Introduction
코르티 1의 하우스 귀 연구소 - 오르간은 (HEI-OC1) 세포를 형질 전환 마우스 1, 2의 청각 기관에서 파생됩니다. 33 ° C / 10 % CO 2 (허용 조건)에서이 형질 전환 마우스에서 어떤 세포의 배양은 역 분화 가속 확산을 트리거하는 불멸화 유전자의 발현을 유도; 39 ° C / 5 % CO 2 이상의 HEI-OC1, 세포사 2,3의 경우에, 증식, 분화를 감소하고 (비 허가 조건) 리드 세포 이동.
HEI-OC1 세포를 복제하고, 10 년 전을 통해 우리의 실험실에있어서, 초기 연구는 특정 같은 prestin, 마이 오신 7A, Atoh1, BDNF, calbindin 및 칼 모듈 린 등의 인공 와우 유모 세포의 마커뿐만 아니라, 지원의 마커를 표현하는 지적했다 넥신 (26) 및 섬유 모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 등이 세포. 따라서, 평 OC1이 commo을 나타낼 수 있음을 시사되었다코르티 2의 기관의 감각과지지 세포 n 개의 전구. 페니실린과 같은 비 ototoxic 간주 약물, 2,3하지 않았다 동안 병렬 연구는 이러한 세포에서 카스파 제 -3 활성화 유도 시스플라틴 (cisplatin), 겐타 마이신과 스트렙토 마이신과 같은 ototoxic 약물을 원형 강력한 증거를 제공했다. 따라서,이 세포주는이 독성과 가능성이 독성하거나 새로운 pharmacological 약물 otoprotective 특성 선별 과정에도 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 시험 관내 시스템이 제안되었다. HEI-OC1 세포는 지난 10 년에 출판 이상의 백오십 연구에 사용 된 것으로 추정된다.
다른 약물의 잠재적 프로 - 세포 사멸 효과를보고하는 것은,이 세포주를 포함하는 대부분의 연구의 중요한 목표 이었지만, 자식 작용 및 노화와 같은 다른 중요한 세포 공정은 단지 HEI-OC1 세포 4-7 조사하기 시작했다. 나는NA는 우리의 실험실 (8)의 최근 연구는, 우리는 자주 병원에서 사용되는 다른 약물 약물에 의해 유도 된 세포 죽음, 생존, 증식, 노화와 자식 작용에 대한 데이터의 포괄적 인 세트를 수집하는 HEI-OC1 세포를 사용했다. 또한 동일한 처리를 수신하는 HEK-293 (인간 배아 신장 세포)와 헬라에서 해당 (인간 상피 세포)와 HEI-OC1 세포의 응답의 일부를 비교 하였다. 우리의 결과는 HEI-OC1 세포 연구중인 메커니즘 중 적어도 하나에 특유의 투여 량 및 시간 의존적 감도 특징적인 방식으로 각각의 약물에 반응 것으로 나타났다. 또한 실험 결과의 정확한 해석은 하나 이상의 기술 8과 평행 연구를 수행 할 필요하다고 그 연구에서 강조 하였다.
다른 연구에서는 prestin의 기능적 응답하여, 인공 모발 외부 셀 모터 단백질 (OHCs) 9를 평가 HEI-OC1 세포의 사용을 검토 + K + ATPase의 감소와 상관 관계가 NP-HEI-OC1 세포의 세포막에 prestin 지역화 증가. 또, P-HEI-OC1 세포는 강력한 NLC는 세포막에 존재 prestin 분자의 밀도가 증가 할 때 감소 된 운동 기능을 prestin하는 관련 있다고 설명했다. 요컨대, 이러한 결과는 강하게 HEI-OC의 유용성을 지원1 세포는 청각 단백질을 조사합니다.
이 비디오 기사에서 우리는 어떻게 약물 유발 세포 독성 및 방법의 메커니즘 / S를 평가하는 방법은 세포 독성 연구에 대한 (P-HEI-OC1) 허용 조건에서 성장 세포를 사용하는 것이 편리하다 왜 문화 HEI-OC1 세포에 설명 전기 생리 연구를 수행하기 위해 (예를 들어, 패치 클램프, 비선형 커패시턴스 (NLC))는 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사한다.
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Protocol
1. 세포 배양
주 : 모든 세포 배양 프로토콜 적절한 세포 배양 기술을 이용하여 수행되어야한다 (: 실험실 편람, 볼륨 I 10 참조 용으로 세포 생물학의 제 3 장을 참조). HEI-OC1 세포는 적절한 부착 및 성장에 대한 세포 배양 접시의 추가 코팅 또는 치료를 필요로하지 않는다. 아주 중요한 : 세포 배양을 위해 유리 접시를 사용하지 않는; 표현형 및 약리학 적 약물로 세포의 생물학적 반응은 (게시되지 않은 G Kalinec & F Kalinec)을 변경한다; 기존의 플라스틱 세포 배양 요리 (재료 / 장비의 표 참조)을 권장합니다. 오염을 방지하기 위해 무균 기술에 특별한주의를 지불하지만, HEI-OC1 세포와 항생제 (예를 들어, 암피실린 또는 스트렙토 마이신)를 사용하지 않습니다. 필요한 경우 인 HeLa 및 HEK-293 세포 HEI OC1-8, 다른 세포주 수와 이전 시험에서 대조군으로 사용되었지만, 암포 테리 신 B를 사용이 목적을 위해 허용합니다.
- 냉동 HEI-OC1 세포의 소생
참고 맥리는 13,14 vascularis에서이 프로토콜은, 동일한 유전자 도입 11,12 코르티 기관에서의 이러한 OC-K3, 우리 실험실에서 개발 된 마우스 및 SV-K1에서 다른 세포주와 함께 사용될 수있다.- 액체 N 2에서 냉동 보관 HEI-OC1 세포의 병을 제거하고 37 ℃의 물을 욕조에 넣습니다. 바이알의 하반부 잠수함과 얼음의 소량 만이 병에 남아 때까지 해동 할 수있다. 70 % 알코올로 유리 병의 외부를 닦습니다.
- (둘 베코 변형 이글 배지와 같은 예열 성장 배지 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 천천히 전체 부피 (~ 1.5 × 105 세포 / ㎖)을 적가 방식으로, 바이알로부터 세포를 피펫 및 배달 DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충.
- t를 버리고, 5 분간 300-500 XG에서 튜브를 원심 분리하여 DMSO를 제거그 상층 액을 다시 현탁 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS)의 9 ml의 세포. 매질과 반대로, 튜브의 바닥을 터치 피펫의 팁 서너 번 피펫에서 부유 세포의 광속 환류 덩어리 또는 세포를 해리하는 시트.
- 100mm 직경의 비 처리 플라스틱 세포 배양 접시에서 배양 배지에 현탁하고 세포의 총 부피를 놓는다.
- 10 % CO 2 (허용 조건)와 33 ° C에서 세포를 품어.
- HEI-OC1 세포의 계대
주 : 합류하기 전 (~ 80 %) 세포가 죽어 배양을 방지하기 위해 정지하고 계대 배양하게한다. 이 프로토콜은 또한 맥리에서 13, 14을 vascularis, 코르티 11, 12, 및 SV-K1의 기관에서 이러한 OC-K3와 같은 형질 전환 마우스에서 우리 실험실에서 개발 된 다른 세포주, 사용할 수 있습니다.- PBS 2 ㎖로 세포를 오래된 매체를 제거하고 씻는다. </ 리>
- 표면적이 25cm 당 1 mL로하여, 0.25 % 트립신 용액으로 세포 단층을 커버. 세포의 40 % 이상이 분리되어야 다음 단계로 이동한다. 필요한 경우, 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 검사하고, "때리고 또는 탭"나머지 부착 세포를 분리 부드럽게 문화 요리를.
참고 : 세포 사망에이를 수 있습니다 오랜 기간 동안 트립신으로주의; 충분한 및 전송 된 셀 것 계획된 연구 부족.하지 - 1.1.3에 설명 된 절차에 따라, 세포를 재현 탁하고, 15 ml의 원추형 튜브에 옮긴다.
- 300-500 XG에서 5 분 동안 원심 분리, 배지를 버리고 새로운 성장 배지로 세포를 수집하고, 적어도 네 개의 100mm 직경의 세포 배양 접시 그들을 시드. 접시 당 셀의 수는 회수 된 세포의 양에 의존 할 것이다. 10 % CO 2 (P-HEI-OC1)와 33 ° C에서 세포를 품어을 위해 필요한 다시 여러 번 분할계획된 실험이나 새로운 주식을 생성.
- 재고 준비를 들어, 250-550 ml의 세포 배양 플라스크으로 100mm 직경의 요리를 교체; 실험을 위해, 작은 접시 또는 멀티 웰 플레이트보다 적합 할 수있다.
- 그들이 도달 할 때까지 차별화를 들어, ~ 허용 조건에서 80 %의 합류를 HEI-OC1 세포를 배양; 다음 2 ~ 3 주 동안 5 % CO 2 (NP-HEI-OC1)를 39 ° C로 요리를 이동합니다.
참고 : 세포가 점진적으로 확산 죽어 중지됩니다. 죽은 세포를 제거하기 위해 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 세포가 실험에 사용할 수 없습니다 일반적으로 4 ~ 주 후, 세포의 원래의 수에 따라. 세포가 NP 조건에서 배치로 분화 빨리 시작되지만 모든 셀은 동일한 속도로 분화. 중요한 것은 정성을 제공, (그림 4를 대표 결과를 참조) 분화 과정에서 발현 및 막 지역화 증가 prestin분화의 정도를 정량적으로 표시.
2. 약물 세포 독성 연구
참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 (그림 1을 대표 결과를 참조)을 권장합니다.
- 세포 생존율 (MTT 분석)
- 1.2에 기술 된 절차에 따라 P-HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다.
- 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
- 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 제조 업체의 프로토콜 다음 MTT 분석을 수행합니다. 대개이 분석을위한 프로토콜은 다음과 같은 단계를 가지고 :
- 각 웰에 MTT 시약의 10 μl를 추가합니다.
- 보라색 염료가 보일 때까지 2 ~ 4 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 다음 각 웰에 MTT 세제 시약 100 μl를 추가합니다. 판을 흔들지 마십시오.
- 접시를 덮고 37 ℃에서 2 시간 4의 어둠 속에서 그것을 둡니다.
- 블랭크 (단독 성장 배지)을 포함하여, 각 웰에 570 nm에서 흡광도를 측정하기위한 마이크로 플레이트 리더를 사용. 생존율 100 %의 대조군 세포의 평균 OD를 사용하여 데이터를 정규화한다.
- 카스파 3/7 활성화 분석
참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다.- 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다.
- WH에 세포를 시드(100 μL 아니라 당) 96 웰 플레이트를 ITE 벽으로, 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
- 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 각 제조 업체의 프로토콜 다음 카스파 분석을 수행합니다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고
- , 시약을 준비들을 잘 혼합하고 실온에 평형 수 있습니다.
- 배양기에서 세포를 제거하고, 플레이트를 실온으로 평형을 허용한다.
- 같은 피펫 팁 다른 샘플을 포함 우물을 터치하지 않음으로써 교차 오염되지 않도록주의하면서 각 웰에 시약의 표시 금액을 추가합니다.
- 접시를 덮고 300 ~ 500 rpm으로 접시 통을 사용하여 30 초 동안 혼합한다.
- 적어도 30 분 동안 실온에서 플레이트를 인큐베이션. Determin경험적으로 최적의 잠복기를 전자. 실내 온도가 온도 변동이 발광 판독에 영향을 미칠 것이기 때문에, 항온 배양기를 사용하여 변동하는 경우.
- 물론 각각의 발광을 측정하고 카스파 제 활성화의 100 %로 대조군 세포의 평균 발광을 사용하여 값을 정상화.
- 세포 분열 (증식)
- 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다.
- 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 허용 조건에서 하룻밤 배양 한 다음 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
- 처리 1 시간 후에는, 각각의 웰에 제조 100X BrdU의 1 μL를 추가 (5- 브로 모 -2'- deoxyuri) 솔루션을 식사, 33 ° C에서 인큐베이터에 번호판을 반환합니다.
- 12, 24, 48 시간 후, 해당 판에서 기존 매체를 제거하고 PBS 잘 한 번 각을 씻는다.
- 제조사의 프로토콜에 따르는 세포 증식 분석을 수행한다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고
- / 정착 포함 제조자의 프로토콜에 표시된 변성 용액을 세척 완충액, 일차 항체 검출 용액 이차 항체 검출 용액 및 BrdU의 솔루션 시약을 준비한다.
- 제조자의 프로토콜에 명시된 양으로, 각 웰에 고정 / 변성 용액을 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 플레이트를 유지한다.
- 고정 / 변성 용액을 제거하고 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도 차 항체를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 유지한다.
- 기본 개미와 솔루션을 제거ibody, 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척 한 다음 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도에서 차 항체를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 이차 항체와 함께 플레이트를 유지한다.
- 보조 항체 솔루션을 제거 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 기판을 추가합니다. 실온에서 10 분간 배양 한 후, 정지 액을 합한다. 주의 : 색상의 변화를 제어; 용액이 매우 어두운지면, 10 분의 표준 현상 시간 전에 반응을 정지.
- 정지 솔루션을 추가 30 분 이내에 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
- 세포 독성
참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다.- 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어.
- 치료 끝에PBS로 세포를 세 번 세척하고, 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25cm 당 1 ml의 분리를 사용.
- 분리 후, 수집하고 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠릿, 상층 액을 제거하고 세포 독성 분석에 포함 된 시약으로 어둠 속에서 15 분 동안 세포를 염색.
- 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 라이브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다.
- 노화
- 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어.
- 신뢰할 수있는 결과를 제공하는 것으로 알려져 Debacq-Chainiaux 외. (15) 또는 다른 방법에 의해 기재된 프로토콜 유세포하여 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 양성 세포의 수를 결정한다. 유동 세포 계수를위한 간단한 프로토콜은 다음이다 :
- <리> 실험 치료 끝에, PBS로 세포를 세 번 세척하고 허가 조건에서 1 시간 동안 세포 배양 배지에 100 nM의 Bafilomycin A1 그들을 부화.
- ~ 33 μM의 최종 농도 C12FDG을 추가하고 1-2 시간 동안 세포를 배양 계속합니다.
- 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25 cm2로 당 한 용액을 사용하여 수확 PBS로 두 번 세포를 씻어, 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여이를 펠릿.
- 얼음 - 냉각 PBS로 세포를 재현 탁하고 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유세포 포지티브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다.
- HEI-OC1 셀 제어 결핍 1.2에 기재된 절차를 수행하여 (48 시간 동안 혈청을 박탈) 표준 프로토콜 다음 웨스턴 블롯 그들을 처리 모은다. 일반적으로 웨스턴 블롯을위한 프로토콜은 다음과 같은 일이분기 EPS :
- 1.0 × 105 세포 / ml의 농도로 6 웰 플레이트에 시드 HEI-OC1 세포. 24 및 / 또는 48 시간 후, 빙냉 PBS로 세포를 세척 하였다.
- 를 Lyse와 TNESV 버퍼 (1 % NP40, 50 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 100 mM의 NaCl을, 2mM의 EDTA, 1 mM의 나 3 VO 4) 얼음에 5 분간 프로테아제 억제제 칵테일과 1 ㎜ PMSF 200 μL.
- (각 웰의 바닥을 긁어) 세포를 모으고 4 ℃에서 5 분 동안 16,800 XG에서 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮긴다.
- 상청액을 수집하고 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화.
- 단백질을 변성 5 분 동안 5 배 로딩 버퍼와 각 샘플에 1 mM의 DTT과 종기를 추가합니다.
- 4-12 %의 겔에서 SDS-PAGE를 사용하여 샘플을 실행하고 PVDF 막에 전송할 수 있습니다.
- 실온에서 60 분 동안 트윈 20 0.1 %와 TBS-T에서 5 % 무 지방 건조 우유와 세포막을 차단합니다.
- 주 개미와 4 ° C에서 하룻밤 멤브레인을 품어ibodies.
- 다음 날, TBS-T로 광범위하게 막을 세척하고, 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (1 : 1,500)에 접합 보조 IgG 항체와 함께 품어 1 시간 동안.
- 강화 된 화학 발광 (ECL) 감지 시스템과 면역 반응을 감지합니다. 표준 : (10 %의 무 지방 건조 우유, TBS-T에서 000 일) GAPDH를 사용하여 단백질의 발현 수준을 정상화.
- 웨스턴 블롯에서의 발현을 조사하는 적어도 그러한 Beclin-1과 같은 LC3B 자식 작용의 두 가지 지표 (통상적으로 1 : 2.5 %의 BSA와 TBS-T 1000 희석). GAPDH 또는 액틴 등의 단백질 발현의 제어를 찾을 것을 잊지 마십시오.
- 이러한 공개 도메인 NIH 이미지 또는 ImageJ에 (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)와 같은 디지털 오 스캐너 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 농도계 관심있는 단백질의 발현을 평가한다.
HEI-OC1 세포 3. 전기 생리학 실험
- 수확 세포
참고 : 사용 세포가 50 % -80 %의 포화 상태에서 100mm 직경 배양 접시에 성장합니다. 트립신, Accutase하는 cetic 산 (PBS-EDTA)를 ETRA thylene D iamine t uffered의 알린 + 전자 나 효소가없는 솔루션, 또는 P hosphate-는 gigaseals의 수와 질에 심각한 영향없이 세포를 해제 사용할 수있다 . 그러나 어떤 경우에는, 트립신 처리 세포가 더 약해한다. 이러한 경우에, 세포는 실험을 시작하기 전에 약 30 분 동안 회복 할 수있다.- 10 ml의 칼슘없이 PBS 2 + Mg를 2 +로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 5 % CO 2, 37 ℃에서 3 분 동안 요리를 같은 비 효소 세포 분리 솔루션으로 효소가없는 분리기 용액 2 ㎖를 추가하고 품어.
- 세포의 분리를 확인하기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 필요한 경우, 이동 CELL 배양 접시 더 세포를 분리하지만 가볍게 할.
참고 : 접시를 흔들지 마십시오. - DMEM + 10 % FBS 10 ML을 추가하고 부드럽게 및 10 ml의 피펫 다섯 번 아래로 세포를 피펫.
- 현미경으로 세포 봐. 셀> 80 %가 이미 (싱글)을 분리하는 경우, 더 피펫 팅이 필요하지 않습니다. 세포 클러스터 여전히 경우 80 % 이상의 세포가 하나가 될 때까지, 부드럽게 피펫 팅을 반복한다.
- 100 XG에 2 분, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 정지 세포의 ~ 10 ml에 배치하고 상층 액을 버린다.
- 세포를 재현 탁하기 - 외부 기록 솔루션 ~ 200 μl를 사용 (증류수로 310 mOsm 라이 보 비츠의 L-15 배지는 305로 조정). 셀의 광 제어 부드러운 막 가장자리 많은 단일 라운드 셀을 표시해야합니다.
- 패치 클램프 및 NLC 측정
- 패치 클램프와를 사용하여 전압 의존 비선형 용량의 측정 (NLC)을 수행dequate 증폭기 및 소프트웨어뿐만 아니라 표준 전기 생리 학적 방법. 내부 (intrapipette) 용액 사용 150 밀리미터의 KCl, 1 ㎜의 MgCl 2, 0.1 mM의 EGTA, 2 mM의 ATP-마그네슘으로서, 0.1 mM의 GTP-나트륨, 10 mM의 HEPES; 트리스와 7.2로 산도를 조정합니다.
- 현미경, 라운드 부드러운 막 가장자리 하나, 건강한 셀을 선택합니다. 세포 표면에 유리 피펫의 끝을 첨부하여 막 저항을 확인한다. 이는 1 ~ 2 ㎛, 피펫 팁의 내경 (ID)에 대응하는 약 3-6 수 MΩ이어야한다.
- 조심스럽게 세포의 세포막에 대한 마이크로 피펫 팁을 누른 다음 흡입을 적용합니다. 100 기가 옴 (기가 시일) - 세포막의 일부 (10)의 순서로 전기 저항을 발생 피펫으로 흡입한다.
- 흡입 펄스와 세포막을 파괴하여 전체 셀 조건을 확립한다.
- 제어 9로, 같은 HEK-293과 같은 prestin을 표현하지 않는 세포를 사용하여.
참고 : 현재 응답은 5 kHz에서 필터링해야하고, 수정 잔류 직렬 저항의 효과를했다. 모든 데이터 수집 및 분석은 가장 일반적으로 로크 증폭기가 포함 된 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 용량 함수는 막 전압 16 비선형 전하 관한 두 상태 볼츠만 함수의 1 차 도함수에 장착 될 수있다.
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Representative Results
최근 출판물의 몇에서 우리는 몇 가지 일반적으로 사용되는 약물 약물 HEI-OC1 세포의 반응을 평가뿐만 아니라 prestin 기능 8,9을 조사하기위한 연구의 포괄적 인 세트를보고했다. 이 연구에서 우리는 이전 섹션에 설명 된 모든 프로토콜을 사용했다.
이들 이전 연구의 결과들 중 하나는 HEI-OC1 세포가 비 - 허용 조건에서 배양하는 것이 있었다 (39 ° C / 10 % CO 2 = NP-HEI-OC1)가 세포 생존 능력에 매우 크게 감소하고 똑같이 현저한 증가를 보였다 세포 죽음, 허가 조건에서 배양 된 세포에 대해서 (33 ° C / 10 % CO 2 = P-HEI-OC1) (도 1). 따라서, 어떤 세포 독성 연구는 배양 조건의 영향에서 식별 약물 효과에 상당한 노력을 할애해야 NP-HEI-OC1 세포에서 수행. additio에서세포에 대한 약물의 효과는 이미 죽거나과 이후 N, 감소 된 생존이 건강한 세포에서 동일한 약물의 효과, 우리는 분화 된 세포를 특별히 필요하지 않은 실험을 위해 P-HEI-OC1 세포를 사용하는 것이 것이 다를 수있다.
다른 약물 약물의 효과에 대한 우리의 연구는 흥미로운 결과를 생산했다. 예를 들어, 시스플라틴, 화학 요법 제는 자주 여러 가지 인간의 악성 종양의 치료 및 아세트 아미노펜 (APAP = N- cetyl- 파 라 아미노 P는 henol)에 사용되는, 미국에서 가장 많이 판매 이상 - 더 - 카운터 진통제, (그림 2) HEI-OC1 세포에 대한 독성이 모두 있었다. APAP는 세포 생존을 감소 카스파 제를 활성화 3/7 증가하면서 그러나, 세포 사멸을 유도하지 않았다. 시스플라틴은 반대로 크게 세 가지 반응 (도 2) 증가 하였다. 흥미롭게도, 카스파 3/7은 mostl했다Y는 고용량 치명적인 효과를 oncosis / necroptosis과 연관 될 수있는 반면 시스플라틴의 낮은 복용량에 의해 유도하는 세포 사멸 아마, 세포 사멸에 의해 매개 된 제안, 낮은 시스플라틴의 농도에서 활성. oncosis는 세포 및 소기관 종창,에 blebbing 및 증가 된 세포막 투과 17,18 함께 비 조절 된 세포 사멸을 유도하는 프리 치명적인 경로로서 정의하였으나, necroptosis가 개시 동일한 자극에 의해 활성화 된 조절 된 비 - 아폽토시스 세포 사멸 메카니즘은 세포 사멸하지만 oncosis 19 ~ 22과 유사한 형태 학적 기능.
APAP 및 P-HEI-OC1 세포에 대한 시스플라틴 (cisplatin)의 영향을 조사 할 목적으로 추가적인 연구는 이전 단락에 설명 된 세포 죽음없이 세포 생존에 흥미 감소를 설명 할 수있는 세포 증식 APAP의 명확한 용량 의존적 효과를 나타냈다 (도 3A). 시스플라틴 루게릭 병 O 세포 증식을 감소하고, 그 결과 심지어 소량 (도 3A)에 대한 노출 시간에 따라 증대하지만, 추가로 연구 (도 3B)에 포함 된 모든 농도 및 시간 지점에서 노화를 감소시켰다. 시스플라틴에 의해 유도 된 세포 노화의 유의 한 감소가 노화 세포가 될 것이라고 가정하고, 세포 사멸의 증가에 의해 설명 될 수있다, 아마 경향은 건강한 세포 (23)보다 더 빨리 죽을 수 있습니다.
중요한 것은, 이러한 대표적인 결과 평 OC1 세포 연구중인 메커니즘 중 적어도 하나에 특유의 투여 량 및 시간 의존적 감도 다른 약리학 적 약물에 반응 제안. 따라서, 모든 실험 결과의 정확한 해석을 조사 특정 세포 과정을 명확하게 이해하고 평가하기 위해 사용되는 기술의 각각에 의해 제공되는 정보를 필요로한다.
"FO =-together.within 페이지를 유지"jove_content 1 "> 공 촛점과 다른 한편으로는, 실험 유동 세포 계측법은 prestin가에서 대부분 immunolocalizing으로, P-HEI-OC1 및 NP-HEI-OC1 세포에서 prestin 발현을 확인 P-HEI-OC1 세포 (도 4a의 화살표)의 세포질 및 NP-HEI-OC1 세포 (도 4b의 화살표)에서 원형질막 더 농축시켰다. 계측법 흐름 연구 NP-HEI에서 prestin 발현의 명확한 증가를 나타내었다 -OC1 세포가 P-HEI-OC1 세포 (도 4C와 4D)을 존중합니다. NP-HEI-OC1 세포에서 prestin의 발현 및 플라즈마 멤브레인 지역화의 시간에 따른 증가는 전위가 더 prestin 분자의 합성을 수반되었음을 시사한다. 그러나,이 실험들은 단지 새롭게 신디 세포질에 남아있는 경우 원래 세포막 새로운 분자 세포질 이동 위치한 prestin 분자가 교체 여부를 결정하는 데 단서를 제공하지 않았다세포막 또는 두 프로세스의 조합 esized prestin 이동한다.전기 생리학 연구 세포가 1 비 허용 상태로 이동 한 감소 피크 값보다 탈 분극 값으로 시프트 최대 용량의 전압과 P-HEI-OC1 세포에서 강력한 NLC (도 5B)을 보였다 이주 (도 5C 및 5D). 때문에 세포막을 세포질에서 prestin 진보 전좌, 우리는 원래 NLC는 P-HEI-OC1 세포보다 NP-HEI-OC1 높은 것이라고하고 더 NP에서 배양 시간에 따라 증가한다고 가정 정황. 놀랍게도, 우리의 연구 결과는 정반대 반응을 보였다. 우리는 세포막에 prestin 분자의 밀도의 증가가 자신의 운동 기능을 제한 할 수 있음을 추측했다.
힌 페이지 = "1">도 5 OHCs 및 형질 HEK293 세포 (24)에보고 된 통상적 인 값에 대하여 HEI-OC1 세포에서 최대 용량에서 전압의 탈분극 참고; 또한, 탈분극 시프트 NP 조건에서 시간에 따라 증가하는 것이 관찰한다. 누진 탈분극 시프트 마우스 및 래트 개발 25,26 동안 OHCs에 기재된 것과 유사하며, 이는 그것이 OHC의 세포막 25 또는 극한 성숙 과정과 관련된 다른 셀룰러 구조의 발달과 관련이있을 수 있다고 제안했다 24 prestin합니다.
우리는 HEI-OC1 세포와 몇 가지 연구의이 짧은 재검 세포 및 분자 응답의 넓은 스펙트럼을 조사하는 HEI-OC1 세포의 잠재적 유용성의 충분한 증거를 제공 바랍니다.
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그림 1 : P-HEI-OC1 및 NP-HEI-OC1 세포의 세포 생존 및 세포 죽음. (A) 세포 생존율은 MTT 분석법으로 평가 하였다. 흡광도를 플레이트 판독기로 측정하고, 대조군 세포의 평균 OD가 생존을 100 %로 하였다. 세포 독성 분석과 평가 (B) 세포 죽음. 530 15 나노 : 양 (죽은) 세포의 수는 세포 계측법 488 nm의 여기 (블루 레이저) 및 FL1과 흐름에 의해 결정되었다. 비 허가 조건에 의해 유도되는 세포 사멸 (B)에서 고도로 유의 (P ≤0.001) 세포 생존율의 감소 (A) 및 증가합니다. 바 수단 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 참조 8에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 :. MTT, 카스파 3/7 및 세포 독성 분석 실험에 의해 분석 할 때 APAP 및 시스플라틴에 노출 HEI-OC1 세포의 응답 MTT 분석과 평가 (A) 세포 생존 능력, 흡광도는 플레이트 리더로 측정. 사형 집행의 카스파 3/7의 (B) 활성화. (C) 약물 - 세포 독성 분석과 평가에 의한 세포 사멸; 양극 (죽은) 세포의 수는 유동 세포 계측법으로 측정 하였다. 모든 실험 데이터는 가능한 동시 통계 분석을 위해 각각의 제어 조건 (제어 = 1)로 정규화 하였다. * = 제어 P ≤0.05 대해. 바 수단 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. fromreference 8 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : HEI-OC1 세포 '유사 분열 속도와 노화에 APAP와 시스플라틴의 효과. (A) 24 및 48 시간에서 HEI-OC1 세포의 유사 분열 분열 속도의 약물 유발 변화는하는 BrdU의 분석으로 평가 하였다. HEI-OC1 세포 (B) 약물 - 유도 노화를 유세포 및 senescence-으로 측정했다 관련 β - 갈 락토시다 제 (SA-Bgal) 기술. 모든 실험 데이터는 가능한 동시 통계 분석을 위해 각각의 제어 조건 (제어 = 1)로 정규화 하였다. * = 제어 P ≤0.05 대해. 바 수단 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 수정 fromreference 8. t의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그의 그림.
그림 4 :. P-HEI-OC1 및 NP-HEI-OC1 세포의 Prestin의 표현 - 세포 안티 Prestin 항체로 표기하고 공 촛점 현미경 및 유동 세포 계측법에 의해 관찰되었다 (A) P-HEI-OC1 세포에서는에 대부분 immunolocalized prestin 세포질 (화살표). NP-HEI-OC1 셀 (B)은, 대조적으로, prestin 반응성 플라즈마 막 (화살표)로 농축시켰다. (C 및 D) NP 상태 (D)에서 2 주 동안 배양 HEI-OC1 세포 연구 유동 세포 계측법 P-HEI-OC1 세포 prestin 발현에 대하여 (C)에서 명확한 증가를 나타내었다. (C) 삽입 된 보조입니다 AB 만 (대조군). 참조 9에서 수정.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. P-HEI-OC1 및 NP-HEI-OC1 세포 (A) 패치 클램프 HEI-OC1 세포에서 NLC 연구. P-HEI-OC1에서 - (B D) NLC와 NP-HEI-OC1 세포. NLC의 피크의 감소와 더 NP-HEI-OC1 세포에서 값을 탈 분극 할 수있는 곡선의 점진적 변화를합니다. 참조 9에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 보고서에서 우리는 어떻게 문화 HEI-OC1 세포에 대해 설명하고 약물 유발 세포 독성의 메커니즘을 평가하기 위해 그들을 사용하고 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사. 기술적 방법은, 그러나, 다른 연구에 쉽게 적응 될 정도로 일반적이다.
여기에 설명 된 모든 프로토콜은 잘 확립 된 세포 배양 기술 (10)의 올바른 사용을 필요로한다. 그냥 다른 세포주와 마찬가지로, HEI-OC1 세포와 함께 작업하는 인증 된 생물 안전 캐비닛, 냉장 원심 분리기, 물 목욕, 세포 배양 검사에 대해 하나의 반전 현미경 및 계산 셀에 대한 제대로 갖추고 세포 배양 설비를 필요로 hemocytometric 기술을 사용하는 경우. 고유 한 요구 사항은, 그러나, NP-HEI-OC1 세포 39 ° C / 5 % CO 2에서 P-HEI-OC1 세포를 33 ° C / 10 % CO 2에서 두 가습 인큐베이터, 한 세트의 가용성 및 기타입니다에스. 계획된 연구는 단지 P-HEI-OC1 셀을 포함하는 경우, 상기 제 배양기는 37 ° C / 5 가지 분석법 때에는 % CO 2로 설정 될 수있다.
플라스틱 세포 배양 접시를 사용 HEI-OC1 셀로 작업에 중요한 추가 필수이다. 사실, HEI-OC1 세포는 매우 강력하고 다른면에서 매우 다른 조건에서 성장 그들은 것입니다. 그러나, 그들의 표현형 및 약물 및 기타 자극에 대한 반응이 강하게 문화 매개 변수 (G Kalinec & F Kalinec, 미 출판)에 따라 달라집니다. 우리는 이전 용지 8 논의 된 바와 같이, 평 OC1 셀이 소성은 유리 신규 실험을 설계하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 잘 인공 외 림프 내의 산소 장력 해수면 (~ 21.3 kPa로) (27)의 전형적인 인큐베이터에서보다 (~ 2 kPa의) 매우 낮은 것으로 알려져있다. 아마,이 농도가 응답을 변경됩니다 낮은 O에서 HEI-OC1 세포를 배양 그들에게 감사를위한 더 나은 모델을 만들기모리 감각 세포.
문화 HEI-OC1 세포 배양 용 기재 프로토콜 또한 코르티 11,12 및 SV의 기관에서 OC-K3 같은 트랜스 제닉 마우스로부터 실험실에서 개발 된 다른 청각 세포주와 함께 사용될 수 있음을 강조해야 -K1 맥리에서 13, 14는 vascularis. 또한, 이러한 세포주를 선택 실험 HEI-OC1 세포 대조군으로서 유용하다. 예를 들어, 최근에 반비례 면역이 prestin하고 HEI-OC1 세포의 세포막에 나트륨 + K + ATPase의 항체가 세포 타입에 의존 응답보다는 형질 전환 마우스에서와 관련된 것을 증명하기 SV-K1 세포를 사용한 이는 이들 세포가 9 유도 하였다.
HEI-OC1 세포 작업을위한 다른 중요한 요구 사항은 70 % 전자와 안전 캐비닛 내의 모든 작업 표면을 청소 적절한 무균 기술의 방법입니다thanol 또는 이소프로판올 및 절차에 필요한 물질의 오염 제거. 기타 포유류 세포주가 자주 페니실린 - 스트렙토 마이신 또는 다른 유사한 조합을 사용하여 부주의 세균 오염에 대해 보호하면서 그러나 항생제 연구의 목적은 그 영향을 조사하는 경우를 제외 HEI-OC1 세포를 사용해서는한다. HEI-OC1 세포는 항생제가없는 조건에서 발생하고, 그것들은 항생제 내성 세포의 출현을 감소시키기 위해 방지되어야한다.
마지막으로, 우리는 이미 점을 다시 강조하는이 보고서에서 여러 번 언급 할 : 표현형 및 약물 및 기타 자극에 HEI-OC1 세포의 반응이 강하게 문화 매개 변수에 따라 달라집니다. 따라서, 평 OC1 셀로 작업 실험실 다른 그룹에서 제공하는 것과 함께 그 결과 실제로 비교할 수 있도록하기 위해 유사한 프로토콜 및 세포 배양 조건을 사용하는 것이 매우 중요하다. 또한, 인매우 중요한 것은 HEI-OC1 세포 라인 만 모델이 모두 한계가있는 모델이라고 기억합니다. HEI-OC1 세포와 그 생체 외 실험을 기대하는 것은 정확하게 실제 청각 감각 세포의 생체 내 반응을 비현실적이다 나타내는 데이터를 제공합니다. 그러나, 우리는 강하게 HEI-OC1 세포 라인 기능 청각 감각 세포의 반응과 약물 약물의 가능성이 독성의 심사를 조사하기위한 유용한 모델입니다 생각합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 mm x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 ml | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
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