människa med hjälp av ett liknande tillvägagångssätt 7. Detta tyder på att denna teknik skulle kunna utgöra ett giltigt alternativ för icke-invasiv PWV bedömning möss.
Figur 1: Behandling av B-mode och PW-doppler bilder. B-läge bilder (a) behandlas med hjälp av kantdetektering och kontur spårning tekniker. PW-dopplerbilder (b) behandlas för identifiering av enveloppsignalen från vilken den enda-beat medelhastighet vågform erhålls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Genomförande av Lnd-V Loop för PWV beräkning. Diameter och medelhastigheten vågformer som erhållits från B-mode och PW-doppler bildbehandling. (A). LND-V-slinga erhålls genom att plotta den naturliga logariTHM värden diameter mot medelhastighetsvärden (b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har en bildbehandlingsalgoritm baserad på LND-V-slinga för PWV bedömning i möss har beskrivits i detalj. Den föreslagna strategin bygger på behandling av amerikanska avbildningar och därmed skulle kunna utgöra ett alternativ till befintliga tekniker 6, 13 för utvärdering av artärstelhet i musmodeller. I själva verket omvänt till invasiva metoder 6 som är baserade på förvärv av intra-arteriella trycksignaler och kräver det djur som skall offras, är denna teknik helt icke-invasiv och, sålunda, kan vara särskilt lämplig i fallet med longitudinella studier. Dessutom ger det en utvärdering av artärstelhet som är lokal och inte regional. Även om den föreslagna metoden är känd för att påverkas av den reflekterade vågen 15, kan det ge en mer exakt PWV bedömning med hänsyn till andra USA-baserade metoder för lokal PWV bedömning, såsom den som baseras på flödesområdet teknik 13 som kräver förvärv av färgflödesdata i tvärsnittsprojektion. PWV värde som visas i avsnittet "Representativa resultat", vilket motsvarar 1,69 m / sek, ligger i linje med vad som rapporteras i referens 11: i själva verket, i denna studie, bukaorta PWV var lika med 1,91 ± 0,44 m / sek i vuxna möss och 2,71 ± 0,63 m / sek i gamla djur.
För att minimera fel i PWV bedömningar har stor uppmärksamhet ägnas vid förvärv amerikanska bilder. I synnerhet bör B-mode bilder förvärvas med mycket tydliga främre och bakre väggar för att uppnå kurvan en diameter som inte är skadat av brus. Med avseende på PW-Doppler bilder bör vinkelkorrektionen minimeras. Värdet på 60 grader kan representera, i de flesta fall, en bra kompromiss mellan en bra längdaxel vy och en god approximation av hastighetskomponenter. Furthermore, i fallet med longitudinella studier med upprepade mätningar, försiktighet bör iakttas vid avbildning kärlet på samma sätt, dvs med samma avsöknings projektion.
Den största begränsningen av det presenterade tillvägagångssättet gäller det faktum att bilderna som krävs för diameter och menar bedömningar hastighet vågform inte förvärvas samtidigt. Denna brist på samtidighet kan representera en felkälla för PWV bedömning och göra mätningen mindre exakt. Dessutom skulle en verklig samtidig förvärv garantera en bättre tidsförskjutningen mellan de två kurvorna och undvika problem i samband med hjärtfrekvensvariation. Ur praktisk synvinkel, kan en annan begränsning vara bristen på tillgänglighet av den höga bildfrekvensen EKG-gated modalitet. Detta problem kan delvis övervinnas genom att förvärva bilder i B-mode modalitet och justering av insamlingsparametrar för att uppnå den högsta tidsupplösning. I det här fallet, signal diametern börvara delat med EKG bas och behandlas på samma sätt som den hastighetssignalen, för att erhålla en enda vågform kryssen diameter. Men under vissa förhållanden, den erhållna tidsupplösning kommer inte att vara lämplig för att uppnå en signal giltig diameter. Framtida ändringar av bildbehandlingskedjan som syftar till att övervinna dessa begränsningar skulle förbättra tekniken och leda till en mer exakt bedömning av lokal artärstelhet.
Framtida tillämpningar av den presenterade tillvägagångssättet skulle beröra andra arteriella distrikt. Effektivt, tack vare det faktum att det kräver förvärv av B-mode och endast PW-Doppler bilder, denna metod kan lätt tillämpas på andra arteriella ställen, såsom karotisartären, vilket ger en multi-site artärstelhet bedömning. En högre frekvens Sonden bör väljas för mer ytliga artärer såsom den gemensamma hals; i varje fall bör valet av sonden säkerställa en korrekt visualisering av artären för than djur i studien. Sammanfattningsvis kan det beskrivna systemet erbjuda ett enkelt sätt att utvärdera funktionella egenskaper hos olika artärer i musmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
References
- Zaragoza, C., et al.
- Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
- Wang, Y. X., et al. Increased aortic stiffness assessed by pulse wave velocity in apolipoprotein E-deficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, 428-434 (2000).
- Mitchell, G. F., Pfeffer, M. A., Finn, P. V., Pfeffer, J. M. Comparison of techniques for measuring pulse-wave velocity in the rat. J Appl Physiol. 82 (1), 203-210 (1997).
- Parczyk, M., Herold, V., Klug, G., Bauer, W. R., Rommel, E., Jakob, P. M. Regional in vivo transit time measurements of aortic pulse wave velocity in mice with high-field CMR at 17.6 Tesla. J Cardiovasc Magn Reson. 12, 72 (2010).
- Hartley, C. J., Taffet, G. E., Michael, L. H., Pham, T. T., Entman, M. L. Noninvasive determination of pulse-wave velocity in mice. Am J Physiol. 273 (1), Pt 2 494-500 (1997).
- Feng, J., Khir, A. W. Determination of wave speed and wave separation in the arteries using diameter and velocity. J Biomech. 43 (3), 455-462 (2010).
- Borlotti, A., Khir, A. W., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., Vermeersch, S., Segers, P. Noninvasive determination of local pulse wave velocity and wave intensity: changes with age and gender in the carotid and femoral arteries of healthy human. J Appl Physiol. 113 (5), 727-735 (2012).
- Chérin, E., et al. Ultrahigh frame rate retrospective ultrasound microimaging and blood flow visualization in mice in vivo. Ultrasound Med Biol. 32 (5), 683-691 (2006).
- Gemignani, V., Faita, F., Ghiadoni, L., Poggianti, E., Demi, M. A system for real-time measurement of the brachial artery diameter in B-mode ultrasound images. IEEE Trans Med Imaging. 26 (3), 393-404 (2006).
- Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Sicari, R., Faita, F. Non-invasive assessment of pulse wave velocity in mice by means of ultrasound images. Atherosclerosis. 237 (1), 31-37 (2014).
- Nichols, W. W., O'Rourke, M. F. McDonald's Blood Flow in Arteries: Theoretical, Experimental, and Clinical Principles. , Arnold. London. 215-358 (1998).
- Williams, R., et al. Noninvasive ultrasonic measurement of regional and local pulse wave velocity in mice. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1368-1375 (2007).
- Penny, D. J., et al. Aortic wave intensity of ventricular-vascular interaction during incremental dobutamine infusion in adult sheep. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294, 481-489 (2008).
- Segers, P., et al. Wave reflection leads to over- and underestimation of local wave speed by the PU- and QA-loop methods: theoretical basis and solution to the problem. Physiol Meas. 35 (5), 847-861 (2014).
