Summary
el fleksör tendonlar sıklıkla bozulmuş el fonksiyonu yol yaralandı. Bununla birlikte, yara izi dokusunu iyileşme yanıtı iyi karakterize değildir. fleksör tendon iyileşmesi bir fare modeli burada gösterilmiştir. Bu model iyileşme sürecinin genel anlayış geliştirmek ve şifa iyileştirmek için tedavi yaklaşımları değerlendirmek.
Abstract
Tendon neredeyse tüm vücudun hareketini kolaylaştıran, iskelet kas ve kemik bağlar. elinde, fleksör tendonlar (FTS) parmakları ve genel el fonksiyonunun fleksiyonuna etkinleştirin. FT yaralanmaları yaygındır ve tatmin edici iyileşme çoğu zaman aşırı skar dokusu ve tendon ve çevre doku arasındaki yapışıklıklar bozulur. Ancak, küçük FT onarım moleküler ve hücresel bileşenleri hakkında bilinmektedir. Bu amaçla, hareket bozukluğu aralığı dahil olmak üzere, insanlardaki iyileşme birçok açıdan, tekrarlar ve mekanik özellikleri azalma FT tamir bir murin modeli, geliştirilmiş ve daha önce tarif edilmiştir. İşte bu cerrahi işlem derinlemesine bir gösteri kesiye ve fare arka pençesine fleksör digitorum longus (FDL) tendonun sonraki tamir edilmesi suretiyle sağlanır. Bu teknik gen kazanç veya kayıp fonksiyon-etkilerini değerlendirmek, ve verimli test etmek için, farklı hücre tiplerinin soyu analizi yapmak için kullanılabiliriyileşme sürecinde kullanılan ilaç tedavilerinin etkinlik gösterir. i) transeksiyonu ve onarım meydana fare arka ayağın, orta kısmında FDL tendon, bir sinovyal kılıf ile çevrili değildir: Ancak, bu modelin iki temel sınırlamalar vardır. Bu nedenle, bu model skar oluşumu sürecine kılıfın potansiyel katkısı hesaba katmaz. ii) onarım sitenin bütünlüğünü korumak için, FT olasılıkla artmış yara oluşumuna katkıda tendonun mekanik kuvvetleri azalan myotendinous kavşakta serbest bırakılır. akım sitometri analizi için iyileşme sürecinde FT granülasyon dokusu yeterli hücrelerin izolasyonu zor olduğu kanıtlanmıştır; Bu hücrelerin konsantre sitoloji santrifüj kullanılan başka bir yöntemdir, ve imünoflöresan markalama yapılabilir üzerinde hücre preparatlarının oluşturulmasına izin verir. Bu yöntem ile, FT iyileşme sırasında hücreler ya da ilgi duyulan proteinlerin ölçümü mümkün olur.
Introduction
fleksör önkol kaslarının ve dijital kılıflar ile uyum içinde el işçiliği fleksör tendon basamak fleksiyon ve el kavrama işlevini etkinleştirmek için. Fleksör tendonlar elin palmar uzanmak; Bu nispeten yüzeysel konumu genellikle elle travma sırasında fleksör tendon yaralanmaları ile sonuçlanır. Tendon, normal tendon dokusunun 1 bir skar dokusu tepki yerine rejenerasyon yoluyla iyileşir. Bu skar dokusu tendon sürekliliğini sağlarken, işlev sağlıklı tendon göre azalmış dramatik bir. Tendon-skar dokusu kompozitler kopma olasılığı daha yüksektir tamir tendonları render, bozulmuş mekanik özellikleri 1 ile karakterizedir. Buna ek olarak, yara dokusu, tendon boyutu ve toplu olarak bir artışa neden olur, yerli tendonun kollajen lif yapısının organizasyonu yoksundur. Tendon-kılıf biriminin anatomik kısıtlamalar, tendon boyutunda bile mütevazı bir artış göz önüne alındığında can ölçüde kırmızıkayma tendon fonksiyonunu ve hareket ve el fonksiyonu dolayısıyla haneli aralığını UCE.
Fleksor tendonların 1960 yaralanmaları, el II.Bölgede özellikle öncesinde, rutin nedeniyle bu onarım 2 ile ortaya çıkan iyileşme ciddi komplikasyonlara tamir edilmedi. Elin Bu alan 'adam hiçbir arazi 3' olarak sevk edildi. Ancak, cerrahi teknikler, dikiş desenleri ve fizik tedavi rehabilitasyon protokolleri gelişmeler dramatik fleksör tendon onarımı 2 sonuçlarını iyileştirilmiştir. Bu ilerlemelere rağmen, onarım% 40'a varan el fonksiyonlarını 4 engellemek için yeterli yapışma oluşumuna neden. Bu nedenle, biyolojik bir iyileşme geliştirmek için gereklidir. Ne yazık ki, çok az hücresel ve moleküler düzeyde tendon iyileşme süreci hakkında bilinmektedir. Bu nedenle, amaç, temel understandin geliştirmek için kullanılabilecek bir sıçan modelinde geliştirmektişifa artırmak için yeni terapötik hedefler belirlemek için bir araç olarak fleksor tendon iyileşmesi ve skar oluşumu yanıt hücresel ve moleküler bileşenleri, g.
Büyük hayvan modelleri fleksör tendon iyileşme sürecinin anlaşılmasını ilerletmek vesile olmuştur. Köpek ve tavşan çalışmaları fleksör tendonların 5,6 içsel ve dışsal şifa yeteneği hem de göstermiştir, immobilizasyon 7 adezyon göreceli minimize erken kontrollü pasif hareket önemi yanı sıra, iyileşme sürecine 8 farklı sütür desen etkileri 9. Buna ek olarak, köpek modeli şifa 10 artırmak için öteleme doku mühendisliği yaklaşımları test yararlı olmuştur. Bununla birlikte, görece maliyet sıçangil özel reaktiflerin mevcudiyeti dahil büyük hayvan modeli için bir fare modeli kullanılmaktadır kullanılarak birçok önemli avantajı vardır ve küresel Knoc üretilmesi kolaylığıya da dokuya özel silme / aşırı yapıları aşımlarının k. Ayrıca, fleksor tendonları 11 ile ilgili olarak insan ve fareler arasındaki fonksiyonel benzerlik bir kemirgen modeli geliştirme potansiyel yararını göstermektedir.
fleksor tendon transeksiyonu ve onarım taklit bol skar dokusu ve bozulmuş mekanik özellikleri oluşumu da dahil olmak üzere klinik iyileşme birçok yönleri, bir fare modeli geliştirilmesi. Burada açıklanan model onarım sitesini korumak amacıyla nedeniyle myotendinous kavşakta FDL kesilerinden için klinik pratikte gerçek bir tekrarlama değil. Onarım meydana tendon orta kısmını kaplayan herhangi bir sinovyal kılıf yoktur Dahası, bu model, şifa yanıt sinovyal kılıf hücrelerinin katkısı hesaba katmaz. Bu kısıtlamalara rağmen, bu model fare modellerinde daha clos gösterilebilir henüz hareket sınırlayıcı yapışıklıklar üreten aralığı avantajı vardırely klinik senaryo yaklaşmaktadır. Bu model knock-out fare modelleri 12,13 değerlendirmek ve şifa 14-17 geliştirmek için farklı farmakolojik yaklaşımlar test etmek için kullanılır olmuştur. Histolojik immünohistokimyasal kullanarak, bu modelin analizleri ve in situ melezleme, iyileşme sırasında anahtar genlerin ve proteinlerin lokalizasyon için önemli bilgiler sağlayabilir. Ancak, histoloji yalnızca bir kesit mekansal analiz sağlar ve tüm doku boyunca kantifikasyonunu izin vermez. Akış sitometri daha nicel bir yaklaşımı temsil eder, ama hücrelerin sadece çok sınırlı sayıda fare modelinde iyileşen tendon dokusundan izole edilebilir, ve bu sayı daha da tespit, geçirgenleştirme ve yıkama adımları sırasında azaltılır. hesapta bu alarak, sitometri nedeniyle gerekli olacaktır hayvan sayısı bir olanaksız bir yaklaşım olur akar. Alternatif bir yöntem için, bu küçük bir hücre popülasyonunun çoğunluğunu korumak için gerekli olanayrıca şifa ortam karakterize etmek. Burada gösterilen Bunu gerçekleştirmek için kullanılan yöntem, bağışıklık kimyası ve ardından bir cam lam üzerine sitoloji santrifüj yoluyla izole hücrelerin konsantrasyonu içerir. Bu çalışmada edu (5-etinil-2'deoxyuridine bir timidin analoğu) dahil edilmesi ve daha sonra etiket iyileşmesi yerinde hücrelerin göreceli proliferatif durumu belirlemek için kullanılmıştır. Bu yaklaşım, hücre çoğalması, gen nakavt veya aşırı ekspresyonuna farmakolojik tedavilerin etkisini test etmek için, ya da farklı hücre popülasyonu belirlemek ve ölçmek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Rochester Üniversitesi'nde Hayvan Araştırmaları Üniversite Komitesi, tüm hayvan deneyleri onayladı. On-12 haftalık dişi C57BL / 6J fareleri kullanılmıştır.
Flexor Tendon Cerrahisi Animals 1. Hazırlık (~ 15 dk)
- Otoklav cerrahi aletler, sterilize boyunca steril eldiven giyin ve steril bir operasyon alanı korumak için.
- vücut ağırlığına tekabül eden bir ketamin hacmi (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile intraperitoneal enjeksiyon (i.p.) ile fare anestezisi. ayak-tutam refleksinin yokluğu yoluyla sedasyon derinliği onaylayın.
- subkutan enjeksiyon yoluyla rüçhan analjezi (buprenorfin, 0.05-0.1 mg / kg) yönetmek. kurumasını önlemek gözleri oftalmik merhem sürün.
- tüm arka bacak üzerinde kürk kırpma cerrahi bölgeyi hazırlayın. povidon iyot ile tekrar% 70 etanol ve ardından povidon iyot ile sırayla, ovma cildi sterilize ve.
- buzağı medial yüzeysel görülen fleksör digitorum longus (FDL) tendon, bulun. Bir neşter kullanılarak, tendon ortaya çıkarmak için mikro-makas ile deride küçük 0.5-1 cm'lik kesi yapmak.
- çevreleyen dokudan FDL tendon ayırmak ve myotendinous kavşağa o kadar izlemek için forseps kullanabilir. posterior tibial arter önlemek için özen, onu serbest bırakmak için yaylı makas ile bu kavşakta tendon kesin.
- 5-0 naylon sütür ile cilt kapatın.
Not: FDL transection ve tamiri (2.4 adımlar) Stereomikroskopta kullanılarak yapılmalıdır. - bahar mikro-makas kullanılarak arka pençe posterolateral yönü üzerinde 3 mm kesi yapmak. Yavaşça doku hasarı en aza indirmek ve FDL tendon tanımlamak için emin olun, forseps ile çevreleyen yumuşak doku ve kas geri çekin.
- Yavaşça FDL tendon yükseltmek ve tamamen mil kullanarak transectcro-makas. periyodik serum fizyolojik ile ıslatma yoluyla tendonun kurumasını önlemek, 8-0 sütür ile modifiye Kessler desen tendon birlikte FDL uçlarını dikin.
- tendon üzerinde yumuşak doku ve kas değiştirin sonra 5-0 naylon sütür ile kesi kapatın.
- anestezi kurtarıldı kadar vücut ısısını korumak için, 37 ° C slayt sıcak seti fareler yerleştirin.
- ameliyat sonrası artmış vokalli ve karıştırdı kürk dahil olmak üzere yetmezliği ya da enfeksiyon belirtileri için fareler izleyin. Farelerde kadar her 12 saatte artık ağrı veya sıkıntı belirtileri gösterebilir analjezik olarak buprenorfin (50 ul / fare) enjekte edilir.
- fareler sonraki adımlara devam etmeden önce 10 gün sonrası cerrahi bir süre için iyileşmek için izin verin.
Not: Hücreler herhangi bir zaman noktası sonrası cerrahi hasat edilebilir. Burada, 10 gün, şu anda doku nispeten yüksek selülarite verilen bu Örnek deneyler için seçilir.
3. LabeliBisiklet Hücreler ng (~ 10 dakika)
- Edu (5-etinil-2'deoxyuridine) çözeltisi hazırlayın (steril fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 mg / ml [PBS] +,% 1 dimetil Sülfoksit [DMSO] çözünürlüğünü arttırmak için).
- IP enjeksiyon yoluyla kurban önce 24 saat 100 ul edu (50 mg / kg) ile fareler enjekte edilir.
Sitoloji Santrifüj 4. Hasat Hücreleri (2.5 saat, ~ 30 dakika Hands-Zaman)
- PBS içinde 3 mg / ml kollajenaz I hazırlayın.
- en fazla 3 L / dakikalık bir akış oranında karbon dioksit ile boğularak ile fare öldürülür ve ikincil bir tedbir olarak servikal dislokasyon gerçekleştirin.
- Yukarıdaki adım 2.4 kullanılarak onarılan bir tendonun bulun ve mikro makasla yaralanma bölgesinde her iki tarafında yaklaşık 2 mm keserek tendon dokusuna izole eder.
- 3 mg / ml kolajenaz 1 ml bir petri neşter ile kıyma doku daha sonra dokunun kırmak için 18 G iğneli birkaç kez ile karışım geçmektedir. 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpüne karışımın toplanması. çalkalanarak 37 ° C'de 1 saat süre ile tendon dokusuna Digest.
- Sıkma dokusunu (5 dakika için 300 x g), aspirat kolajenaz, daha sonra birkaç kez pipetli yukan aşağı çekilerek PBS içinde 500 ul% 3 sığır serum albümin (BSA) ile hücre / doku tekrar süspansiyon.
- 70 mikron hücre süzgecinden Filtre hücre süspansiyonu enkaz ve tendonun büyük parça ve 37 ° C inkübatör kenara kaldırın.
- Başka bir 1.5 ml santrifüj tüpüne tendon dokusuna yerleştirin ve pipetleme, 1 mi kolajenaz çözeltisi ile yenileme aşağı karıştırın.
- çalkalanarak 37 ° C'de doku bir saat inkübe edin.
- sindirilmiş tendon dokusu (5 dakika boyunca 300 xg) aşağı Spin, sonra yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı PBS içinde 500 ul% 3 BSA içinde tekrar süspansiyon.
- , 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu Filtre 4.3.3 izole süspansiyon ile birleştirmek, daha sonra bir hemasitometre hücreleri saymak.
- Daha sonra 3-6 kadar tekrar süspansiyon, PBS içinde% 3 BSA ile bir kez daha yıkama hücrelerix 10 4/100 ul.
- pozitif yüklü slayt bir sitoloji huni takın ve slayt taşıyıcısının içine kilitleyin. Bir sitoloji santrifüj içine tüm aparat takın ve huni 100 ul hücre süspansiyonu ekleyin. 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj slayta hücreleri dağıtmak için.
5. İmmünositokimya Edu Algılama için (2 saat, ~ 45 dakika Hands-Zaman)
Not: Tüm bekletme işlemleri florofor photobleaching sınırlamak için karanlıkta yapılmalıdır.
- adımları için gerekli çözelti en aza indirmek için, bir hidrofobik bariyer kalemle daire hücreler, daha sonra hemen oda sıcaklığında PBS, 15 dakika içinde 150 ul% 3 paraformaldehit (RT) ile tespit edin.
- PBS içinde 150 ul% 3 BSA ile 5 dakika boyunca iki kez yıkanır.
- Oda sıcaklığında PBS, 20 dakika içinde% 0.5 Triton-X-100 ile Permeabilize hücreleri.
- 5.1.1 gibi tekrarlayın yıkama adımı.
- Edu reaksiyon cockt hazırlayınail kit talimatlarına fazla kullanımdan önce en az 30 daha uygun.
- Her slayt için 150 ul kokteyl ekle oda sıcaklığında 30 dakika inkübe.
- 5.1.1 gibi tekrarlayın yıkama adımı.
- Oda sıcaklığında, 30 dakika PBS içinde 2,000: Nükleer karşıt Hoechst33342 1 seyreltilmiş 150 ul inkübe edin.
- PBS 1X 150 ul, 5 dakika boyunca iki kez yıkanır.
- daha sonra yavaş yavaş, 1-2 hücrelerine montaj orta anti-solmaya damla kabarcıklar önlemek için alt lamel ekleyin.
- Oda sıcaklığında, karanlıkta gece boyunca tedavi için orta montaj izin verin.
- slayt lamel mühür net oje kullanın.
- DAPI (Hoeschst33342) saptayabilen uyarma / emisyon filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak 40X büyütmede görüntü slaytlar, ve Texas Kırmızı (Alexa Fluor 594).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fleksör digitorum longus buzağı bulunan (FDL) kas, myotendinous proksimal çalıştığı, (Şekil 1A mavi özetlenen ve Şekil 2A histolojik gösterilen) fleksör tendon aracılığıyla fare arka pençe rakamlarını flex hareket kavşak ve distal falanks sonlandırır. Arka pençe basamağı (kırmızı oklar, Şekil 1A) için çatallanma, proksimal fleksör tendon iyileşme Bu modelde, FDL tendonu nakledilmiştir ve orta dibinde onarıldı. Deneysel analiz engel olur onarım, delinmesine engel olmak için, tendon (ve komşu kas) kesilir, ya da myotendinous kavşak (Şekil 1B sarı okla, Şekil 1C gösterilen sürüm) de çıkardı. Bu adım klinik senaryo temsilcisi değil iken, yaralanma sitede gerginlik azaltarak onarım korumak için çok önemlidir. 2D ŞekilŞekil 2C gösterilen başarılı bir onarım kıyasla rüptürü fleksör tendon onarımı bir histolojik örnektir. İkinci olarak, granülasyon dokusu görüntüler büyük ölçüde zarar görmemiş tendon (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında hücresel artışa ve bu hücre popülasyonu daha sonra immünsitokimya tarafından izlenen bir slayt üzerine sitoloji santrifüj yoluyla daha analiz edilebilir. 3 değerlendirmek için kullanılan deneysel prosedür ana hatlarıyla Şekil yeni sentezlenmiş DNA'ya edu katılması yoluyla tendonlar 10 gün sonrası onarım şifa toplanan hücrelerin proliferatif durumu. Edu markalama nedenle, Şekil 4'te görüldüğü gibi aktif canlı farelerde edu dalgasını takiben 24 saatlik bir süre boyunca çoğalan yalnızca hücrelerini göstermektedir. Iyileşme tendon granülasyon dokusundaki proliferasyonu kantitatif bir değerlendirme daha sonra nokta sayımı ile tespit edilebilir tüm hücre hazırlama. ProLife Bu şekilde, bir taban çizgisioranı, her bir zaman noktasında tesis edilebilir, ve, genetik ya da farmakolojik tedavi herhangi bir değişiklik değerlendirilebilir.
Şekil 1 :. Fare Hind Paw Anatomisi ve Flexor digitorum longus tendonu tanımlanması. Fleksör digitorum longus (FDL) fare arka pençesine rakamları şişiriyor ve (FDL mavi özetlenen) nereye arka pençe palmar boyunca uzanan basamak (kırmızı oklar) (Şekil 1A) üzere iki kola ayrılır. Proksimale, FDL tendon myotendinous kavşağı (sarı ok) (Şekil 1B) biten, buzağı içine tarsal tünelde (siyah ok) geçiyor. Delinmesine engel olmak için myotendinous kavşağında tendonun sürümü Şekil 1C 'de gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Un-yaralı Normal Şifa ve Rüptüre Flexor Tendon Onarım Temsilcisi histolojik Görüntüleri fare arka pençesine FDL tendonun anatomisi Şekil 2A gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder. Şekiller 2B-D, tendon bozulmadan ve rüptüre onarım (Şekil 2C ve 2D, sırasıyla) yaralanmamış tendon dokusu (Şekil 2B) karşılaştırmak için 8X de büyütülür. Tüm arka pençe örnekleri 3 um bölümler kesilip, parafin içine gömüldü, nötr tamponlu formalin içinde sabitlendi ve daha önce tarif edildiği gibi 13 Alsiyan mavisi / Hematoksilin / turuncu G ile boyanmıştır. Yerli tendon mavi özetlenen, tendon / granülasyon dokusu kompozit yeşil özetlenen ve siyah oklar dikişlerle işaret edilmektedir. Ölçek çubukları 200 mikron temsil etmektedir. Pkira, bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3:. Deneysel Prosedür Edu tıklayın-it Kimya Hücre Hazırlıkları FDL tendonları şifa gün 10 ameliyat sonrası fare arka pençeleri disseke edildi Açık Gerçekleştirme. tendon, sonra, kıyılmış I hücreleri ayırmak için kolajenazın iki saat sindirildi. Hücre süspansiyonu enkaz kaldırmak için gergin edildi ve ~ 6 x 10 4 hücreler sitoloji santrifüj kullanılarak pozitif yüklü cam slaytlar bir tek tabaka haline döndürüldü. Hücreler hidrofobik bir bariyer kalem ile çember ve daha sonra paraformaldehid ile hemen tespit edildi. Triton X-100 ile permeabilization sonra, hücreler bir edu algılama kokteyli ile tedavi edildi ve bir tıklama kimya reaksiyon dahil edu için Alexa Fluor 594 bağladı. Hoechst 33342 nükleer boyama olarak kullanılan ve hücrelerin edildi wer Bir floresan mikroskop ile 10-40X analiz e. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Fleksor tendon şifa şifa FDL tendon CYClİnG edu-işaretli hücrelerin İmmünositokimya analizi farelerin ayak pençelerinin 10 gün ameliyat sonrası elde edilmiş ve bir hücre süspansiyonu elde etmek için kollajenaz ile sindirilir. Santrifüj görüntü edu dahil edilmesine, bağışıklık kimyası ve ardından slaytlar üzerinde tek-katman, bu hücrelerin dağıtılması için kullanıldı. Şekil 4A ve Şekil 4B immünositokimyasal analizi aşağıdaki hücrelerin sırasıyla 10X ve 40X alınan görüntülerdir. Nükleer leke Hoechst 33342 mavi ve Edu dahil olan hücreler kırmızı ile noktalı. Ölçek çubukları 50 uM temsil etmektedir.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" target = "_ blank" href> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tam kesisi ve fleksör digitorum longus tendon onarım fare modeli için cerrahi prosedür bu çalışmada sunulmuştur. Buna ek olarak sitolojisi santrifüj küçük hücre popülasyonlarının konsantre yeni bir uygulama fleksor tendonu iyileşmesi sırasında hücresel ortamda kantitatif immünositokimyasal analizi için izin gösterilmektedir. Fleksor tendon onarımı Bu model nakavt modeller kullanılarak iyileşme sürecinde değişiklik ya da farmakolojik müdahale ile değerlendirmek için kullanılabilen bir yeniden üretilebilir iyileşme yanıtı, göstermektedir. Ameliyatı takiben, inflamatuar reaksiyon hücreleri yaralanma sitesine işe ve lifli doku nasır oluşmaya başlar hangi boyunca 24 saat içinde başlar. Bir proliferatif faz 14-21 gün arasında yapışma oluşumuna yol açan, büyük ölçüde artmıştır selülarite ve onarım yerinde dağınık hücre dışı matriks bol birikimi içeren günde dört, yaklaşık olarak izler. Doku yeniden continues gün 35 boyunca, hangi zaman sürekliliği ve fleksör tendon organizasyonu restore edilir ve sellularitesi 18 azalır.
Şu anda, burada sunulan bir ek fleksör tendon onarımı birkaç fare modelleri vardır. Tsubone ve diğ., Fleksor tendonu iyileşmesi 19 bir in vitro modeli tarif edilmiştir. Bu model, zamanla gen ifadesinde değişiklikleri değerlendirmek mümkün olmakla birlikte, dış hücreler veya in vivo meydana inflamatuar / sitokin ortamda değişikliklerin işe alım için hesap edemiyor. In vivo, kısmi kesisi iki model insizyonel veya eksizyonel kullanarak geliştirilmiştir kusurlar 20,21. Daha yakın zamanda, Wong ve diğ., Bir murin modelinde 22 fleksor tendonu hasar bir bölge II modeli ile karakterize edilir. Bu iyileşme süreci için sinoviyal kılıf-kökenli hücrelerin katılım tanımlanmasına izin verir gibi bu önemli bir gelişmedir. Bununla birlikte, herhangi bir ölçülebilir kayma fonksiyonundaki değişiklikler, bu model kullanılarak tarif edilmiştir. Her model kendi yararları ve teknik kolaylığı, klinik önemi ve anatomi gibi kabul edilmelidir sınırlamaları vardır. Burada açıklanan model, bir ana sınırlama iyileşen tendon daha fazla analiz için kullanılamaz hale, değerlendirme öncesinde kırılabilir olmasıdır. Yeterli hücrelerin hasat bu koşullar altında olanaksız hale ve rüptüre tendon yukarıda açıklanan standart iyileşme sürecini takip etmez gibi herhangi bir histokimyasal analizler değil, uygulanabilir mesafesindedir. şifa tendon üzerindeki yükü azaltmak için proksimale FDL tendonuna bırakılması bu nedenle klinik olarak anlamlı olmamasına rağmen önlenmesi için kritik bir adımdır. cerrahi yürütmek tek taraflı da rüptür oranı düşürür. Başka bir sınırlama sinovyal kılıf bu modelde yaralanan FDL tendon segmenti çevreleyen değil gibi, peri-tendineae kılıf hücrelerinin katkısını izlemek için yetersizliğidir.
jove_content "> Bu fleksör tendon onarımı modelinin önemli bir işlevi şifa yerinde hücrelerin değerlendirilmesi izin vermesidir. İHK benzersiz uygundur iken İmmünofloresan / immünohistokimya (İHK). bu hücreleri karakterize etmek için kullanılabilir bir ortak biyolojik bir tekniktir mekansal bilgi belirlenmesi için, bu doku derinliği boyunca doku ya da hücre bileşiminde değişiklikler atlanabilir. büyük ölçüde niteliksel bir yöntemdir ve nüfus ölçümü zordur. Akım sitometri hücreyi izole potansiyel tanımlamak ölçmek ve ideal bir yaklaşımı temsil iyileşmesi sırasında popülasyonu. hücre içi işaretlerinin tespiti azaltır Ancak, akış sitometrik analizi (her bir fareden elde edilen ortalama 1-2 x 10 5), ve sabitleme için bu model verimleri izolasyon ve iyileşme tendon dokusuna sindirim çok düşük hücre sayısı / permeabilizasyon adımları immunocytoche ardından izole hücreler konsantre sitoloji santrifüj kullanarak daha bu sayı.,mistry bu küçük hücre popülasyonlarının karakterize için bir yol sağlar. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yeterli hücre elde etmek üzere örnekler bir gerek olmasıdır; Bu nedenle, her bir fare analiz için tek bir örneğini temsil eder. Bu hücre hazırlıklarını üreten önemli bir husus analizi için hasat dokuda tutarlılık sürdürmektedir. Çevreleyen kas ve fasya granülasyon dokusu yapışabilir ve dikkatle kaldırarak disseke edilmelidir. Bu yöntem, slaytlar üzerinde tespit öncesinde hücrelerin az işleme içerdiğinden, daha fazla analiz için izole edilmiş hücrelerin çoğunluğu korur. Bu şekilde, onarım bölgesinde yapışma doku oluşturan hücrelerin hemen hemen bütün popülasyon kantitatif immünsitokimya ile değerlendirilebilir. Bu çalışmada, çoğalan hücreler tarafından edu birleşmesi bu sitoloji tekniği uygulamasını göstermek için kullanılır, ancak aynı zamanda daha karmaşık için kullanılan ve derinlemesine karakterizasyonu o olabilirfleksör tendon iyileşmesinde rol heterojen hücre popülasyonlarının f. bu iyileşme tendon granülasyon dokusu ile bağlantılı hücrelerde hücre belirteçlerin ko-lokalizasyonunu belirlemek için izin verdiği bu tekniğin gelecek uygulamalar, tendonun iyileşmesi dahil hücre popülasyonlarının derinliği karakterizasyonu daha neden olabilir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen El Pilot Ödülü ve NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (AEL kadar) ve NIAMS / NIH P30AR061307 Cerrahisi Amerikan Derneği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
