Summary
En förbättrad polymeraskedjereaktion-restriction fragment length polymorphism metod för genotypning Pufferfish arter genom vätskekromatografi / masspektrometri beskrivs. En omvänd-fas-kiseldioxid monolit kolonn användes för separering av digere amplikoner. Denna metod kan belysa de monoisotopisk massorna av oligonukleotider, vilket är användbart för identifiering av baskompositionen.
Abstract
En förbättrad version av en polymeraskedjereaktion (PCR) -restriction fragment length polymorphism (RFLP) -metoden för genotypning toxiska Pufferfish arter genom vätskekromatografi / elektrosprayjonisering masspektrometri (LC / ESI-MS) beskrivs. DNA-extraktion utförs med användning av en kiselmembranbaserad DNA-extraktion kit. Efter PCR-amplifiering med användning av en detergent-free PCR-buffert, är restriktionsenzymer sattes till lösningen utan att rena reaktionslösningen. En omvänd-fas-kiseldioxid monolit-kolonn och en Fourier-trans högupplösande mass-spektrometer med en modifierad Kingdon fälla analysator användes för separation och detektion, respektive. Den mobila fasen, som består av 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol, 15 mM trietylamin (pH 7,9) och metanol, avges vid en flödeshastighet av 0,4 ml / min. Cykeltiden för LC / ESI-MS-analys är 8 min inklusive ekvilibrering av kolonnen. Avfaltning programvara med en isotop distributionsmodell of oligonukleotiden används för att beräkna motsvarande monoisotopisk massa från masspektrum. För analys av oligonukleotider (intervall 26-79 nukleotider), mass noggrannhet var 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) och utmärkt noggrannhet och precision upprätthölls under 180 timmar utan användning av ett lås massa standard.
Introduction
Masspektrometri (MS) är en accepterad teknik för snabb och tillförlitlig identifiering av nukleinsyror, matris assisterad laserdesorption / jonisering (MALDI) och elektro (ESI) som används för jonisering 1,2. MALDI tekniken kombineras typiskt med en time-of-flight (TOF) Analyzer, emellertid tillämpningen av MALDI-TOF MS begränsas till korta oligonukleotider (~ 25 nukleotider (nt)) på grund av den efterföljande fragmentering, adduktbildning och låg joniseringseffektivitet 1,2. Däremot är ESI tillämplig till längre oligonukleotider (> 100 nt), men många laddningstillstånd av multipla laddade joner ([M-nH] n-) produceras samtidigt från biomakromolekyler och därmed massan av analyten kan överstiga den övre gränsen för m / z området för spektrometer. Detta kräver tolkning av invecklad spektra, dvs omvandling av en laddningstillstånd serie till motsvarande massavia avfaltning.
I fallet med massmätning av en liten molekyl, toppen av den monoisotopiska massan, dvs, är massan av den molekyl som innehåller endast den vanligaste isotopen av varje element den mest förekommande och observeras naturligt 3. När molekylvikten ökar, blir de isotopfördelnings skiftar till högre m / z och monoisotopisk topp skyms av baslinjen buller 3-5. När monoisotopisk topp är inte längre detekterbar för massorna större än 10 kDa 3, är den genomsnittliga molekylvikt som används för mätning i stället för monoisotopisk massa 5. I sådana fall, endast kan observeras isotopfördelning, i vilken var och en av de individuella topparna är åtskilda av en Da när en högupplösande mass-analysator såsom en TOF, en Fourier-transform modifierad Kingdon fälla analysator 6, eller en Fourier-trans ion cyklotron resonans analysator används för analys. Emellertid är den mest förekommande toppen sometimes inte överensstämmer med den genomsnittliga molekylvikt 5. Dessa problem kan leda till svårigheter för noggrann bestämning analyter.
Med tanke på variationen i naturliga överflöd av stabila isotoper och svårigheterna i bestämmer medelmolekylvikt, är mätning av monoisotopisk massa idealisk för mass karaktärisering av biomolekyler 3,4. I praktiken, om en monoisotopiska topp kan observeras eller ej, av enkla isotoper massan kan uppskattas genom att jämföra mönstret för den observerade isotop distribution till den teoretiska beräknas utifrån en modell analyt 4,7-10. Beslaget algoritm 8 nu införlivas proprietär programvara.
Inom ramen för ESI-MS, är dissociation av en DNA-duplex, rening och avsaltning krävs för direkt mätning för att undvika fel på jonisering på grund av jon-undertryckning och adduktbildning 2,10-14. Dessa förfaranden är troublesome dock helautomatiserade analyssystem har utvecklats kommersiellt innebär polymerase chain reaction (PCR), provberedning och ESI-MS för detektion av patogener 15-20. Ett annat tillvägagångssätt är att införa vätskekromatografi (LC) för separation. LC ger en on-line separation av analyter från samexisterande substanser och kräver inte en mödosam provberedning före jonisering 21,22. Emellertid är svårare än för de flesta andra föreningar såsom läkemedel, peptider och proteiner på grund av den polyanjoniska naturen av nukleotiderna separation av nukleinsyror med användning av en MS-kompatibel mobil fas. De mest lyckade exempel på LC / ESI-MS involverar användningen av jonpar-omvänd-fas-LC. En mobil fas av 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol ursprungligen föreslagits av Apffel et al. För att separera och detektera korta oligonukleotider 23. Tillämpning av LC / ESI-MS genotypning för differentiation patogen art, single-nucleotide polymorphisms och korta tandemupprepningar har rapporterats med hjälp av en kapillär polymer monolit kolumn som kan separera längre oligonukleotider 1,21,24-33.
I Japan och USA, har allvarliga matförgiftning inträffat på grund av felidentifiering och olämplig framställning av blåsfisk, och detta trots att distribution och framställning av blåsfisk är strikt kontrollerat av lagstiftning livsmedelssäkerhet 34,35. Dessutom gjorde ett avsiktligt mord med hjälp av blåsfisk extrakt förekommer i Japan 36. Därför är differentiering av Pufferfish arter krävs från både folkhälsan och rättsutredningsställningstaganden. Dessutom, eftersom Takifugu rubripes är mycket dyrare än andra typer av blåsfisk, behövs också en differentiering kapacitet i samband med utredningar mat bedrägeri.
Här, en detaljerad metod för att bestämma monoisotopic massa av en PCR-produkt med LC / ESI-MS med användning av en omvänd-fas-kiseldioxid monolit-kolonn och en hög upplösning masspektrometer beskrivs. Specifikt har den metod utvecklats för att tillåta differentiering av giftiga Pufferfish arter baserade på användning av PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) metoden 37, som är det första exemplet för arter differentiering av djur med hjälp av MS.
Protocol
1. DNA-extraktion
Obs: Använd ett separat rum för DNA-extraktion och efter PCR undersökningar såsom gelelektrofores och LC / ESI-MS. Lägg etanol för att tvättbuffert 1 (innehållande guanidinhydroklorid) och tvättbuffert 2 (ej innehållande guanidinhydroklorid) i enlighet med DNA-extraktion kit-protokollet. Fiskprover erhölls från fiskgrossister och detaljhandelsmarknader i Japan.
- Placera 30-50 mg fisk vävnad i en 0,5 ml eller 1,5 ml mikrocentrifugrör. Squash vävnaden med hjälp av en mikro-spatel (utom för fin och hud).
Obs: När det gäller fin, använd en 0,5 ml tub för blötläggning. - Lägg 180 ul av lyseringsbuffert och 40 pl proteinas K och skaka kort. Inkubera vid 56 ° C på en blockvärmare i 2 timmar eller över natten. Blanda genom att kort vortexa var 15 min under inkubation.
Notera: Komplett lys är inte nödvändigt. - Centrifugera i 5 minuter vid 13.000 x g. Efter centrifugering, om en liten amount av olja förekommer på ytan när det gäller en fettprov, såsom lever, kassera den. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 200 pl av det kaotropa buffert innehållande guanidinhydroklorid och blanda genom att vortexa. Tillsätt 200 pl etanol (99,5%) och blanda genom att vortexa igen.
- Överför blandningen in i spinnkolonn placerades i ett 2 ml uppsamlingsrör. Centrifugera under 1 min vid 13000 x g. Kassera genomströmning.
Varning: Tillsätt inte blekmedel till avfallet eftersom guanidin kan bilda mycket reaktiva föreningar med blekmedel. - Tillsätt 500 | il av tvättbufferten 1 (innehållande guanidinhydroklorid) och centrifugera i 1 min vid 13000 x g. Kasta flödet genom och provröret.
- Placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör som medföljer kitet. Tillsätt 500 | il av tvättbufferten 2 och centrifugera under 3 min vid 20000 x g. Kassera genomströmning och uppsamlingsröret. Överföra spinnkolonn i ett annat1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Pipettera 200 | il av elueringsbufferten till centrum av den centrifugeringskolonn membranet. Efter 1 minut, centrifugera i 1 min vid 6000 x g.
- Pipettera 50 | il av eluatet på en engångs UV kyvett och mäta UV-spektrumet av eluatet vid 220 till 300 nm och absorbansen vid 260 nm med användning av en spektrofotometer.
- Kontrollera UV-spektrumet av DNA med toppen vid 260 nm. Beräkna den ungefärliga DNA-koncentrationen med användning av den enkla ekvationen "DNA-koncentration (ng / ul) = absorbans vid 260 nm x 50".
Obs: Typiska DNA-koncentration som extraherats från fenorna av blåsfisk är 63 ± 30 ng / l (n = 20). - Om DNA-koncentrationen är högre än 10 ng / ul, späda DNA-proven med Tris-EDTA (TE) buffert (pH 8) till 5 ng / ul.
- Lagra provet vid -20 ° C eller gå vidare till PCR-amplifiering (avsnitt 2).
2. PCR
- Inrättat 25 pl PCR för varje extragerade DNA-prov, positiv kontroll (0,2 pm syntetiserade oligonukleotid med målsekvensen i TE-buffert pH 8,0) och negativ kontroll (ultrapurified vatten i stället för DNA-prov) på is enligt tabell 1 och 2 på en ren bänk för att undvika kontaminering.
Obs! För enkelt handhavande, göra tillräcklig mängd cocktail som innehåller alla reagenser utan mall-DNA och fördela den. Använda DNA-polymeras med korrekturläsning aktivitet för att undvika tillsats av 3 'A överhäng till PCR-produkten. - Utföra PCR-amplifiering på en anordning för cyklisk värmebehandling med användning av cykelprogram som visas i tabell 3.
3. Enzymatisk Digestion
- Tillsätt 2 | il av lösningen innehållande 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol och 500 mM NaCl till PCR-lösning.
- Tillsätt 1 pl av varje restriktionsenzym (Dral och Msp I) och blanda försiktigt. Inkubera i 30 min vid 37 ° C på thErmal cykelapparat.
- Inkubera under 5 min vid 72 ° C för att aktivera den återstående DNA-polymeras, som fyller den klibbiga änden genereras av Msp I.
- Valfritt: Analysera varje 2,5 | il av reaktionslösningen genom polyakrylamid-gelelektrofores med användning av en tvärlänk-förhållande (% C, i procent av bisakrylamid) av 3,33 (vikt-%) och en polyakrylamidgel koncentration (% T) av 15 (% vikt / volym) 38. Fläcka gelén med användning av den fluorescerande DNA-fläcken och observera dubbelsträngat DNA på ett blått ljus transilluminator med användning av en bärnstensfärgad skärm.
- Filtrerades reaktionslösningen med en 0,2-0,5 um centrifugal filteranordning för att förhindra igensättning, vilket skulle skada den analytiska kolonnen.
- Överför filtratet till en avsmalnande polypropen ampull och förvara vid -20 ° C fram till analys.
4. LC / ESI-MS-analys
- Väg 67,2 g (ca 42 ml) i HFIP och 1,52 g (ca 2,0 ml) av TEA i en 1 L flaska. Lägg 955 ml ultrapurified vatten (LC / MS grade) och rör om med hjälp av en magnetisk omrörare tills reagensen är fullständigt upplösta. Ta en portion av lösningen och kontrollera pH (mellan 7,85 och 7,95, helst pH = 7,9) med en pH-mätare.
Obs: inte tillbaka portion till flaskan för att undvika kontaminering av metalljoner. Om pH är inte 7,9, tillsätt en liten mängd av antingen HFIP eller TEA för att justera pH och mäta pH-värdet på nytt. - Anslut flaskan till linje A i vätskekromatograf med kylning av flaskan med en direktkylning bärbar kylskåp (för hushållsbruk) för att förhindra förångning. Anslut en annan flaska fylld med metanol till linje B.
- Anslut skyddskolonnen och den analytiska kolonnen (2,0 x 50 mm, mesoporvolym size = 30 nm) till vätskekromatografen. Börja flöda den initiala mobila fasen (95% A och 5% B) för att jämvikta kolonnerna.
- Förbereda 0,5 mg / ml natrium-trifluoracetat (pH 3,5) som en kalibrerings 39.
- Väg 50 mg (ca 34 l) av trifluorättiksyra acid i en bägare.
- Tillsätts 30 ml ultrapurified vatten och titrera till pH 3,5 med 10 mM natriumhydroxid med hjälp av en pH-mätare.
- Fyll upp till 50 ml med ultrapurified vatten. Tillsätt 50 ml acetonitril (LC / MS grade) och blanda.
- Ta en del av arbetslösning och förvara det i rumstemperatur. Lagra resten av lösningen vid 4 ° C.
- Reducera kvävetryck av C-fällan enligt följande.
Notera: Senaste Fouriertransformen masspektrometrar, som är lämpliga för intakt proteinanalys, ha kontroll programvara för att styra trycket.- Ta bort den vänstra övre luckan på masspektrometer. Den C-fällan ventilen är i hörnet av den vänstra förgrunden.
- Kontrollera högvakuum tryckvärde i fönstret instrumentstatus av styrmjukvaran.
Obs: Värdet är typiskt 3 x 10 -8 bar. - Dra ratten för att låsa upp och vrida vredet moturs mycket långsamt för att minska den höga vakuumpressure till 1/3 (typiskt 1 x 10 -8 bar). Den angivna trycket bör förändras gradvis på ett fördröjt sätt. Ignorera varningen om lågt tryck. Tryck på knappen för att låsa.
- Återställa den övre luckan för säkerheten.
- Kalibrera masspektrometer med natrium trifluoracetat 39.
Obs: Dagliga masskalibrering kan ersättas med detta protokoll, dock, den rekommenderade kalibreringen föreslås av tillverkaren borde ha slutförts före denna kalibrering.- Ställ scan parametrar och uppvärmda ESI källparametrar i instrumentet kontrollboxen av trimprogram enligt följande: skanningstyp fullt MS; avsökning m / z 500-4,000; fragmentering (i-source kollision dissociation (CID) spänning 60 eV, polaritet negativ, automatisk förstärkningskontroll (AGC) mål 1 x 10 6, maximal injicera tiden 50 ms, mantel Gasflödet 5, aux Gasflödet 0; svepgas flödeshastighet 0, spray spänning 3 kV, kapillär temperatur 320 ° C; S-objektiv radiofrekvent (RF) nivå 100; värmartemperatur 30 ° C.
- Mata in listan över negativa joner som ska övervakas som m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045.
- Flytta den uppvärmda ESI sonden närmare gränsytan av masspektrometer (läge B). Ansluta sonden och en spruta med ett rör.
- Ingjuta kalibrerings ständigt vid en flödeshastighet av 10 | il / min med användning av den inbäddade sprutpump. Kolla bara 6 lägre mass-joner (m / z 792,85908-2152,60717) i den anpassade kalibreringstabellen.
- Fortsätt med kalibreringen efter intensiteten av signalerna är stabiliserade. Efter kalibreringen, ta endast de sex högre mass-joner (m / z 1880,65755 till 3376,38045) och fortsätt med kalibreringen. Undvik kalibrera med hjälp av alla joner på en gång för att undvika fel.
- Ställ scan parametrar och uppvärmda ESI källparametrar i instrumentet kontrollboxen av trimprogram enligt följande: skanningstyp fullt MS; avsökning m / z 500-4,000; fragmentering (i-source kollision dissociation (CID) spänning 60 eV, polaritet negativ, automatisk förstärkningskontroll (AGC) mål 1 x 10 6, maximal injicera tiden 50 ms, mantel Gasflödet 5, aux Gasflödet 0; svepgas flödeshastighet 0, spray spänning 3 kV, kapillär temperatur 320 ° C; S-objektiv radiofrekvent (RF) nivå 100; värmartemperatur 30 ° C.
- Förflytta sonden till appropriate positionen för en flödeshastighet av 0,4 ml / min (läge D) och ansluta till vätskekromatograf med en inert metallröret.
- Ställ in uppvärmda ESI källparametrar i instrumentet kontrollboxen av trimprogram enligt följande: mantelhastighet gasflödet 50; aux gasflödeshastighet 15; svephastighet gasflöde 1; Spraya spänning 2,5 kV; kapillär temperatur 350 ° C; S-objektiv RF nivå 100; värmartemperatur 350 ° C.
- Ställ förvärvs parametrar för masspektrometern i den instrumentala inställningsfönstret enligt följande: metod varaktighet 8 min; avleda ventil, 3,5-6 min till masspektrometer, 0-3,5 och 6-8 minuter till spillo; runtime 3,5-6 min; polariteten negativ; i käll CID spänning 15,0 eV; microscans 3; nominell upplösning effekt (vid m / z 200) 140000; AFR-målet 1 x 10 6; maximal jon tid 50 ms; antal svep 1; avsökning m / z 700-3,500; spektrum datatyp profil.
- Ställ parametrar för vätskekromatograf enligt följande: kolonn ugnstemperatur 20 ° C; sample fack temperatur 10 ° C; gradientprogram 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6- 6,05 min 98-5% B, 6,05-8 min 5% B; flödeshastighet 0,4 ml / min.
- Purge bubblor genom att trycka på botten av flaskorna. Ställ provflaskor på provstället och injicera 1,0 pl av ett prov med hjälp av autosampler för att starta analysen.
- Öppna rå datafiler med webbläsare och bekräfta att alla förvärv framgångsrikt avslutat, inklusive positiva och negativa kontroller.
Notera: Typiskt skulle två eller tre toppar observeras i den totala jonströmmen kromatogram vid en retentionstid av 4-5,5 min när blåsfisk-DNA amplifierades framgångsrikt och digereras.
5. Deconvolution och tolkning
- Starta avfaltning programvara. Välj experiment typ "auto extrakt (isotop löst)".
- Redigera en metod som använder följande parametrar: output massa M; S / N Tröskelvä rded 3, relativ överflöd tröskel 0; negativ laddning ja; beräkna heras jonström kromatogram (XIC) ja, m / z intervall 700-3,500; laddningsbärare H +; minsta antalet upptäckta avgift 3; isotopförhållande nukleotid; passningsfaktorn 80%; Resten tröskel 0%; överväga överlappningar ja; debitera intervallet 3-50; minimistyrka 1; förväntade intensitetsfelet 3.
- Spara som en ny metod och välj det.
- Välj den katalog där rå datafiler existerar. Välj rå datafiler som ska analyseras och klicka på "Add to Queue" knappen.
- Klicka på "Kör" knappen på fliken "Run Kö 'för att starta avfaltning.
- Efter kön är klar väljer en rad och klicka på "Öppna Result" i den övre bildtexten för att få resultaten av avfaltning.
- Tolka resultaten från enkla isotoper massorna härledda från topparna vid en retentionstid av 4-5,5 min med hjälp av tabell 4.
Representative Results
Tre kommersiellt tillgängliga kolonner utvärderades för separation av långa oligonukleotider vid flödeshastigheter av 100-400 | j, l / min. Ett brett porer oktadecyl kolkedja (C 18) -bunden partikelkiselkolonn (a), en kommersiellt tillgänglig poly (styren-divinylbensen) (PS-DVB) monolit kolumn (b) och en C 18 -bunden kiseldioxid monolit kolonn ( c) jämfördes (figur 1). Tre par av de DNA-duplex (26, 37 och 53 bp) separerades med användning av alla kolumner, och den C 18 -bunden kiseldioxid monolit kolonn användes i efterföljande studier.
Representativa resultat för analys av ett DNA-prov extraheras från muskeln av T. rubripes visas i figur 2. Isotopiskt upplösta toppar, såsom visas i figur 2a, krävs för att framgångsrikt beräkning av monoisotopisk massa. Den teoretiska och measureras monoisotopisk massa av T. rubripes visas i figur 2b. Eftersom spjälkning med endonukleaserna utförs precis efter PCR-amplifiering utan rening är den 3'-klibbig ände som genereras av Mspl endonukleas fylls upp med det återstående DNA-polymeras. Enligt analysen av amplikoner härledda från de syntetiska DNA-mallar, massnoggrannhet varierade från -2,48 till 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm i genomsnitt, n = 280). Således var en massa tolerans på 3 ppm används för att differentiera arter (tabell 4). Med hjälp av tabellen, samtliga Pufferfish prover från marknader och butiker ordentligt differentierade som specifika arter 37.
Enligt den periodiska analysen av provet som erhållits från den syntetiska DNA-mallen för T. chrysops, alla av enkla isotoper massorna analyt framgångsrikt bestämmas inom ± 3 ppm under least 180 timmar utan någon mass kalibrering (Figur 3). Detta innebär att mass kalibrering skulle krävas på veckobasis.
Figur 1: Totala jonström kromatogram av PCR-RFLP produkt som härrör från den syntetiserade DNA-mallen för T. pardalis användning av en C 18 -bunden partikelformig kiseldioxid-kolonn (a, 3 x 250 mm, partikelstorlek 3 ^ m), en poly (styren-divinylbensen) (PS-DVB) monolit kolumn (b, 1,0 x 250 mm) och en C 18 -bunden monolit kiseldioxidkolonn (c, föreliggande metod) villkor för (a):. flödeshastighet 0,2 ml / min; Förhållandet mellan metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Villkor för (b):flödeshastighet 0,1 ml / min; Förhållandet mellan metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. Temperaturen för båda kolonnerna var 20 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa resultat för att analysera råa muskel T. rubripes. (a) Typiska total jonström kromatogram och masspektrum. (B) Teoretiska och uppmätta enkla isotoper massorna av PCR-RFLP som härrör från den syntetiserade DNA-mallen för T. rubripes. Klicka här för att se en storr version av denna siffra.
Figur 3:. Stabilitetstest Digested amplikoner härledda från det syntetiska DNA av T. chrysops analyserades varje 10 timmar. Mass kalibrering utfördes inte under testet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| namn | Sekvens |
| lago86F | 5'-CCATGTGGAATGAAAACACC-3' |
| taki114F | 5'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3' |
| fugu86-114R | 5'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3' |
Tabell 1: PCR-primers.
| PCR-reagens | volym används | slutkoncentration |
| Ultrapurified vatten | 15.75 | il | |
| Tvättmedel fria 5x buffert | 5,0 | il | 1x |
| dNTP-blandning (10 mM vardera) | 0,5 ^ | 0,2 mM |
| Primer mix (10 ^ M vardera av lago86F, taki114F och fugu86-114R i TE-buffert pH 8,0) | 1,0 | il | 0,4 ^ M vardera |
| DNA-polymeras (2,5 enheter / ^ il) | 0,25 | j, l | 0,1 enhet / pl |
| Mall-DNA i TE-buffert pH 8,0 (5,0-10 ng / mikroliter för extraherat prov, 0,2 | iM för syntetiskt DNA som positiv kontroll) | 2,5 ^ | 0,5-1,0 ng / | j, l för extraherat DNA och 20 nM för syntetiskt DNA |
| Totalt: 25 pl |
Tabell 2: Komponenter i en 25 pl skala PCR.
| Cykel | Skick | Fungera |
| 1 | 2 min vid 95 ° C | initial denaturering |
| 2 | 30 s vid 95 ° C | denaturering |
| 3 | 30 sekunder vid 56 ° C | glödgning |
| 4 | 30 s vid 72 ° C | Förlängning |
| 5 | Upprepa 2-4 (totalt 30 cykler) | |
| 6 | 7 min vid 72 ° C | slutlig Töjning |
| 7 | Håll vid 12 ° C tills avlägsnande av provet |
Tabell 3: PCR-program.
| Högsta antalet på uppehållstid av 4,0-5,5 min | Monoisotopisk massa av det tredje toppen i intervallet (Da) | Monoisotopisk massa av den andra toppen i intervallet (Da) | Pufferfish arter | ||
| mindre sträng | större strängen | mindre sträng | större strängen | ||
| 2 | → | → | 15890,707 till 15890,803 | 16177,531 till 16177,629 | L. inermis |
| 15921,702 till 15921,797 | 16146,537 till 16146,634 | L. gloveri | |||
| 15930,713 till 15930,809 | 16137,525 till 16137,622 | L. lunaris | |||
| 15937,697 till 15937,792 | 16131,537 till 16131,634 | L. wheeleri | |||
| 24173,034 till 24173,179 | 24566,905 till 24567,053 | T. chrysops | |||
| 3 | 16295,706 till 16295,804 | 16467,610 till 16467,709 | 11341,851 till 11341,919 | 11466,875 till 11466,944 | T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus |
| 11654,908 till 11654,978 | 11770,920 till 11770,991 | T. niphobles | |||
| 16296,701 till 16296,799 | 16468,605 till 16468,704 | → | → | T. rubripes | |
| 16311,701 till 16311,799 | 16452,610 till 16452,709 | → | → | T. poecilonotus T. exascurus | |
| 16320,713 till 16320,811 | 16443,599 till 16443,697 | → | → | T. porphyreus T. obscurus | |
| 16599,751 till 16599,851 | 16780,667 till 16780,767 | → | → | T. vermicularis | |
Tabell 4: Differentiering av pufferfish från monoisotopisk massorna som härrör från LC / ESI-MS.
Tabell 5: Amplified DNA-sekvensen (a) Sekvensen är identisk med.de övriga Pufferfish arter som anges i tabell 4. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Discussion
För att extrahera DNA, är ett kommersiellt kit för att utvinna DNA från blod och vävnader som används i enlighet med protokollet av tillverkaren mindre modifiering (mängd proteinas K och centrifugering av lys lösning). Emellertid kan vilken som helst extraktion kit användas så länge som cellulärt DNA kan extraheras med tillfredsställande återhämtning och renhet för PCR. Denna metod har testats med muskler, fena, lever, äggstockar och hud 37. Fin är särskilt lämplig på grund av den stora ytan, vilket möjliggör snabb lys med proteinas K. färska, frysta, torkade, kokt och bakade Pufferfish prover testades framgångsrikt 37.
PCR-primer set (tabell 1) är avsedd för blåsfisk och förstärker mitokondriella 16S ribosomala RNA-genen av blåsfisk. Mål-DNA för att amplifiera är 114-115 bp (släktet Takifugu) och 86 bp (släktet Lagocephalus) (tabell 5). För att underlätta metoden development, syntetiserades oligonukleotider med målsekvenserna användas för referens istället för att samla autentiska Pufferfish prover. Primer set kan ersättas av en annan primer in som svar på syftet bör dock slutliga DNA längd efter enzymatisk spjälkning vara mindre än 100 nt när det gäller att upprätthålla kvaliteten på masspektrum krävs för en lyckad avfaltning. Dessutom bör kvävetryck i den C-fällan minskas när målet oligonukleotiden är längre än ca 75 nt och kvaliteten på masspektrumet är otillräcklig för framgångsrik avfaltning. Sådana begränsningar kan styras genom den senaste utvecklingen i instrumentets programvara, annars ventilen för C-fällan inuti chassit måste vara inställda som beskrivs i protokollet avsnitt. När det gäller provberedning, är avgörande för den efterföljande LC när det gäller lämplig toppform, tillräcklig toppintensiteten och stabil uppehållstid 31 användning av tvättmedelsfria reagens.
21,24-33, en C 18 omvänd fas partikelformig silikakolonn 23,40,41 och en hydrofob interaktionskromatografi (HILIC) kolumn 42 har använts för LC / ESI-MS-analys av oligonukleotider. Bland dem är den kapillära monolit kolumnen överlägsen de andra när det gäller separationskapacitet, var dock kapillär monolit kolonn som användes i tidigare studier görs internt och arbetar vid en låg flödeshastighet (2 ul / min), vilket kräver instrumentering tillägnad mikro LC. För att underlätta enkel användning, var kommersiellt tillgängliga kolonner utvärderas för separationen av långa oligonukleotider vid högre flödeshastigheter (100 till 400 | j, l / min). Tre par av DNA-duplex (26, 37 och 53 bp) separerades med användning av de ovan nämnda kolonner är emellertid de cykeltider av C 18 -bunden partikelformig kiseldioxid-kolonn och PS-DVB monolit kolonn var 65 och 70 min, respektive , medan den hos den C
Jonpar-kromatografi är vanligen används för MS-kompatibel separation av oligonukleotider. Men en jon-par reagens stör i allmänhet med ESI processen och minskar känsligheten hos ESI-MS. Därför är HFIP ofta används för den mobila fasen för att förbättra känsligheten av oligonukleotiden. Emellertid HFIP (kokpunkt 59 ° C) förångas snabbt vid gränssnittet innan metanol (kokpunkt 65 ° C) och, därför, denna förlust av lösningsmedel ökar pH och främjar dissociation av jonpar-reagens (dvs, TEA)från oligonukleotiden. Eftersom den nuvarande metoden utnyttjar en uppvärmd ESI sond, som nebulizes eluatet med varm kvävgas vid 350 ° C, kan denna effekt vara över betonas. I stället för HFIP-TEA-buffert, Erb och Oberacher rekommenderade cyclohexyldimethylammonium acetat (CycHDMAA, pH 8,4) för genotypning analys på grund av en minskning av adduktbildning med spårmetalljoner 33. Författarna drog slutsatsen att CycHDMAA självt undertryckte bildningen av metall addukten. Trots litteraturen har betydande adduktbildning inte observerats i föreliggande metod. Dessutom är anmärkningsvärd fördel med HFIP-TEA-metanol-system som den topp som erhölls med HFIP-TEA-metanol-systemet var 17 gånger större än den som erhålls från CycHDMAA-acetonitrilsystem när man analyserar en 86 bp amplikon av T. poecilonotus (data ej visade). En nackdel med HFIP-TEA-metanol-system är emellertid de ökade kostnaderna i förhållande till CycHDMAA-acetonitrilsystem.
Beräkning av enkla isotoper massa kräver separation av isotop toppar multiplicera laddade joner. Därför är upplösningen kritiskt för den föreliggande analysen. Även erforderlig upplösning makt beror på baspar längd analyt konventionella TOF analysatorer, som har en upplösning makt flera tiotusentals, kan begränsas för analys av korta oligonukleotider.
De teoretiska monoisotopisk massor som visas i Tabell 4 beräknades från motsvarande baskompositioner av analyterna. Alternativt Muddiman et al. Utvecklat ett program för att beräkna baskompositionen från den exakta massan 43. Ett liknande program integrerades i automatiserad ESI-MS-system 16-18. Användningen av dessa algoritmer kan förbättra robustheten hos föreliggande förfarande eftersom en uppmätt monoisotopisk massa inte alltid överensstämmer med en unik baskomposition ovinge till massan tolerans på 3 ppm till följd av den oundvikliga fel mätningen. Tyvärr, vi kunde inte få dessa program för den aktuella studien.
Den nuvarande monoisotopisk massbaserad bestämning art kan vara lämpliga inte bara för differentieringen av blåsfisk utan även för detektering av andra DNA-polymorfismer eftersom den nuvarande metoden bygger på att analysera baskompositionen och inte innebär ett förfarande som särskilt utformade för blåsfisk. Som för påvisande av DNA-polymorfism, är den dedikerade ESI-MS-system helt automatiserad och enkel att använda, som kan vara lämpliga för diagnostisk användning, såsom detektion av patogener 15,17,18,20,30. Omvänt är den nuvarande metoden genomförbar med gemensamma forsknings instrument och apparater och därför lämpar sig för forsknings användningsområden. ESI-MS har redan använts för humant DNA-polymorfism som single nucleotide polymorphism 13,28,32, kort tandem upprepning 26Och mitokondrie-DNA analsis 16,19. Micro RNA analyserades också genom kapillär LC / ESI-MS 44. Dessa publicerade ansökningar kan också realiseras genom föreliggande metod. Dessutom kan denna metod vara lämplig för att övervaka växelverkan mellan oligonukleotid och låg molekylvikt föreningar, såsom interaktionen av antibiotika och ribosomalt RNA 45 på grund av separationen vid låg temperatur. I sådana fall, oligonukleotider och låg molekylvikt föreningar bör detekteras samtidigt, vilket är en fördel med att använda LC / ESI-MS.
Det finns en begränsning som instrumente inte är lämpligt för att utföra parallell analys som i konventionella tekniker såsom Sanger-sekvensering och realtids-PCR. Dessutom identifierar den föreliggande metoden bara baskomposition och varje bas substitution inom samma molekyl kan inte särskiljas. Emellertid kan MS-baserad DNA-analys som beskrivs här fortfarande har meriter i termins av noggrannhet i jämförelse med den DNA-bindande färgämnesbaserade tekniker såsom gelelektrofores och realtids-PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
| TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
| PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
| Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
| Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
| Detergent Free 5x Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
| Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
| dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
| 10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
| Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
| Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
| Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
| Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
| Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
| UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
| Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
| Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
| 300 μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
| Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
| Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
| Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
| Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
| ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
| Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
| Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
| Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
| Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
| Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |
References
- Oberacher, H. On the use of different mass spectrometric techniques for characterization of sequence variability in genomic DNA. Anal. Bioanal. Chem. 391, 135-149 (2008).
- Banoub, J. H., Miller-Banoub, J., Jahouh, F., Joly, N., Martin, P. Chapter 1, Overview of recent developments in the mass spectrometry of nucleic acid and constituents. Mass spectrometry of nucleosides and nucleic acids. Banoub, J. H., Limbach, P. A. 1, CRC Press. 1-90 (2010).
- Yergey, J., Heller, D., Hansen, G., Cotter, R. J., Fenselau, C. Isotopic distributions in mass spectra of large molecules. Anal. Chem. 55, 353-356 (1983).
- Zubarev, R. A., Demirev, P. A. Isotope depletion of large biomolecules: Implications for molecular mass measurements. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 149-156 (1998).
- Null, A. P., Muddiman, D. C. Determination of a correction to improve mass measurement accuracy of isotopically unresolved polymerase chain reaction amplicons by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1714-1722 (2003).
- Hu, Q., Noll, R. J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M., Cooks, R. G. The Orbitrap: a new mass spectrometer. J Mass Spectrom. 40, 430-443 (2005).
- Senko, M. W., Beu, S. C., McLaffertycor, F. W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6, 229-233 (1995).
- Horn, D. M., Zubarev, R. A., McLafferty, F. W. Automated reduction and interpretation of high resolution electrospray mass spectra of large molecules. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 320-332 (2000).
- Frahm, J. L., Mason, C. J., Muddiman, D. C. Utility of accurate monoisotopic mass measurements to confidently identify lambda exonuclease generated single-stranded amplicons containing 7-deaza analogs by electrospray ionization FT-ICR mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 234, 79-87 (2004).
- Frahm, J. L., Muddiman, D. C. Nucleic Acid analysis by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry at the beginning of the twenty-first century. Curr. Pharm. Des. 11, 2593-2613 (2005).
- Null, A. P., George, L. T., Muddiman, D. C. Evaluation of sample preparation techniques for mass measurements of PCR products using ESI-FT-ICR mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 338-344 (2002).
- Null, A. P., Benson, L. M., Muddiman, D. C. Enzymatic strategies for the characterization of nucleic acids by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2699-2706 (2003).
- Manduzio, H., Ezan, E., Fenaille, F. Evaluation of the LTQ-Orbitrap mass spectrometer for the analysis of polymerase chain reaction products. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 3501-3509 (2010).
- Manduzio, H., Martelet, A., Ezan, E., Fenaille, F. Comparison of approaches for purifying and desalting polymerase chain reaction products prior to electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Biochem. 398, 272-274 (2010).
- Hofstadler, S. A., et al.
- Eduardoff, M., et al. Mass spectrometric base composition profiling: Implications for forensic mtDNA databasing. Forensic Sci. Int. Genet. 7, 587-592 (2013).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J. Clin. Microbiol. 51, 40-45 (2013).
- Legoff, J., et al. Broad-range PCR-electrospray ionization mass spectrometry for detection and typing of adenovirus and other opportunistic viruses in stem cell transplant patients. J. Clin. Microbiol. 51, 4186-4192 (2013).
- Kiesler, K. M., Coble, M. D., Hall, T. A., Vallone, P. M. Comparison of base composition analysis and Sanger sequencing of mitochondrial DNA for four U.S. population groups. Forensic Sci. Int. Genet. 8, 226-232 (2014).
- Bacconi, A., et al. Improved sensitivity for molecular detection of bacterial and Candida infections in blood. J. Clin. Microbiol. 52, 3164-3174 (2014).
- Huber, C. G., Oberacher, H. Analysis of nucleic acids by on-line liquid chromatography-mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 20, 310-343 (2001).
- Pourshahian, S., McCarthy, S. M. Chapter 4, Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography and mass spectrometry. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. Bonilla, J. V., Srivatsa, G. S. , CRC Press, Chapter. 137-166 (2011).
- Apffel, A., Chakel, J. A., Fischer, S., Lichtenwalter, K., Hancock, W. S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 69, 1320-1325 (1997).
- Premstaller, A., Oberacher, H., Huber, C. G. High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of single- and double-stranded nucleic acids using monolithic capillary columns. Anal. Chem. 72, 4386-4393 (2000).
- Oberacher, H., Oefner, P. J., Parson, W., Huber, C. G. On-Line Liquid Chromatography Mass Spectrometry: A Useful Tool for the Detection of DNA Sequence Variation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 3828-3830 (2001).
- Oberacher, H., Parson, W., Muhlmann, R., Huber, C. G. Analysis of polymerase chain reaction products by on-line liquid chromatography-mass spectrometry for genotyping of polymorphic short tandem repeat loci. Anal. Chem. 73, 5109-5115 (2001).
- Oberacher, H., Huber, C. G. Capillary monoliths for the analysis of nucleic acids by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Trends Anal. Chem. 21, 166-174 (2002).
- Oberacher, H., et al. Re-sequencing of multiple single nucleotide polymorphisms by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 30, e67 (2002).
- Oberacher, H., Parson, W., Holzl, G., Oefner, P. J., Huber, C. G. Optimized suppression of adducts in polymerase chain reaction products for semi-quantitative SNP genotyping by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 1897-1906 (2004).
- Mayr, B. M., et al. Identification of bacteria by polymerase chain reaction followed by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 4563-4570 (2005).
- Oberacher, H., Niederstatter, H., Casetta, B., Parson, W. Some guidelines for the analysis of genomic DNA by PCR-LC-ESI-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 124-129 (2006).
- Beer, B., et al. CYP2D6 genotyping by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 400, 2361-2370 (2011).
- Erb, R., Oberacher, H. Comparison of mobile-phase systems commonly applied in liquid chromatography-mass spectrometry of nucleic acids. Electrophoresis. 35, 1226-1235 (2014).
- Cohen, N. J., et al. Public health response to puffer fish (Tetrodotoxin) poisoning from mislabeled product. J. Food Prot. 72, 810-817 (2009).
- Cole, J. B., et al. Tetrodotoxin poisoning outbreak from imported dried puffer fish--Minneapolis, Minnesota 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 63, 1222-1225 (2015).
- Ohno, Y., et al. The influence of tetrodotoxin on the toxic effects of aconitine in vivo. Tohoku J. Exp. Med. 167, 155-158 (1992).
- Miyaguchi, H., Yamamuro, T., Ohta, H., Nakahara, H., Suzuki, S. Genotyping of Toxic Pufferfish Based on Specific PCR-RFLP Products As Determined by Liquid Chromatography/Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 63, 9363-9371 (2015).
- Sambrook, J. F., Russell, D. W. Neutral polyacrylamide gel electrophoresis. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 40-46 (2001).
- Moini, M., Jones, B. L., Rogers, R. M., Jiang, L. Sodium trifluoroacetate as a tune/calibration compound for positive- and negative-ion electrospray ionization mass spectrometry in the mass range of 100-4000 Da. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 977-980 (1998).
- Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 646-653 (2003).
- Chen, B., Bartlett, M. G. Evaluation of mobile phase composition for enhancing sensitivity of targeted quantification of oligonucleotides using ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry: application to phosphorothioate deoxyribonucleic acid. J. Chromatogr. A. 1288, 73-81 (2013).
- Gong, L., McCullagh, J. S. Analysis of oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to negative ion electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1218, 5480-5486 (2011).
- Muddiman, D. C., Anderson, G. A., Hofstadler, S. A., Smith, R. D. Length and base composition of PCR-amplified nucleic acids using mass measurements from electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 69, 1543-1549 (1997).
- Kullolli, M., Knorf, E., Arampatzidou, M., Tewari, M., Pitteri, S. J. Intact MicroRNA analysis using high resolution mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 80-87 (2013).
- Cummins, L. L., Chen, S., Blyn, L. B., Sannes-Lowery, K. A., Drader, J. J., Griffey, R. H., Hofstadler, S. A. Multitarget affinity/specificity screening of natural products: finding and characterizing high-affinity ligands from complex mixtures by using high-performance mass spectrometry. J. Nat. Prod. 66, 1186-1190 (2003).
