Introduction
House Ear Instituto-Órgão de Corti 1 células (IES-OC1) são derivadas do órgão auditivo de um ratinho transgénico 1,2. A incubação de uma célula a partir deste ratinho transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condições permissivas) induz a expressão de um gene de imortalização que desencadeia-de diferenciação e proliferação acelerada; movendo-se as células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condições não permissivas) levam à diminuição da proliferação, diferenciação e, pelo menos no caso de IES-OC1, morte celular 2,3.
células HEI-OC1 foram clonados e caracterizados em nosso laboratório mais de uma década atrás, e os estudos iniciais indicaram que eles expressam marcadores específicos de células ciliadas da cóclea, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, mas também marcadores de apoio células como da conexina 26 e o receptor do factor de crescimento de fibroblastos (FGF-R) 2. Portanto, foi sugerido que HEI-OC1 poderia representar uma common progenitor de células sensoriais e de sustentação do órgão de Corti 2. Estudos paralelos fornecido forte evidência de que arquetípica drogas ototóxicas como cisplatina, gentamicina e estreptomicina induzida ativação da caspase-3 nestas células, enquanto que drogas consideradas não-ototóxicas, como a penicilina, não 2,3. Portanto, esta linha de células foi proposto como um sistema in vitro para investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na ototoxicidade e para o rastreio do potencial ototoxicidade ou propriedades otoprotetoras de novas drogas farmacológicas. Estima-se que as células HEI-OC1 ter sido utilizada em mais de cento e cinquenta estudos publicados nos últimos dez anos.
Considerando a olhar para o potencial efeito pró-apoptótica de diferentes drogas foi o principal objetivo da maioria dos estudos envolvendo esta linha celular, outros processos celulares importantes como autofagia e senescência estão apenas começando a ser investigado em células HEI-OC1 4-7. Eund estudo recente do nosso laboratório 8, usamos células HEI-OC1 para recolher um conjunto abrangente de dados sobre a morte celular, sobrevivência, proliferação, senescência e autofagia induzida por diferentes drogas farmacológicas frequentemente utilizadas na clínica. Também em comparação algumas das respostas de células HEI-OC1 com as de células HEK-293 (células de rim embrionário humano) e células HeLa (células epiteliais humanas) que receberam tratamento idêntico. Os nossos resultados indicaram que as células HEI-OC1 responder a cada droga de uma forma característica, com uma dose distinta e sensibilidade dependente do tempo, pelo menos, um dos mecanismos em estudo. Nós também enfatizou nesse estudo que uma correcta interpretação dos resultados experimentais será necessário realizar estudos paralelos com mais de uma técnica 8.
Em outro estudo que investigou o uso de células HEI-OC1 para avaliar a resposta funcional do prestin, a proteína do motor de células ciliadas externas da cóclea (CCE) 9 + K + ATPase, que translocados a partir da membrana plasmática para o citoplasma sem alterações significativas na expressão de células totais. Além disso, foi demonstrado que as células P-Hei-OC1 tem uma NLC robusta associada a prestin função motora, que diminuiu quando a densidade de moléculas Prestin presentes na membrana plasmática aumentada. Ao todo, estes resultados suportam fortemente a utilidade do HEI-OC1 células para investigar proteínas auditivas.
Neste artigo de vídeo que descrevem como a cultura de células HEI-OC1, por isso é conveniente a utilização de células crescendo em condições permissivas (P-Hei-OC1) para estudos de citotoxicidade, como avaliar o mecanismo / s de citotoxicidade induzida pela droga e como para realizar estudos electrofisiológicos (por exemplo, de patch-clamp, capacitância não-linear (NLC)) para se investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs cocleares.
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Protocol
Cultura 1. celular
Nota: Todos os protocolos de cultura celular deve ser realizada utilizando técnicas de cultura de células adequadas (para referência ver os 3 primeiros capítulos de Biologia Celular: Um Manual de Laboratório, Volume I 10). células HEI-OC1 não requerem qualquer revestimento adicional ou tratamento dos pratos de cultura de células para a aderência adequada e crescimento. Muito importante: não use pratos de vidro para fins de cultura de células; e o fenótipo da resposta biológica das células às drogas farmacológicas mudará (L Kalinec & F Kalinec, não publicado); convencionais placas de cultura de células de plástico são recomendadas (ver Tabela de Materiais / Equipamentos). Preste especial atenção às técnicas assépticas para evitar contaminações, mas nunca usar antibióticos (por exemplo, ampicilina ou à estreptomicina) com células HEI-OC1. Se necessário, usar anfotericina B. Enquanto HeLa e células HEK-293 foram usadas como controle em estudos anteriores com o IES-OC1 8, qualquer outra linha celular podeser aceitável para esta finalidade.
- Reanimação de células congeladas HEI-OC1
Nota: Este protocolo pode também ser usado com outras linhas de células a partir do mesmo ratinho transgénico desenvolvido no nosso laboratório, tais como OC-K3, a partir de órgãos de Corti 11,12, e SV-K1, a partir de estria vascular 13,14.- Remover um frasco de células criopreservadas OC1-IES de N2 líquido, e colocá-lo num banho de água a 37 ° C. Submerge apenas a metade inferior do frasco, e permitir que a descongelar até que apenas uma pequena quantidade de gelo permanece no frasco. Limpar o exterior de um frasco com álcool a 70%.
- Pipetar as células do frasco e entregar todo o volume (~ 1,5 x 10 5 culas / ml) lentamente, gota a gota, num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de um meio de crescimento pré-aquecido, como Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ( DMEM), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS).
- Remover DMSO por centrifugação do tubo a 300-500 x g durante 5 minutos, rejeitando tele sobrenadante e re-suspender as células em 9 ml de meio de crescimento fresco (DMEM + 10% FBS). Desagregar aglomerados ou folhas de células de fluxo e refluxo das células em suspensão, a partir da pipeta para a forma e vice-versa, de três a quatro vezes com a ponta da pipeta tocar no fundo do tubo.
- Colocar o volume total de células suspensas em meio de crescimento em mm de diâmetro 100 não tratados, placas de cultura de células de plástico.
- Incubar as células a 33 ° C com 10% de CO 2 (condições permissivas).
- Subcultura de células HEI-OC1
Nota: Antes até à confluência (~ 80%) as células devem ser postas em suspensão e sub-cultivadas a fim de impedir que a cultura morrer. Este protocolo pode também ser usado com outras linhas de células desenvolvidas no nosso laboratório a partir do mesmo ratinho transgénico, tais como OC-K3, a partir de órgão de Corti 11,12, e SV-K1, a partir de estria vascular 13,14.- Remover o meio velho e lavar as células com 2 ml de PBS. </ Li>
- Cobrir a monocamada de células com uma solução de tripsina a 0,25%, utilizando 1 mL por cada 25 cm2 de área de superfície. Para passar para a próxima etapa mais do que 40% das células devem ser separadas. Examinar as células utilizando um microscópio invertido e, se necessário, "tapa ou toque" das placas de cultura suavemente para libertar quaisquer células ligadas remanescentes.
Nota: Tome cuidado como tripsinização por longos períodos pode causar morte celular; não é suficiente e as células transferidas serão insuficientes para os estudos planeados. - Ressuspender as células, seguindo o procedimento descrito em 1.1.3, e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar durante 5 minutos a 300-500 xg, descartar a forma, recolher as células com meio de crescimento fresco e semear-los em, pelo menos, quatro de 100 mm de diâmetro pratos de cultura de células. O número de células por placa vai depender da quantidade de células recuperadas. Incubar as células a 33 ° C com 10% de CO 2 (P-Hei-OC1) e dividem-se novamente quantas vezes for necessário paraas experiências planejadas ou para gerar um novo estoque.
- Para a preparação de ações, substituir 100 mm de diâmetro pratos de 250-550 ml frascos de cultura celular; para experiências, pequenos pratos ou placas multi-poços pode ser mais adequada.
- Para a diferenciação, incubar células HEI-OC1 em condições permissivas, até que eles atinjam ~ 80% de confluência; em seguida, mover os pratos a 39 ° C com 5% de CO 2 (NP-Hei-OC1) de 2 a 3 semanas.
Nota: As células irá parar progressivamente proliferando e morrer. Mudar o meio todos os dias para remover as células mortas. Dependendo do número original de células, normalmente depois de ~ 4 semanas não há mais células estarão disponíveis para as experiências. A diferenciação começa assim que as células são colocadas em condições NP, mas não todas as células diferenciar no mesmo ritmo. Importante, prestin expressão e localização da membrana aumenta durante o processo de diferenciação (ver Resultados representativos, Figura 4), proporcionando um qualitativae indicação quantitativa do nível de diferenciação.
2. Drogas citotoxicidade Estudos
Nota: células HEI-OC1 cultivadas em condições permissivas (P-HEI-OC1) são recomendados para estes estudos (ver resultados representativos, Figura 1).
- A viabilidade das células (MTT)
- Coletar células P-HEI-OC1, seguindo o procedimento descrito em 1.2, e contá-los com qualquer um contador de células automático ou hemocitômetro. Ajustar a concentração de 2,0 x 10 5 culas / ml.
- Semear as células em placas de 96 poços de fundo plano claros (100 ul por poço), incubar durante a noite para fixação ao substrato, e em seguida tratá-los com os fármacos de interesse. Não se esqueça de incluir espaços em branco e células tratadas não (controle)!
- Após o tratamento de drogas (usualmente 24 ou 48 h a 33 ° C), realizar o ensaio de MTT seguindo o protocolo do fabricante. Em geral, Os protocolos para este ensaio têm os seguintes passos:
- Adicionar 10 ul de reagente MTT a cada poço.
- Incubar a placa a 37 ° C durante 2 a 4 horas até corante roxo é visível, e, em seguida, adiciona-se 100 ul de Reagente MTT detergente a cada poço. Não agite a placa.
- Cobrir a placa e deixá-lo no escuro durante 2-4 horas a 37 ° C.
- Use um leitor de placas de microplacas para medir a absorvância a 570 nm em cada poço, incluindo os espaços em branco (médio crescimento por si só). Normalizar os dados usando o OD média de células de controlo como 100% de viabilidade.
- Caspase Assay 3/7 Activation
Nota: células HEI-OC1 cultivadas em condições permissivas (P-HEI-OC1) são recomendados para estes estudos.- Recolhe células HEI-OC1, seguindo o procedimento descrito em 1.2, e contá-las quer com um contador automático de células ou um hemocitómetro. Ajustar a concentração de 2,0 x 10 5 culas / ml.
- Semear as células no white de paredes placas de 96 poços (100 ul por poço), incubar durante a noite para fixação ao substrato, e em seguida tratá-los com os fármacos de interesse. Não se esqueça de incluir espaços em branco e células tratadas não (controle)!
- Após o tratamento de drogas (usualmente 24 ou 48 h a 33 ° C), realizar o ensaio da caspase seguindo o protocolo do fabricante respectivo. Em geral, os protocolos para este ensaio têm os seguintes passos:
- Prepare os reagentes, mistura-los bem, e permitir que eles atinjam a temperatura ambiente.
- Remover as células a partir do incubador e permitir que as placas a equilibrar à temperatura ambiente.
- Adicionar a quantidade indicada de reagente a cada poço, tomando cuidado para evitar a contaminação cruzada por não tocar em poços contendo amostras diferentes com as mesmas pontas de pipeta.
- Cobrir a placa e misturar durante 30 segundos utilizando um agitador de placas de 300-500 rpm.
- Incubar a placa a temperatura ambiente durante um período de, pelo menos, 30 min. determinÊ O período de incubação ideal empiricamente. Se a temperatura ambiente varia usar uma incubadora de temperatura constante, porque as flutuações de temperatura irá afectar leitura de luminescência.
- Medir luminescência em cada poço, e normalizar valores usando luminescência médio de células de controlo como 100% da activação da caspase.
- Divisão celular (proliferação)
- Recolhe células HEI-OC1, seguindo o procedimento descrito em 1.2, e contá-las quer com um contador automático de células ou um hemocitómetro. Ajustar a concentração de 2,0 x 10 5 culas / ml.
- Semear as células em placas de 96 poços de fundo plano claros (100 ul por poço), incubar durante a noite a condições permissivas para fixação ao substrato, e em seguida tratá-los com os fármacos de interesse. Não se esqueça de incluir espaços em branco e células tratadas não (controle)!
- Uma hora após o tratamento, adicionar a cada cavidade 1 uL de BrdU 100x preparada (5-bromo-2'-deoxyurijantar) solução, e retornar as placas ao incubador a 33 ° C.
- Após 12, 24 e 48 h, remover o meio existente das placas correspondentes e lavar cada poço uma vez com PBS.
- Realizar o ensaio de proliferação de célula seguindo o protocolo do fabricante. Em geral, os protocolos para este ensaio têm os seguintes passos:
- Prepare os reagentes, incluindo a fixação / solução desnaturante, tampão de lavagem, a solução de primário de detecção de anticorpos, detecção de solução de anticorpo secundário, e solução de BrdU tal como indicado no protocolo do fabricante.
- Adicionar a solução de fixação / desnaturação a cada poço, nos montantes indicados no protocolo do fabricante, e manter a placa à temperatura ambiente durante 30 min.
- Remover a solução de fixação / desnaturação e adicionar o anticorpo primário a concentração indicada no protocolo do fabricante. Manter a placa à temperatura ambiente durante 1 h.
- Remover a solução com a formiga primáriaibody, lavar a placa 3 vezes com tampão de lavagem, e depois adicionar o anticorpo secundário na concentração indicada no protocolo do fabricante. Manter a placa com o anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 30 min.
- Remover a solução com o anticorpo secundário, lavar a placa 3 vezes com tampão de lavagem, e adicionar o substrato. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, adicionar a solução STOP. Tenha cuidado: Controlar a mudança de cor; Se a solução torna-se muito escura, parar a reacção antes de o tempo de desenvolvimento de padrão 10 min.
- Ler a absorvância a 450 nm dentro de 30 min após a adição da solução de parada.
- citotoxicidade
Nota: células HEI-OC1 cultivadas em condições permissivas (P-HEI-OC1) são recomendados para estes estudos.- Incubar em condições permissivas, geralmente durante 24-48 horas, as células HEI-OC1 em meio de cultura de células (controlo) ou meio mais os fármacos de interesse.
- No final do tratamento, Lavar as células três vezes com PBS, e separar utilizando 1 mL por cada 25 cm2 de área de superfície de uma solução de dissociação de células não enzimática durante 3 min.
- Depois de retirar, recolher e peletizar as células por centrifugação a 3000 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e corar as células durante 15 min no escuro com o reagente incluído no teste de citotoxicidade.
- Determinar o número de células HEI-OC1 vivo por citometria de fluxo, tal como indicado pelo fabricante do citómetro de fluxo.
- Senescência
- Incubar em condições permissivas, geralmente durante 24-48 horas, as células HEI-OC1 em meio de cultura de células (controlo) ou meio mais os fármacos de interesse.
- Determinar o número de células positivas para SA-beta-gal utilizando citometria de fluxo com o protocolo descrito por Debacq-Chainiaux et al. 15 ou outro método conhecido para proporcionar resultados fiáveis. Uma breve protocolo de citometria de fluxo é o seguinte:
- <li> No final dos tratamentos experimentais, lavar as células três vezes com PBS e depois incubar com 100 nM bafilomicina A1 em meio de cultura de células durante 1 hora em condições permissivas.
- Adicionar C12FDG a uma concentração final de 33 ~ ^ M, e continuar a incubação das células durante 1-2 horas.
- Lavar as células duas vezes com PBS, colhem-los utilizando 1 mL por cada 25 cm2 de área de superfície de uma solução de dissociação de células não enzimática durante 3 min, e o pellet-los por centrifugação a 3000 xg durante 5 min.
- Ressuspender as células em PBS arrefecido em gelo e determinar o número de células HEI-OC1 positivos por citometria de fluxo, tal como indicado pelo fabricante do citómetro de fluxo.
- Recolhe células HEI-OC1 controlar e fome (privadas de soro durante 48 horas), seguindo o procedimento descrito em 1.2, e processá-los por Western blot seguindo protocolos convencionais. Em geral, os protocolos de Western blot têm a seguinte Steps:
- Semente células HEI-OC1 em placas de 6 poços a uma concentração de 1,0 x 10 5 culas / ml. Depois de 24 e / ou 48 h, lavar as células com PBS gelado.
- Lyse com 200 ul de tampão TNESV (1% de NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 1 mM de Na 3 VO 4 mM PMSF) com o cocktail inibidor de protease e um para 5 min em gelo.
- Recolher as células (por raspagem da parte inferior de cada cavidade), transferir para tubos de microcentrifugação e centrifugar a 16800 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Recolhe-se os sobrenadantes e quantificar a concentração de proteína utilizando o BCA de Ensaio.
- Adicionar 5x tampão de carga e DTT 1 mM a cada amostra e fervura durante 5 min para desnaturar as proteínas.
- Executar as amostras utilizando SDS-PAGE num gel de 4-12%, e transferidos para membranas de PVDF.
- Bloquear as membranas com 5% de leite desnatado seco em TBS-T com 0,1% de Tween 20, durante 60 min à TA.
- Incubam-se as membranas durante a noite a 4 ° C com formiga primáriaibodies.
- No dia seguinte, lavam as membranas exaustivamente com TBS-T, e incubar com um anticorpo IgG secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (1: 1500) durante 1 h.
- Detecção imuno-reactividade com um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL). Normalizar os níveis de expressão de proteínas utilizando GAPDH (1: 2000 em TBS-T com 10% de leite magro seco) como padrão.
- Em transferências de Western investigar a expressão de, pelo menos, dois marcadores diferentes de autofagia como beclin-1 e LC3B (normalmente de 1: 1000 de diluição em TBS-T com 2,5% de BSA). Não se esqueça de olhar para um controle da expressão da proteína tais como GAPDH ou actina.
- Avaliar a expressão da proteína de interesse por densitometria usando um scanner Blot digital ou software de computador, tal como o domínio público NIH Imagem ou ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).
3. Experimentos Eletrofisiologia com células HEI-OC1
- células colheita
Nota: utilização de células em crescimento em placas de cultura de 100 mm de diâmetro a 50% -80% de confluência. Tripsina, Accutase, solução livre de enzima, ou p hosphate- b uffered s aline + e thylene d iamine t Etra um ácido cetic (PBS-EDTA) podem ser utilizados para o levantamento das células, sem efeitos significativos sobre o número ea qualidade dos gigaseals . Em alguns casos, no entanto, o tratamento com tripsina torna as células mais frágil. Nestes casos, permitir que as células recuperar durante aproximadamente 30 minutos antes de começar as experiências.- Lavar as células duas vezes com 10 ml de PBS sem Ca 2+ e Mg 2+.
- Adicionar 2 ml de uma solução desacoplador isento de enzimas, tais como a solução de dissociação de células não enzimática, e incubar os pratos durante 3 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Usar um microscópio invertido para verificar a separação das células. Se necessário, mova o cell cultura prato destacar mais células, mas fazê-lo com cuidado.
Nota: Não agite o prato. - Adicionar 10 ml de DMEM + 10% de FBS e pipeta as células suavemente para cima e para baixo cinco vezes com uma pipeta de 10 ml.
- Olhe para as células sob um microscópio. Se> 80% das células já estão separados (single), não é necessário prosseguir pipetagem. Se as células ainda estão em clusters, repita o cuidado pipetando até mais de 80% das células são solteiros.
- Coloque as ~ 10 ml de células em suspensão em um tubo cónico de 15 ml, de centrifugação durante 2 minutos a 100 xg, e desprezar o sobrenadante.
- Use ~ 200 mL de solução de gravação externa (meio L-15 de Leibovitz ajustada para 305-310 mOsm com água destilada) para voltar a suspender as células. Um controle óptico das células deve mostrar muitas células individuais, redondas com bordas membrana lisa.
- Patch-clamp e Medidas NLC
- Execute patch-clamp e as medições de capacitância não-linear dependente de voltagem (NLC) usando umdequate amplificadores e software, bem como técnicas electrofisiológicas padrão. Como o uso de solução interna (intrapipette) KCl 150 mM, MgCl 2 1 mM, EGTA 0,1 mM, 2 mM de ATP-Mg, 0,1 mM de GTP-Na, e 10 mM de HEPES; ajustar o pH para 7,2 com Tris.
- Sob o microscópio, selecionar um único, célula saudável, com rodada e as bordas da membrana lisas. Prenda a ponta da pipeta de vidro para a superfície celular e verificar a resistência da membrana. Isto deve ser de cerca de 3-6 megaohms, correspondendo a um diâmetro interno (ID) da ponta da pipeta de ~ 2 ^ m.
- Pressione suavemente a ponta micropipeta contra a membrana plasmática da célula e, em seguida, aplicar o vácuo. Uma porção da membrana celular serão aspiradas para a pipeta, gerando uma resistência eléctrica da ordem dos 10 - 100 (gigaOhms gigaseal).
- Estabelecer a condição de célula inteira por disrupção da membrana de plasma com pulsos de sucção.
- Utilização de células que não expressam prestin, tais como células HEK-293, como um controlo 9.
Nota: as respostas atuais deve ser filtrado a 5 kHz, e as correções feitas para os efeitos da resistência série residual. Toda a coleta de dados e a maioria das análises podem ser realizadas usando o software incluído geralmente com os amplificadores lock-in. Função de capacitância pode ser montado com o primeiro derivado de uma função de dois estados de Boltzmann relativa carga não-linear de tensão da membrana 16.
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Representative Results
Em um par de publicações recentes já relatado um conjunto abrangente de estudos destinados a avaliar a resposta das células HEI-OC1 a vários medicamentos farmacológicos comumente utilizados, bem como investigar a função prestin 8,9. Nestes estudos, fizemos uso de todos os protocolos descritos nas secções anteriores.
Um dos resultados destes estudos anteriores foi que as células HEI-OC1 cultivadas em condições não permissivas (39 ° C / 10% de CO 2 = NP-Hei-OC1) apresentaram uma diminuição altamente significativa da viabilidade celular, e um aumento igualmente significativo na morte da célula, relativamente a células cultivadas em condições permissivas (33 ° C / 10% de CO 2 = P-Hei-OC1) (Figura 1). Portanto, qualquer estudo de citotoxicidade realizados em células de NP-IES-OC1 devem dedicar esforços consideráveis em efeitos de drogas a partir de discriminar os efeitos das condições de cultura. em addition, já que os efeitos da droga sobre células já morrendo ou com uma viabilidade diminuiu poderia ser diferente que os efeitos da mesma droga em células saudáveis, recomendamos a utilização de células P-HEI-OC1 para experiências que não especificamente exigem células diferenciadas.
Os nossos estudos sobre o efeito de diferentes drogas farmacológicas também produziu resultados interessantes. Por exemplo, a cisplatina, um agente quimioterapêutico frequentemente utilizados para o tratamento de várias malignidades humanas, e acetaminofeno (APAP = N- uma pa ra cetyl--amino henol p), o analgésico mais amplamente vendido over-the-counter nos EUA, ambos foram tóxicos para células HEI-OC1 (Figura 2). No entanto, enquanto APAP diminuiu a viabilidade celular e aumento da caspase 3/7 ativação, ele não induzir a morte celular. A cisplatina, em contraste, aumentaram significativamente as respostas de três (Figura 2). Curiosamente, as caspases 3/7 eram mostlY activada em concentrações mais baixas de cisplatina, sugerindo que a morte celular induzida por doses baixas de cisplatina foi provavelmente mediada por apoptose, enquanto que doses elevadas efeitos letais poderia ser associado com oncose / necroptosis. Enquanto oncose tem sido definida como uma via de pré-letal levando a morte celular desregulado acompanhada por inchaço celular e organela, formação de bolhas, e um aumento da permeabilidade da membrana 17,18, necroptosis é um mecanismo de morte de células não-apoptótico regulada activado pelos mesmos estímulos que iniciam morte celular, mas com características morfológicas semelhantes às do oncose 19-22.
Estudos adicionais destinadas a investigar os efeitos da APAP e cisplatina em células P-HEI-OC1 mostrou um efeito claro, dependente da dose da APAP na proliferação de células que poderia explicar a diminuição intrigante da viabilidade celular, sem morte celular descrito no parágrafo anterior (Figura 3A). als cisplatina O decréscimo da proliferação celular, e o seu efeito aumentado com o tempo de exposição até mesmo para pequenas doses (Figura 3A), mas em adição a senescência diminuiu em todas as concentrações e intervalos de tempo compreendidos no nosso estudo (Figura 3B). A diminuição significativa da senescência celular induzida por cisplatina pode ser explicado pelo aumento da morte celular, assumindo que as células senescentes seria, provavelmente, propensas a morrer mais rapidamente do que as células saudáveis 23.
Mais importante, estes resultados sugerem que as células representativas IES-OC1 respondem a diferentes drogas farmacológicas com uma dose distinta e sensibilidade dependente do tempo, pelo menos, um dos mecanismos em estudo. Portanto, uma interpretação correta de um resultado experimental exigirá uma compreensão clara dos processos celulares particulares investigadas e as informações fornecidas por cada uma das técnicas utilizadas para avaliá-los.
jove_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> confocal e citometria de fluxo experimentos, por outro lado, confirmou a expressão prestin em células P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1, com prestin immunolocalizing principalmente no citoplasma de células P-Hei-OC1 (Figura 4A, setas), e mais concentrado na membrana plasmática nas células NP-Hei-OC1 (Figura 4B, setas). a citometria de fluxo estudos demonstraram um claro aumento em expressão prestin em NP-IES -OC1 células relativamente às células P-Hei-OC1 (Figuras 4C e 4D). O aumento dependente do tempo da expressão e localização da membrana plasmática de células prestin em NP-Hei-OC1 sugere que a translocação foi acompanhada por síntese de mais moléculas prestin. no entanto, estas experiências não fornecer pistas para decidir se moléculas Prestin inicialmente localizadas no citoplasma movimento para a membrana plasmática e novas moléculas substituí-los, se permanecerem no citoplasma e apenas recentemente o sintetizadormovimentos Prestin esized para a membrana plasmática, ou uma combinação de ambos os processos.Estudos electrofisiológicos demonstraram uma NLC robusto nas células P-Hei-OC1 (Figura 5B), com um valor de pico que diminuiu e uma tensão de pico de capacitância que foi deslocado para valores mais despolarizadas, quando as células foram transferidas para condições não permissivas para 1 e 2 semanas (figuras 5C e 5D). Por causa da translocação progressiva de prestin a partir do citoplasma para a membrana plasmática, que originalmente a hipótese de que NLC seria maior em NP-Hei-OC1 do que nas células P-Hei-OC1, e que iria aumentar ainda mais com o tempo de incubação a NP condições. Surpreendentemente, os resultados dos nossos estudos mostraram exactamente a resposta oposta. Especulamos que o aumento da densidade de moléculas Prestin na membrana plasmática poderia ser restringindo a sua função motora.
hin-page = "1"> Nota na Figura 5 a despolarização da tensão no pico capacitância em células HEI-OC1 relação aos valores típicos reportados na CCE e em células HEK293 transfectadas 24; Além disso, observa-se que a mudança de despolarização aumenta com o tempo nas condições de NP. A mudança de despolarização progressiva é semelhante ao descrito no CCE durante ratinho e rato desenvolvimento 25,26, e sugeriu-se que pode ser relacionada com o desenvolvimento de outras estruturas celulares associadas com a membrana plasmática do CCE 25, ou um processo de maturação intrínseca para prestin 24.
Esperamos que este breve recontagem de alguns estudos com células HEI-OC1 fornecer provas suficientes da utilidade potencial de células HEI-OC1 para investigar um amplo espectro de respostas moleculares das células e.
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Figura 1: A viabilidade celular e morte celular na P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 Cells. Viabilidade (A) celular avaliada com o ensaio MTT. A absorvância foi medida com um leitor de placas, e OD média de células de controlo foi tomada como 100% de viabilidade. Morte (B) celular avaliada com um ensaio de citotoxicidade. O número de células positivas (mortos) foi determinada por citometria de fluxo com excitação de 488 nm (laser azul) e FL1: 530 15 nm. Note-se a (P ≤0.001) diminuição altamente significativa da viabilidade celular (A) e aumento da morte celular (B) induzida por condições não permissivas. As barras representam o erro padrão das médias (SEM). Modificado de referência 8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
"Figura 2" src = "/ files / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg" />
Figura 2:. Respostas de células HEI-OC1 expostas para o APAP e cisplatina quando analisado por MTT, as caspases 3/7 e Citotoxicidade viabilidade (A) celular avaliada com o ensaio de MTT, e a absorvância medida com um leitor de placas. (B) A activação de caspases executoras 3/7. (C) Fármaco - induzida morte celular avaliada com um ensaio de citotoxicidade; o número de células positivas (mortos) foi determinada por citometria de fluxo. Os dados em cada experimento foi normalizada para as respectivas condições de controle (controle = 1) para possibilitar a análise estatística simultânea. * = P ≤0.05 relação ao controle. As barras representam o erro padrão das médias (SEM). Modificada fromreference 8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos da APAP e cisplatina em 'HEI-OC1 células mitóticas Taxa e senescência. (A) Alterações induzidas pela droga sobre a taxa de divisão mitótica de células HEI-OC1, às 24 e 48 horas, foi avaliada com um BrdU de Ensaio. (B) senescência induzida por drogas em células HEI-OC1 foi medida por citometria de fluxo ea senescência associado β-galactosidase (SA-Bgal) técnica. Os dados em cada experimento foi normalizada para as respectivas condições de controle (controle = 1) para possibilitar a análise estatística simultânea. * = P ≤0.05 relação ao controle. As barras representam o erro padrão das médias (SEM). Modificada fromreference 8. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da tsua figura.
Figura 4:. Prestin Expressão em P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 Cells - células foram marcadas com anti-Prestin Antibody e observado por microscopia confocal e citometria de fluxo (A) Em células P-HEI-OC1 prestin imunolocalizada principalmente à o citoplasma (setas). (B) Em células de NP-Hei-OC1, em contraste, a reactividade prestin foi concentrado na membrana plasmática (setas). (C e D) estudos de citometria de fluxo em células HEI-OC1 cultivadas durante 2 semanas em condições NP (D) mostrou um claro aumento em expressão prestin respeito a células P-Hei-OC1 (C). (C) Inset é secundário ab somente (controle negativo). Modificado de referência 9.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: estudos NLC em células P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 (A) células HEI-OC1 apertado-Patch.. (B - D) NLC na P-HEI-OC1 e NP-HEI-OC1 células. Note-se a diminuição no pico de NLC e a mudança progressiva das curvas de valores em células NP-Hei-OC1 mais despolarizadas. Modificado de referência 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste relatório nós descrevemos como cultura de células HEI-OC1 e usá-los para avaliar mecanismos de citotoxicidade induzida por drogas e investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs coclear. Os procedimentos técnicos, no entanto, são em geral suficiente para ser facilmente adaptado a diferentes estudos.
Todos os protocolos descritos aqui requerem o uso correto de técnicas de cultura de células bem estabelecidos 10. Tal como com qualquer outra linha celular, que trabalha com células HEI-OC1 requer uma instalação de cultura de células, devidamente equipado, com um gabinete de certificado biológica de segurança, numa centrifugadora refrigerada, um banho de água, e um microscópio invertido para o exame de culturas de células e para a contagem de células se utilizando técnicas hemocytometric. Uma exigência única, no entanto, é a disponibilidade de dois incubadoras humidificadas, um conjunto a 33 ° C / 10% de CO 2 por células P-Hei-OC1 e outro a 39 ° C / 5% de CO 2 por células NP-Hei-OC1s. Se os estudos de envolver previstas apenas as células P-Hei-OC1, segundo a incubadora pode ser fixado em 37 ° C / 5% de CO 2 para ensaios diferentes.
O uso de placas de cultura de células de plástico é um importante requisito adicional para trabalhar com células HEI-OC1. De fato, as células HEI-OC1 são muito robusto e eles vão crescimento superfícies diferentes e sob condições muito diferentes. No entanto, seu fenótipo e sua resposta a drogas e outros estímulos dependerá fortemente os parâmetros de cultura (G Kalinec & F Kalinec, não publicado). Como discutimos em um artigo anterior 8, essa plasticidade das células HEI-OC1 podem ser vantajosamente usados para projetar novas experiências. Por exemplo, sabe-se bem que a tensão de oxigénio na perilinfa coclear é muito menor (~ 2 kPa) do que numa incubadora típica ao nível do mar (~ 21,3 kPa) 27. Incubação de células HEI-OC1 em baixa concentrações de O 2 irá mudar suas respostas, talvez tornando-os um modelo melhor para auditoriacélulas sensoriais ORY.
Deve ser enfatizado que os protocolos descritos para a cultura e a subcultura de células HEI-OC1 também pode ser utilizado com outras linhas de células auditivas desenvolvidos no nosso laboratório a partir do mesmo ratinho transgénico, tais como OC-K3 do órgão de Corti e 11,12 SV -k1 da estria vascular 13,14. Além disso, estas linhas celulares podem ser úteis como controlo para células HEI-OC1 em experiências seleccionadas. Por exemplo, temos usado recentemente células SV-K1 para demonstrar que a imunorreactividade inversamente proporcional ao prestin e anticorpos Na + K + ATPase na membrana plasmática de células HEI-OC1 foi a resposta dependente do tipo de célula em vez relacionado com o ratinho transgénico a partir de que estas células foram derivadas 9.
Outro requisito essencial para trabalhar com células HEI-OC1 é a prática de técnicas de assepsia adequadas, tais como limpeza de todas as superfícies de trabalho dentro do gabinete de segurança, com 70% eThanol ou isopropanol e a descontaminação de todos os materiais necessários para os procedimentos. No entanto, enquanto que outras linhas de células de mamífero são frequentemente protegidos contra contaminação bacteriana inadvertida pelo uso de penicilina-estreptomicina ou outras combinações semelhantes, antibióticos nunca deve ser utilizado com células HEI-OC1 excepto se o objectivo do estudo é investigar os seus efeitos. células HEI-OC1 foram gerados em condições isentas de antibiótico, e que deve ser evitada para diminuir a emergência de células resistentes a antibióticos.
Finalmente, queremos voltar a sublinhar um ponto já mencionado várias vezes neste relatório: o fenótipo e a resposta das células HEI-OC1 a drogas e outros estímulos dependerá fortemente os parâmetros de cultura. Portanto, é muito importante que os laboratórios que trabalham com células HEI-OC1 usar protocolos semelhantes e as condições de cultura de células, a fim de fazer os seus resultados verdadeiramente comparáveis com aqueles fornecidos por outros grupos. Além disso, émuito importante lembrar que a linha de células HEI-OC1 é apenas um modelo, com todas as limitações que tem um modelo. Esperando que os experimentos in vitro com células HEI-OC1 irá fornecer dados que representam com precisão as respostas in vivo de células sensoriais auditivas reais é irrealista. No entanto, nós acreditamos fortemente a linha de células HEI-OC1 é um modelo útil para a investigação de respostas funcionais das células sensoriais auditivas e ao rastreio do potencial ototoxicidade de drogas farmacológicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 mm x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 ml | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I.
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).
