Introduction
Casa Ear Institute-organo del Corti 1 (HEI-OC1), le cellule sono derivati dal organo uditivo di un 1,2 topo transgenico. L'incubazione di una cella da questo topo transgenico a 33 ° C / 10% di CO 2 (condizioni permissive) induce l'espressione di un gene che innesca immortalare de-differenziazione e proliferazione accelerata; spostando le cellule a 39 ° C / 5% di CO 2 (condizioni non permissive) determina una diminuzione della proliferazione, differenziazione e, almeno nel caso di HEI-OC1, morte cellulare 2,3.
cellule HEI-OC1 sono stati clonati e caratterizzati nel nostro laboratorio oltre un decennio fa, e studi iniziali hanno indicato che essi esprimono specifici marcatori di cellule ciliate cocleari, come prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, ma anche i marcatori di supporto cellule come connessina 26 e recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-R) 2. Pertanto, è stato suggerito che HEI-OC1 potrebbe rappresentare un common progenitore per le cellule sensoriali e di sostegno dell'organo del Corti 2. Studi paralleli fornito una forte evidenza che archetipo farmaci ototossici come cisplatino, gentamicina e streptomicina indotto caspasi-3 attivazione in queste cellule, mentre i farmaci considerati non ototossici, come la penicillina, non 2,3. Pertanto, questa linea cellulare è stata proposta come un sistema in vitro per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella ototossicità e per lo screening del potenziale ototossicità o otoprotective di nuovi farmaci farmacologici. Si stima che le cellule HEI-OC1 sono stati utilizzati in più di centocinquanta studi pubblicati negli ultimi dieci anni.
Mentre guardando il potenziale effetto pro-apoptotico di diversi farmaci è stato l'obiettivo principale della maggior parte degli studi che coinvolgono questa linea cellulare, altri importanti processi cellulari come autofagia e senescenza hanno appena cominciato ad essere studiato in cellule HEI-OC1 4-7. iona recente studio condotto dal nostro laboratorio 8, abbiamo usato cellule HEI-OC1 per raccogliere un insieme completo di dati relativi a morte cellulare, la sopravvivenza, la proliferazione, senescenza e autofagia indotta da farmaci diversi farmacologici frequentemente utilizzate per la clinica. Abbiamo anche confrontato alcune delle risposte delle cellule HEI-OC1 con quelli da HEK-293 (cellule renali di embrioni umani) e HeLa (cellule epiteliali umane) che ricevono un trattamento identico. I nostri risultati indicano che le cellule HEI-OC1 rispondono alla ciascun farmaco in modo caratteristico, con una dose distintivo e sensibilità dipendente dal tempo per almeno uno dei meccanismi in esame. Abbiamo anche sottolineato che in studio che una corretta interpretazione dei risultati sperimentali richiederà l'esecuzione di studi paralleli con più di una tecnica 8.
In un altro studio abbiamo valutato l'uso di cellule HEI-OC1 per valutare la risposta funzionale di prestin, la proteina del motore delle cellule ciliate esterne cocleari (OHC) 9 + K + ATPasi, che translocated dalla membrana plasmatica al citoplasma, senza cambiamenti significativi nell'espressione cellulare totale. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule P-HEI-OC1 hanno un NLC robusta associata Prestin funzione motoria, che è diminuito quando la densità delle molecole Prestin presenti a livello della membrana plasmatica è aumentata. Complessivamente, questi risultati sostengono fortemente l'utilità della HEI-OC1 le cellule per indagare le proteine uditive.
In questo articolo il video viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1, perché è comodo da usare cellule in crescita in condizioni permissive (P-HEI-OC1) per gli studi di citotossicità, come valutare il meccanismo / s della citotossicità indotta da farmaci e come per eseguire studi elettrofisiologici (ad esempio, patch-clamp, capacità non lineare (NLC)) per indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del OHC cocleari.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cultura 1. cellulare
Nota: Tutti i protocolli di coltura cellulare devono essere eseguite utilizzando appropriate tecniche di coltura cellulare (per riferimento vedere i primi 3 capitoli di biologia cellulare: un manuale di laboratorio, Volume I 10). cellule HEI-OC1 non richiedono alcuna ulteriore rivestimento o il trattamento dei piatti di coltura cellulare per la corretta aderenza e la crescita. Molto importante: non utilizzare piatti bicchieri a fini di coltura cellulare; il fenotipo e la risposta biologica delle cellule ai farmaci farmacologici cambieranno (G Kalinec & F Kalinec, inedito); piatti tradizionali di coltura cellulare di plastica sono raccomandati (vedi Tabella dei materiali / attrezzature). Prestare particolare attenzione alle tecniche asettiche per evitare contaminazioni, ma mai usare antibiotici (ad esempio, ampicillina o streptomicina) con cellule HEI-OC1. Se necessario, utilizzare anfotericina B. Mentre le cellule HeLa e HEK-293 sono state usate come controllo in studi precedenti con HEI-OC1 8, qualsiasi altra linea cellulare potrebbeessere accettabile per questo scopo.
- Rianimazione di cellule congelate HEI-OC1
Nota: Questo protocollo può essere utilizzato anche con altre linee cellulari della stessa topo transgenico sviluppato nel nostro laboratorio, quali OC-k3, da organo di Corti 11,12 e SV-k1, dal stria vascularis 13,14.- Rimuovere una fiala di cellule HEI-OC1 crioconservati da N liquido 2, e metterlo in un bagno d'acqua a 37 ° C. Immergere solo la metà inferiore della fiala, e lasciarlo scongelare fino solo una piccola quantità di ghiaccio rimane nella fiala. Pulire l'esterno del flaconcino con il 70% di alcol.
- Pipettare le cellule dal flaconcino e fornire l'intero volume (~ 1,5 x 10 5 cellule / ml) lentamente, goccia a goccia, in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di un mezzo di crescita pre-riscaldato, come Modified mezzo di Eagle Dulbecco ( DMEM), integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS).
- Rimuovere DMSO mediante centrifugazione del tubo a 300-500 xg per 5 minuti, scartando tegli surnatante e ri-sospensione le cellule in 9 ml di terreno di coltura fresco (DMEM + 10% FBS). Disaggregare ciuffi o fogli di cellule dal flusso e riflusso delle cellule sospese, dalla pipetta al mezzo e viceversa, da tre a quattro volte con la punta della pipetta toccare il fondo della provetta.
- Posizionare il volume totale di cellule sospese in terreno di crescita in mm diametro 100 non trattati, piatti di plastica coltura cellulare.
- Incubare le cellule a 33 ° C con il 10% di CO 2 (condizioni permissive).
- Sottocultura di cellule HEI-OC1
Nota: Prima di confluenza (~ 80%) le cellule devono essere portati in sospensione e sub-coltivate per impedire la cultura morire. Questo protocollo può essere utilizzato anche con altre linee cellulari sviluppate nel nostro laboratorio dallo stesso animale transgenico, come OC-k3, da organo di Corti 11,12 e SV-k1, dal stria vascularis 13,14.- Rimuovere vecchi media e lavare le cellule con 2 ml di PBS. </ Li>
- Coprire il monostrato cellulare con una soluzione di 0,25% tripsina, utilizzando 1 ml ogni 25 cm 2 di superficie. Per passare alla fase successiva più del 40% delle cellule deve essere staccato. Esaminare le cellule utilizzando un microscopio invertito e, se necessario, "slap o toccare" i piatti della cultura delicatamente per rilasciare eventuali cellule attaccate rimanenti.
Nota: fare attenzione a come tripsinizzazione per lunghi periodi può causare la morte delle cellule; non è sufficiente e le cellule trasferito sarà insufficiente per gli studi previsti. - Risospendere le cellule, seguendo la procedura descritta al punto 1.1.3, e trasferirli in una provetta conica da 15 ml.
- Centrifugare per 5 min a 300-500 xg, scartare il medium, raccogliere le cellule con terreno di coltura fresco e seme in almeno quattro da 100 mm di diametro piatti di coltura cellulare. Il numero di cellule per piatto dipenderà dalla quantità di cellule recuperate. Incubare le cellule a 33 ° C con il 10% di CO 2 (P-HEI-OC1) e dividere nuovamente il numero di volte necessariogli esperimenti in programma o per la generazione di un nuovo magazzino.
- Per magazzino preparazione, sostituire 100 piatti mm di diametro di 250-550 ml fiasche di coltura cellulare; per gli esperimenti, i piatti più piccoli o piatti multi-pozzi possono essere più adeguato.
- Per la differenziazione, incubare cellule HEI-OC1 a condizioni permissive fino a raggiungere ~ 80% di confluenza; quindi spostare i piatti a 39 ° C con 5% di CO 2 (NP-HEI-OC1) per 2 o 3 settimane.
Nota: Le cellule saranno progressivamente smettere di proliferare e morire. Cambiare la media ogni altro giorno per rimuovere le cellule morte. A seconda del numero iniziale di cellule, di solito dopo ~ 4 settimane altri celle saranno disponibili per gli esperimenti. Differenziazione inizia non appena le cellule sono posti in condizioni NP, ma non tutte le cellule differenziare allo stesso passo. È importante sottolineare che, Prestin aumenta l'espressione e la localizzazione di membrana durante il processo di differenziazione (vedi Rappresentante dei risultati, figura 4), fornendo una qualitativae un'indicazione quantitativa del livello di differenziazione.
2. Drug citotossicità Studies
Nota: le cellule HEI-OC1 coltivati in condizioni permissive (P-HEI-OC1) sono raccomandate per questi studi (vedi Risultati rappresentativi, Figura 1).
- La vitalità cellulare (MTT Assay)
- Raccogliere le cellule P-HEI-OC1 seguendo la procedura descritta al punto 1.2 e le considero sia con un contatore di cellule automatica o emocitometro. Regolare la concentrazione di 2,0 x 10 5 cellule / ml.
- Seed le cellule su piastre da 96 pozzetti a fondo piatto chiare (100 pl per pozzetto), incubare una notte per il fissaggio al substrato, e poi trattare con i farmaci di interesse. Non dimenticare di includere gli spazi e le cellule trattate non (controllo)!
- Dopo il trattamento farmacologico (di solito 24 o 48 ore a 33 ° C), eseguire il test MTT seguendo il protocollo del produttore. In generale, I protocolli per questo test sono le seguenti operazioni:
- Aggiungere 10 ml di reagente MTT in ogni pozzetto.
- Incubare la piastra a 37 ° C per 2 a 4 ore fino a quando porpora è visibile, e quindi aggiungere 100 ml di MTT Detergente reagente ad ogni pozzetto. Non agitare la piastra.
- Coprire la piastra e lasciare al buio per 2 a 4 ore a 37 ° C.
- Utilizzare un lettore di piastre micropiastre per misurare l'assorbanza a 570 nm di ogni pozzetto, compresi gli spazi vuoti (terreno di coltura da solo). Normalizzare i dati utilizzando la OD media in cellule di controllo al 100% della vitalità.
- Caspase 3/7 attivazione del test
Nota: le cellule HEI-OC1 coltivati in condizioni permissive (P-HEI-OC1) sono raccomandati per questi studi.- Raccogliere le cellule HEI-OC1 seguendo la procedura descritta al punto 1.2 e le considero sia con un contatore di cellule automatica o un emocitometro. Regolare la concentrazione di 2,0 x 10 5 cellule / ml.
- Seme le cellule su white pareti piastre a 96 pozzetti (100 ml per pozzetto), incubare una notte per il fissaggio al substrato, e poi trattare con i farmaci di interesse. Non dimenticare di includere gli spazi e le cellule trattate non (controllo)!
- Dopo trattamento farmacologico (di solito 24 o 48 ore a 33 ° C), l'esecuzione del test caspasi seguente protocollo del rispettivo produttore. In generale, i protocolli per questo test sono le seguenti operazioni:
- Preparare i reagenti, mescolare bene, e permettere loro di equilibrare a temperatura ambiente.
- Rimuovere le cellule dal termostato e consentire le piastre equilibrare a temperatura ambiente.
- Aggiungere l'importo indicato di reagente in ogni pozzetto, facendo attenzione ad evitare la contaminazione incrociata non toccando pozzetti contenenti campioni diversi con gli stessi puntali delle pipette.
- Coprire la piastra e miscelare per 30 secondi utilizzando un agitatore per piastra a 300-500 giri al minuto.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per un periodo di almeno 30 min. determinvia e il periodo di incubazione ottimale empiricamente. Se la temperatura ambiente varia utilizzare un incubatore a temperatura costante, perché le fluttuazioni di temperatura incideranno lettura luminescenza.
- Misurare luminescenza in ciascun pozzetto, e normalizzare i valori utilizzando luminescenza media in cellule di controllo al 100% di attivazione delle caspasi.
- La divisione cellulare (proliferazione)
- Raccogliere le cellule HEI-OC1 seguendo la procedura descritta al punto 1.2 e le considero sia con un contatore di cellule automatica o un emocitometro. Regolare la concentrazione di 2,0 x 10 5 cellule / ml.
- Seed le cellule su piastre da 96 pozzetti a fondo piatto chiare (100 pl per pozzetto), incubare una notte a condizioni permissive per il fissaggio al substrato, e poi trattare con i farmaci di interesse. Non dimenticare di includere gli spazi e le cellule trattate non (controllo)!
- Un'ora dopo il trattamento, aggiungere a ciascun pozzetto 1 ml di preparato BrdU 100x (5-Bromo-2'-deoxyuricenare soluzione), e restituire le piastre per l'incubatore a 33 ° C.
- Dopo 12, 24 e 48 ore, rimuovere il terreno esistente da corrispondenti piastre e lavare bene una volta con PBS.
- Eseguire il dosaggio proliferazione cellulare seguendo il protocollo del produttore. In generale, i protocolli per questo test sono le seguenti operazioni:
- Preparare i reagenti, compresi fissaggio / soluzione denaturazione, tampone di lavaggio, soluzione di rilevazione anticorpo primario, soluzione di rilevazione anticorpo secondario, e la soluzione di BrdU come indicato nel protocollo del produttore.
- Aggiungere la soluzione di fissaggio / denaturazione in ciascun pozzetto, nelle quantità indicate nel protocollo del produttore, e mantenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere il / soluzione denaturazione di fissaggio e aggiungere l'anticorpo primario alla concentrazione indicata nel protocollo del produttore. Mantenere la piastra a temperatura ambiente per 1 ora.
- Rimuovere la soluzione con la formica primariaiBody, lavare la piastra 3 volte con tampone di lavaggio, e quindi aggiungere l'anticorpo secondario alla concentrazione indicata nel protocollo del produttore. Mantenere la piastra con l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere la soluzione con l'anticorpo secondario, lavare la piastra 3 volte con tampone di lavaggio, e aggiungere il substrato. Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere la soluzione STOP. Fate attenzione: Controllare il cambiamento di colore; se la soluzione diventa molto scuro, fermare la reazione prima del tempo di sviluppo standard di 10 min.
- Leggere l'assorbanza a 450 nm entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di stop.
- citotossicità
Nota: le cellule HEI-OC1 coltivati in condizioni permissive (P-HEI-OC1) sono raccomandati per questi studi.- Incubare a condizioni permissive, di solito per 24-48 ore, le cellule HEI-OC1 in terreno di coltura cellulare da solo (controllo) o media più i farmaci di interesse.
- Alla fine del trattamento, Lavare le cellule tre volte con PBS, e staccare usando 1 ml ogni 25 cm 2 di superficie di una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica per 3 min.
- Dopo aver staccato, raccogliere e agglomerare le cellule per centrifugazione a 3.000 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante, e macchiare le cellule per 15 minuti al buio con il reagente incluso nel test di citotossicità.
- Determinare il numero di cellule vive HEI-OC1 mediante citometria di flusso come indicato dal produttore del citometro a flusso.
- senescenza
- Incubare a condizioni permissive, di solito per 24-48 ore, le cellule HEI-OC1 in terreno di coltura cellulare da solo (controllo) o media più i farmaci di interesse.
- Determinare il numero di cellule positive senescenza associate beta-galattosidasi mediante citometria a flusso con il protocollo descritto da Debacq-Chainiaux et al. 15 o un altro metodo conosciuto per fornire risultati attendibili. Una breve protocollo per citometria a flusso è il seguente:
- <li> Al termine dei trattamenti sperimentali, lavare le cellule tre volte con PBS e poi incubare con 100 nM bafilomicina A1 nel terreno di coltura per 1 ora a condizioni permissive.
- Aggiungere C12FDG ad una concentrazione finale di 33 pM ~, e continuare incubando le cellule per 1-2 ore.
- Lavare le cellule due volte con PBS, raccolto utilizzando 1 ml ogni 25 cm 2 di superficie di una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica per 3 min, e li pellet per centrifugazione a 3000 xg per 5 min.
- Risospendere le cellule in PBS freddo e determinare il numero di cellule HEI-OC1 positivi mediante citometria di flusso, come indicato dal costruttore del citometro a flusso.
- Raccogliere le cellule HEI-OC1 controllo e fame (privi di siero per 48 ore) seguendo la procedura descritta al punto 1.2, e li elaborano per Western Blot seguenti protocolli standard. In generale, i protocolli per Western blot hanno il seguente stEPS:
- Seme cellule HEI-OC1 a 6 pozzetti ad una concentrazione di 1,0 x 10 5 cellule / ml. Dopo 24 e / o 48 ore, lavare le cellule con PBS ghiacciato.
- Lyse con 200 ml di TNESV tampone (1% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 2mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4) con cocktail di inibitori delle proteasi e 1 mm PMSF per 5 minuti in ghiaccio.
- Raccogliere le cellule (raschiando il fondo di ciascun pozzetto), trasferimento in provette da microcentrifuga e centrifugare a 16.800 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Raccogliere il surnatante e quantificare la concentrazione di proteine utilizzando il BCA Assay.
- Aggiungere loading buffer 5x e 1 mM DTT a ciascun campione e far bollire per 5 minuti per denaturare le proteine.
- Eseguire i campioni utilizzando SDS-PAGE su un gel 4-12%, e il trasferimento alle membrane PVDF.
- Bloccare le membrane con 5% nonfat latte in polvere in TBS-T con 0,1% Tween 20 per 60 minuti a RT.
- Incubare le membrane notte a 4 ° C con ant primariaibodies.
- Il giorno dopo, lavare le membrane a lungo con TBS-T, e incubare con anticorpi IgG secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (1: 1.500) per 1 ora.
- Rilevare immunoreattività con un sistema di rilevazione chemiluminescenza (ECL). Normalizzare i livelli di espressione di proteine utilizzando GAPDH (1: 2.000 in TBS-T con in 10% senza grassi latte in polvere) di serie.
- Nelle Western blots studiare l'espressione di almeno due diversi marcatori di autofagia come Beclin-1 e LC3B (di solito a 1: 1000 diluizione in TBS-T con 2,5% BSA). Non dimenticate di guardare per un controllo di espressione della proteina come GAPDH o actina.
- Valutare l'espressione della proteina di interesse mediante densitometria utilizzando uno scanner Blot digitale o software per computer, come pubblico dominio NIH immagine o ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).
3. Esperimenti di elettrofisiologia con le cellule HEI-OC1
- celle harvesting
Nota: usare le cellule in crescita in 100 mm di diametro piatti della cultura al 50% -80% di confluenza. Tripsina, Accutase, soluzione priva di enzimi, o p hosphate- b uffered s Aline + e thylene d iamine t Etra un acido CETIC (PBS-EDTA) può essere utilizzato per il sollevamento delle cellule senza effetti significativi sul numero e la qualità dei gigaseals . In alcuni casi, tuttavia, il trattamento tripsina rende le cellule più fragili. In questi casi, permettono alle cellule di recuperare per circa 30 minuti prima di iniziare gli esperimenti.- Lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS senza Ca 2+ e Mg 2+.
- Aggiungere 2 ml di una soluzione distaccatore privo di enzima, come soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica, e incubare i piatti per 3 min a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Utilizzare un microscopio invertito per controllare il distacco delle cellule. Se necessario, spostare il cell la cultura piatto per staccare più celle, ma farlo con delicatezza.
Nota: Non agitare il piatto. - Aggiungere 10 ml di DMEM + 10% FBS e pipetta le cellule delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta da 10 ml.
- Guarda le cellule al microscopio. Se> 80% delle cellule sono già separata (single), non sono necessarie ulteriori pipettaggio. Se le cellule sono ancora in cluster, ripetere la pipettando gentilmente fino a più di 80% di cellule sono singole.
- Posizionare i ~ 10 ml di cellule sospese in un tubo da 15 ml, centrifugare per 2 min a 100 xg, e scartare il surnatante.
- Utilizzare ~ 200 ml di soluzione di registrazione esterno (media L-15 di Leibovitz regolato a 305-310 mOsm con acqua distillata) per risospendere le cellule. Un controllo ottico delle celle dovrebbe mostrare molti, singole cellule rotonde con bordi lisci membrana.
- Patch-clamp e Misure NLC
- Eseguire patch-clamp e le misure di voltaggio-dipendenti non lineare capacità (NLC) utilizzando unamplificatori dequate e software, così come le tecniche elettrofisiologiche standard. Come uso soluzione interna (intrapipette) 150 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0.1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na, e 10 mm HEPES; aggiustare il pH a 7,2 con Tris.
- Sotto il microscopio, selezionare una singola, cellula sana, con tondo e bordi lisci membrana. Fissare la punta della pipetta di vetro alla superficie delle cellule e verificare la resistenza della membrana. Questo dovrebbe essere di circa 3-6 megaohm, corrispondente ad un diametro interno (ID) della punta della pipetta di ~ 2 micron.
- Premere delicatamente la punta micropipetta contro la membrana plasmatica delle cellule e quindi applicare il vuoto. Una porzione della membrana cellulare sarà aspirata nella pipetta, generando una resistenza elettrica dell'ordine di 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
- Stabilire la condizione di tutta la cellula interrompendo la membrana plasmatica con impulsi di aspirazione.
- Utilizzare cellule che non esprimono prestin, come HEK-293, come controllo 9.
Nota: le risposte attuali devono essere filtrati a 5 kHz, e le correzioni fatte per gli effetti della resistenza serie residua. Tutto raccolta dei dati e la maggior parte delle analisi possono essere eseguite utilizzando il software di solito in dotazione con gli amplificatori lock-in. Funzione di capacità può essere montata la derivata prima di una funzione di Boltzmann due stati relativa carica non lineare alla tensione della membrana 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In un paio di pubblicazioni recenti abbiamo riportato una serie completa di studi volti a valutare la risposta delle cellule HEI-OC1 a diversi farmaci farmacologici comunemente usati, nonché indagare la funzione prestin 8,9. In questi studi abbiamo fatto uso di tutti i protocolli descritti nelle sezioni precedenti.
Uno dei risultati di questi studi precedenti era che le cellule HEI-OC1 coltivate in condizioni non permissive (39 ° C / 10% di CO 2 = NP-HEI-OC1) ha mostrato una altamente significativa diminuzione della vitalità cellulare, e un aumento altrettanto significativo nella morte cellulare, rispetto a cellule coltivate in condizioni permissive (33 ° C / 10% di CO 2 = P-HEI-OC1) (Figura 1). Pertanto, qualsiasi studio effettuato citotossicità sulle cellule NP-HEI-OC1 dovrebbe dedicare notevoli sforzi in effetti discriminanti della droga dagli effetti di condizioni di coltura. in SUPPLEMEn, dal momento che gli effetti della droga su cellule già morte o con una ridotta redditività potrebbe essere diverso che gli effetti dello stesso farmaco sulle cellule sane, si consiglia di utilizzare le cellule P-HEI-OC1 per esperimenti che non specificamente richiedono cellule differenziate.
I nostri studi sugli effetti di diversi farmaci farmacologici anche prodotto risultati interessanti. Ad esempio, cisplatino, un agente chemioterapico frequentemente usato per il trattamento di diversi tumori umani, e acetaminofene (APAP = N- un cetyl- pa ra-ammino p henol), il più venduto antidolorifico over-the-counter negli USA, erano entrambi tossici per le cellule HEI-OC1 (Figura 2). Tuttavia, mentre APAP diminuita vitalità delle cellule e aumenta caspasi 3/7 di attivazione, lo ha fatto non induce la morte delle cellule. Cisplatino, invece, ha aumentato significativamente le tre risposte (Figura 2). È interessante notare che, caspasi 3/7 erano Mostly attivato a concentrazioni cisplatino più basse, il che suggerisce che la morte cellulare indotta da basse dosi di cisplatino era probabilmente mediato da apoptosi, mentre alte dosi letali effetti potrebbero essere associati a oncosis / necroptosi. Mentre oncosis è stato definito come un percorso pre-letale che porta alla morte cellulare sregolata accompagnato da cellulare e organelli gonfiore, blebbing, e aumento della permeabilità della membrana 17,18, necroptosi è un meccanismo di morte cellulare non apoptotica regolamentato attivati dagli stessi stimoli che avviano apoptosi ma con caratteristiche morfologiche simili a quelle di oncosis 19-22.
Ulteriori studi volti ad indagare gli effetti della APAP e cisplatino in cellule P-HEI-OC1 hanno mostrato un chiaro effetto dose-dipendente di APAP sulla proliferazione delle cellule che potrebbe spiegare la diminuzione intrigante nella vitalità cellulare senza morte cellulare descritto nel paragrafo precedente (Figura 3A). als cisplatino o diminuzione della proliferazione cellulare, e il suo effetto aumentato con il tempo di esposizione anche per piccole dosi (Figura 3A), ma in aggiunta diminuito senescenza a tutte le concentrazioni e punti temporali inclusi nel nostro studio (Figura 3B). La diminuzione significativa nella senescenza cellulare indotta da cisplatino potrebbe essere spiegato con l'aumento della morte cellulare, supponendo che le cellule senescenti sarebbero, probabilmente, inclini a morire più velocemente rispetto alle cellule sane 23.
È importante sottolineare che questi risultati rappresentativi suggeriscono che le cellule HEI-OC1 rispondono ai diversi farmaci farmacologici con una dose distintivo e sensibilità dipendente dal tempo per almeno uno dei meccanismi in esame. Pertanto, una corretta interpretazione di qualsiasi risultato sperimentale richiederà una chiara comprensione dei particolari processi cellulari esaminati e le informazioni fornite da ciascuna delle tecniche utilizzate per la loro valutazione.
jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> confocale e citometria a flusso esperimenti, d'altra parte, ha confermato l'espressione prestin nelle cellule P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1, con prestin immunolocalizing principalmente al citoplasma delle cellule P-HEI-OC1 (Figura 4A, frecce), e più concentrata a livello della membrana plasmatica delle cellule NP-HEI-OC1 (Figura 4B, frecce). citometria a flusso studi hanno mostrato un chiaro aumento nell'espressione prestin in NP-HEI -OC1 cellule rispetto alle cellule P-HEI-OC1 (figure 4C e 4D). L'aumento del tempo-dipendente espressione e la membrana plasmatica localizzazione delle prestin nelle cellule NP-HEI-OC1 suggerisce che traslocazione è stato accompagnato da sintesi di più molecole Prestin. Tuttavia, questi esperimenti non hanno fornito indizi per decidere se le molecole Prestin originariamente situati nel passaggio citoplasma alla membrana plasmatica e nuove molecole sostituirli, se rimangono al citoplasma e solo il nuovo synthesized Prestin si sposta la membrana plasmatica, o una combinazione di entrambi i processi.Studi elettrofisiologici hanno mostrato un robusto NLC in cellule P-HEI-OC1 (Figura 5B), con un valore di picco che diminuita e una tensione al picco capacità che spostato verso valori depolarizzata, quando le cellule sono state spostate condizioni non permissive per 1 e 2 settimane (figure 5c e 5d). A causa del progressivo traslocazione di prestin dal citoplasma alla membrana plasmatica, che originariamente ipotizzato che NLC sarebbe più alto in NP-HEI-OC1 che in cellule P-HEI-OC1, e che sarebbe ulteriormente aumentare con il tempo di incubazione a NP condizioni. Sorprendentemente, i risultati dei nostri studi hanno mostrato esattamente la risposta opposta. Abbiamo ipotizzato che l'aumento della densità delle molecole Prestin nella membrana plasmatica potrebbe essere limitare la loro funzione di motore.
hin-page = "1"> nota in figura 5 la depolarizzazione della tensione di picco di capacità in cellule HEI-OC1 rispetto ai valori tipici riportati in OHC e in cellule HEK293 trasfettate 24; inoltre osservare che lo spostamento depolarizzante aumenta nel tempo a condizioni NP. Lo spostamento depolarizzante progressiva è simile a quello descritto in OHC durante topo e nel ratto sviluppo 25,26, ed era stato suggerito che potrebbe essere correlato allo sviluppo di altre strutture cellulari associati con la membrana plasmatica della OHC 25, o un processo di maturazione intrinseca a Prestin 24.
Ci auguriamo che questa breve riconteggio dei pochi studi con cellule HEI-OC1 forniscono prove sufficienti della potenziale utilità delle cellule HEI-OC1 per indagare un ampio spettro di cellule e le risposte molecolari.
annuncio / 54425 / 54425fig1.jpg "/>
Figura 1: vitalità cellulare e morte cellulare in P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 Cells. (A) La vitalità cellulare valutata con il saggio MTT. Assorbanza è stata misurata con un lettore di piastre, e OD media in cellule di controllo è stato preso come il 100% della vitalità. Morte (B) Cell valutata con un test di citotossicità. Il numero di cellule positive (morte) è stata determinata mediante citometria di flusso con 488 nm di eccitazione (laser blu) e FL1: 530 15 nm. Nota altamente significativa (P ≤0.001) decremento vitalità cellulare (A) e l'aumento della morte cellulare (B) indotta da condizioni non permissive. Barre rappresentano l'errore standard dei mezzi (SEM). Modificato da riferimento 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
"Figura 2" src = "/ files / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg" />
Figura 2:. Risposte delle cellule HEI-OC1 esposti a APAP e cisplatino se analizzato da MTT, caspasi 3/7 e citotossicità saggi (A) La vitalità cellulare valutata con il test MTT, e assorbanza misurata con un lettore di piastre. (B) L'attivazione delle caspasi boia 3/7. (C) Droga - indotta morte cellulare valutata con un test di citotossicità; il numero di cellule (morti) positivi è stata determinata mediante citometria di flusso. I dati in ogni esperimento è stato normalizzato alle rispettive condizioni di controllo (controllo = 1) per rendere possibile l'analisi statistica simultanea. * = P ≤0.05 rispetto al controllo. Barre rappresentano l'errore standard dei mezzi (SEM). Modificato fromreference 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti di APAP e Cisplatino su HEI-OC1 Cells mitotico Tasso e senescenza. (A) Modifiche indotte da farmaci sul tasso di divisione mitotica di cellule HEI-OC1, a 24 e 48 ore, è stata valutata con un test BrdU. (B) indotta da farmaci senescenza nelle cellule HEI-OC1 è stata misurata mediante citometria di flusso e la senescence- associato β-galattosidasi (SA-Bgal) tecnica. I dati in ogni esperimento è stato normalizzato alle rispettive condizioni di controllo (controllo = 1) per rendere possibile l'analisi statistica simultanea. * = P ≤0.05 rispetto al controllo. Barre rappresentano l'errore standard dei mezzi (SEM). Fromreference modificato 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di tla sua figura.
Figura 4:. Prestin espressione in P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 celle - Le cellule sono state marcate con anti-Prestin anticorpi e osservato da microscopia confocale e citometria a flusso (A) nelle cellule P-HEI-OC1 Prestin immunolocalizzate per lo più a il citoplasma (frecce). (B) In cellule NP-HEI-OC1, al contrario, la reattività prestin è concentrata a livello della membrana plasmatica (frecce). (C e D) citometria a flusso studi in cellule HEI-OC1 in coltura per 2 settimane a condizioni NP (D) ha mostrato un chiaro aumento prestin espressione rispetto alle cellule P-HEI-OC1 (C). (C) Inset è secondario ab solo (controllo negativo). Modificato da riferimento 9.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: studi NLC in cellule P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 (A) Patch-cell bloccato HEI-OC1.. (B - D) NLC in P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 cellule. Notare la diminuzione nel picco della NLC e il progressivo spostamento delle curve di valori nelle celle NP-HEI-OC1 più depolarizzata. Modificato da riferimento 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo rapporto viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1 e li usiamo per valutare i meccanismi di citotossicità indotta da farmaci e di indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del cocleare OHC. Le modalità tecniche, tuttavia, sono abbastanza generali da essere facilmente adattato ai diversi studi.
Tutti i protocolli descritti richiedono il corretto uso di tecniche di coltura cellulare consolidate 10. Come con qualsiasi altra linea cellulare, lavorando con cellule HEI-OC1 richiede un impianto di coltura cellulare adeguatamente equipaggiato, con un armadietto certificata biologica sicurezza, una centrifuga refrigerata, un bagno di acqua, e uno microscopio invertito per l'esame di colture cellulari e per le celle di conteggio se si utilizza tecniche hemocytometric. Un requisito unico, tuttavia, è la disponibilità di due incubatori umidificate, un set a 33 ° C / 10% di CO 2 per cellule P-HEI-OC1 ed altro a 39 ° C / 5% di CO 2 per la cella NP-HEI-OC1S. Se gli studi previsti coinvolgono solo le cellule P-HEI-OC1, il secondo incubatrice può essere impostata a 37 ° C / 5% di CO 2 per saggi differenti.
L'uso di piatti di plastica di coltura cellulare è un importante requisito aggiuntivo per lavorare con le cellule HEI-OC1. Infatti, le cellule HEI-OC1 sono molto robuste e lo faranno crescita superfici diverse e in condizioni molto diverse. Tuttavia, la loro fenotipo e la loro risposta ai farmaci e altri stimoli saranno fortemente dipenderà dai parametri di coltura (G Kalinec & F Kalinec, inedito). Come abbiamo sostenuto in un precedente documento 8, questa plasticità delle cellule HEI-OC1 può essere vantaggiosamente utilizzato per progettare nuovi esperimenti. Ad esempio, è ben noto che la tensione di ossigeno nel perilymph cocleare è molto più bassa (~ 2 kPa) che in un incubatore tipica a livello del mare (~ 21,3 kPa) 27. Incubando le cellule HEI-OC1 in basso O 2 concentrazioni cambieranno le loro risposte, forse che li rende un modello migliore per l'auditcellule sensoriali ORY.
Va sottolineato che i protocolli descritti per la cultura e subcultura di cellule HEI-OC1 possono essere utilizzati anche con altre linee cellulari uditive sviluppate nel nostro laboratorio dallo stesso animale transgenico, come OC-k3 da organo di Corti 11,12 e SV -K1 da stria vascularis 13,14. Inoltre, queste linee cellulari potrebbero essere utili come il controllo per le cellule HEI-OC1 negli esperimenti selezionati. Ad esempio, recentemente abbiamo usato cellule SV-K1 per dimostrare che la immunoreattività inversamente proporzionale alla Prestin e anticorpi Na + K + ATPasi sulla membrana plasmatica delle cellule HEI-OC1 era cellule a seconda del tipo di risposta piuttosto che associata al topo transgenico dalla che queste cellule sono state derivate 9.
Altro requisito fondamentale per lavorare con le cellule HEI-OC1 è la pratica di adeguate tecniche asettiche come la pulizia di tutte le superfici di lavoro all'interno della cappa di sicurezza con il 70% ethanol o isopropanolo e la decontaminazione dei materiali necessari per le procedure. Tuttavia, mentre le altre linee cellulari di mammiferi sono spesso protetti dalla contaminazione batterica accidentale utilizzando la penicillina-streptomicina o altre combinazioni simili, gli antibiotici non devono mai essere utilizzati con le cellule HEI-OC1 tranne se lo scopo dello studio è quello di indagare i loro effetti. cellule HEI-OC1 sono stati generati in condizioni di assenza di antibiotici, e devono essere evitati per ridurre la comparsa di cellule resistenti agli antibiotici.
Infine, vogliamo ribadire un punto già accennato più volte in questa relazione: il fenotipo e la risposta delle cellule HEI-OC1 ai farmaci e altri stimoli saranno fortemente dipenderà dai parametri di cultura. Pertanto, è molto importante che i laboratori che lavorano con cellule HEI-OC1 utilizzano protocolli simili e condizioni di coltura cellulare al fine di rendere i loro risultati veramente comparabili con quelli forniti da altri gruppi. Inoltre, èmolto importante ricordare che la linea cellulare HEI-OC1 è solo un modello, con tutti i limiti che un modello ha. In attesa che gli esperimenti in vitro con cellule HEI-OC1 fornirà i dati che rappresentano con precisione le risposte in vivo di veri cellule sensoriali uditive non è realistico. Tuttavia, crediamo fortemente la linea cellulare HEI-OC1 è un modello utile per studiare le risposte funzionali delle cellule sensoriali uditive e la proiezione del potenziale ototossicità dei farmaci farmacologici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 mm x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 ml | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I.
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).
