Summary
PI (4,5) P2 régule diverses fonctions cellulaires, mais son organisation à l' échelle nanométrique dans la membrane plasmique de la cellule est mal comprise. Par étiquetage PI (4,5) P 2 avec une sonde fluorescente à double couleur fusionnée au domaine Pleckstrin Homology, nous décrivons une nouvelle approche pour étudier la PI (4,5) P2 distribution spatiale dans la membrane plasmatique à l'échelle du nanomètre .
Introduction
Phosphoinositides contribuent à une petite partie des lipides totaux de la membrane, mais jouent un rôle critique dans une variété de processus cellulaires. Ils comprennent sept membres issus de la phosphorylation réversible ou déphosphorylation des anneaux d'inositol sur le 3 e, 4 e et 5 e positions 1. Phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) et le 4,5-bisphosphate de phosphatidylinositol (PI (4,5) P2) sont deux phosphoinositides principaux qui fonctionnent de façon relativement indépendante les lipides déterminants de la membrane plasmique de la cellule (PM) 2,3. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) est beaucoup moins abondant que PI4P et PI (4,5) P2, mais il a des fonctions uniques à différents processus cellulaires , y compris le cancer et le diabète 4 5. Ces lipides ont des interactions moléculaires complexes avec leurs effecteurs et de nombreuses autres protéines. Par conséquent, il est crucial de comprendre l'organisation spatiale de ces phosphoinositides du PM à l'échelle du nanomètre.
Preuves de montage a montré que des complexes de protéines ou amas de molécules dans les zones de PM confinés peuvent servir de points d' accès 6 signalisation. Par exemple, la syntaxine 1a, une protéine clé qui régule la fusion membranaire 7-9, affiche l' organisation du cluster dans le PM. Distinct du consensus de l'organisation du groupe de syntaxine 1a, la distribution spatiale des phosphoinositides dans la PM est controversée. Motifs PI (4,5) P2 de distribution uniforme vont de 10-12, de grandes plaques 13,14, denses grappes 14-18, en fonction des types de cellules et des méthodes expérimentales utilisées. L'organisation spatiale de PI (4,5) P 2 à plus haute résolution est également incompatible. Une étude utilisant stimulée émission-déplétion (STED) microscopie 19 a révélé un grand nombre de PI dense (4,5) P 2 nano-clusters (~ 73 nm de diamètre) dans les PM feuilles de cellules PC-12 20 21,22, une approche qui préserve la structure PM intacte de cellules vivantes beaucoup mieux que la fixation chimique. Ce dernier a montré piscines distinctes de PI (4,5) P 2; PI relativement concentré (4,5) P 2 en cavéoles et enduits fosses ainsi que la distribution uniforme sur la région plane PM. De plus, PI à l' échelle nanométrique (4,5) P 2 organisation dans les feuilles de membrane peut varier dans des cellules vivantes et fixes. Notre travail récente a examiné cette question à la fois fixes et vivre cellules INS-1 en utilisant la microscopie de localisation seule molécule (SMLM) 23.
SMLM est basé sur la commutation stochastiquement sur un petit sous-ensemble de fluorophores à un moment donné afin que les fluorophores individuels peuvent être localisés avec une précision élevée. De nombreuses approches d'imagerie super-résolution ont été développés en utilisant des principes similaires à dépasser la limite de diffraction de la microscopie optique classique, un telLa microscopie s de photoactivation de localisation (PALM) 24, microscopie à fluorescence photoactivation de localisation (FPALM) 25, stochastique microscopie reconstruction optique (STORM) 26,27 et STORM directe (dSTORM) 28. Avec photo-commutables ou fluorophores photoactivables (colorants ou protéines fluorescentes), les techniques de SMLM permettent aux scientifiques de structures biologiques d'image à résolution nanométrique 24,29,30 avec vidéo-débit dans les cellules vivantes 31,32.
Utilisation de PI (4,5) P 2 à titre d'exemple, nous avons introduit l'approche SMLM pour étudier la distribution à l' échelle nanométrique de phosphoinositides sur le PM. Le domaine de pH de PLCδ1 (phospholipase C δ1) qui se lie spécifiquement à PI (4,5) P2 est une sonde bien établie pour l' imagerie de distribution PI (4,5) P2 sub-cellulaire et de la dynamique 33,34 dans la MP . Nous avons génétiquement marqué ce domaine avec deux protéines fluorescentes, PAmCherry1 35 et 36 IRFP PLCδ1) (Figure 1A-B). PAmCherry1 sert la sonde photoactivable du domaine PH pour PALM et IRFP sert d'indicateur général pour identifier les cellules transfectées avant l' acquisition PALM . Nous appliquons cette sonde fluorescente à double couleur pour l'imagerie SMLM dans les feuilles de membrane fixe. Pour l' imagerie de PALM en direct, nous avons marqués mEOS3 37 au lieu de PAmCherry1 au domaine PH de PLCδ1 pour générer la sonde PLCδ1 mEOS3.1-PH pour son meilleur rendement photonique et de la luminosité (figure 1C-D).
Imagerie SMLM avec ces nouvelles sondes dans le PM de insulinosécrétrices cellules INS-1 38 a permis de découvrir l' étiquetage homogène de PI (4,5) P2 dans la plupart des régions PM ainsi que PI concentré (4,5) P 2 microdomaines qui sont faiblement entremêlées dans le PM plat et certaines structures de filopodes comme 23. Puis unRépartition noscale de PI (4,5) P 2 fournit une base structurelle pour repenser la façon dont il fonctionne dans les cellules vivantes.
Protocol
1. Membrane feuille Préparation et fixation
- Préparer des feuilles de membranes marquées avec IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1
- Préparer l'ADN de plasmide codant pour IRFP-PAmCherry1 PLC-PH δ1 23 en utilisant des techniques standards de biologie moléculaire.
- Culture de cellules INS-1 sur # 1,5 mm de 18 lamelles couvre -objet rondes pré-revêtue de 30 pg / ml de fibronectine à 50-70% de confluence suivant INS-1 protocoles de culture cellulaire standard 38,39. Transfecter les cellules un jour après que 50 à 70% de confluence est atteinte.
- Cellules transfecter avec IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 utilisant liposome réactif de transfection suivant les protocoles du fabricant. Après transfection, permettent aux cellules de croître pendant 48 heures.
- Le jour de l'expérience, des lamelles d'enveloppe (sur un côté) avec environ 0,5 - 1 ml de 500 pg / ml de poly-D-lysine (PDL, dilués dans dH 2 O) pendant 1-2 heures. Puis égouttez PDL en plaçant un mouchoir en papier surle bord de la lamelle. Placez les lamelles sur un (4 ° C) plaque métallique pré-réfrigérée pour une utilisation ultérieure.
- Prélavage transfectées cellules INS-1 en croissance sur des lamelles avec environ 0,5 - 1 ml d'une solution saline glacée tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 mM d'EGTA. Répétez le lavage trois fois et vidanger PBS.
- Placez les lamelles avec des cellules en culture (cellules du côté tourné vers le bas) sur les lamelles PDL revêtues sur une plaque de métal pré-refroidie avec une paire de pinces. Laissez la plaque au réfrigérateur (4 ° C) pendant 7 - 10 min pour permettre aux cellules de se fixer aux lamelles PDL revêtues (figure 2).
NOTE: Le temps d'incubation devrait être dans la plage de 7 - 10 min pour une meilleure fixation des cellules à la surface revêtue PDL. L'environnement du réfrigérateur est sec et l'incubation ne devrait pas être trop long. - Retirer la plaque métallique du réfrigérateur. peler délicatement la lamelle contenant les cellules pré-transfectées à l'aide de pinces. On obtient ainsi une fine couche de feuille de membrane cellulaire sur lalamelle PDL-enduit. Lavez délicatement les feuilles de membrane avec ~ 0,5 à 1 ml PBS glacé, puis fixer avec ~ 0,5 à 1 ml glacé paraformaldéhyde 4% (PFA) + 0,2% de glutaraldéhyde (GA) dans du PBS pendant 15 min à 4 ° C.
Attention: paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde sont toxiques. Manipulez-les dans une hotte avec la peau et une protection oculaire. - Après fixation, l'image des feuilles de membrane immédiatement (voir la section 3) ou stocker dans ~ 0,5 à 1 ml de PBS à 4 ° C.
NOTE: Après la fixation de la feuille de membrane, il n'y aura pas de liaison de sondes PH du cytosol à PI (4,5) P 2 équilibre. Les sondes de pH liés seront progressivement désolidariser de la feuille de membrane et de diffuser dans la solution (même si elle peut prendre des jours à quelques semaines). Par conséquent, il est recommandé à l'image des échantillons fixes juste après la préparation des échantillons.
- Préparer des feuilles de membrane pour PI (4,5) P 2 de marquage d'anticorps spécifiques
- Culture cellules INS-1 sur # 1.5, 18 mm Lamelles rondes pré-revêtues avec 30 &# 181; g / ml de fibronectine à 50% -70% de confluence. cellules transfecter avec de l'ADN plasmidique, le lendemain, comme décrit à l'étape 1.1.3.
- Répétez les étapes de 1.1.4 à 1.1.7, comme décrit ci-dessus.
REMARQUE: Effectuez les procédures suivantes à 4 ° C. - On lave les lamelles couvre -objet contenant des feuilles de particules fixées à trois reprises avec ~ 0,5 à 1 ml de PBS glacé contenant 50 mM de NH4CI. Étancher les feuilles avec environ 0,5 - borohydrure de sodium , 1 ml de 0,1% dans du PBS pendant 7 minutes, et on lave avec environ 0,5 - 1 ml de PBS (sans 50 mM de NH 4 Cl).
- Bloquer les échantillons à ~ 0,5 - 1 ml de solution de blocage (solution PBS contenant 5% (v / v) de sérum normal de chèvre à 5% (v / v) de sérum - albumine bovine et 50 mM de NH 4 Cl) pendant 45 min. Ensuite, laisser incuber avec 0,5 ~ - 1 ml primaire PI (4,5) P2 anticorps (dilution 1: 300) dans une solution de blocage pendant 1 h. Laver trois fois (10 min à chaque fois) avec ~ 0,5 - 1 ml de PBS contenant 50 mM NH 4 Cl.
- Incuber les échantillons à environ 0,5 - 1 ml secondaire F (ab ') 2 de chèvre anti-sourisanticorps conjugué avec des fluorophores (1: 300) dans un tampon de blocage pendant 1 h. Laver trois fois avec ~ 0,5 à 1 ml de PBS.
- échantillons post-fixage avec PFA 4% + 0,2% GA pendant 15 min, puis laver les échantillons à trois reprises avec du PBS (7 min à chaque fois). Passez à la section 3 pour l'imagerie ou stocker dans ~ 0,5 ~ 1 ml de PBS à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
NOTE: Préparer les échantillons à 4 ° C. Utilisez 4% PFA + 0,2% GA fixatif pour préserver la répartition physiologique des phosphoinositides dans le PM. RT préparation ou fixation avec 4% PFA seul peut provoquer des artefacts significatifs (figure 4).
2. Culture cellulaire Préparation pour l' imagerie des cellules vivantes avec mEOS3.1-PH PLC δ1
- Préparer le plasmide d'ADN codant pour la δ1 mEOS3.1 PLC-PH 23 , comme décrit précédemment.
- Culture cellules INS-1 sur # 1.5 18 mm rond lamelles de pré-enduit avec 30 pg / ml de fibronectine jusqu'à ce qu'ils atteignent 50% -70% confluency suivant INS-1 protocoles de culture cellulaire standard 38,39.
- Le lendemain, transfecter des cellules INS-1 avec le PLC-PH mEOS3.1 δ1 ADN plasmidique en utilisant le réactif de transfection de liposomes suivant le protocole du fabricant. Incuber pendant 48 heures avant l'imagerie.
3. PALM Image Acquisition des feuilles de membrane et des cellules vivantes
- PALM acquisition d'images de feuilles de membrane
NOTE: Ici, une fluorescence de réflexion interne (FRBR) totale du système de microscope à base de SMLM (huile 100X, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 est utilisé pour toutes les acquisitions d'image.- Avant imagerie, diluer 1 pl de solution fluorescente perle dans 10 ml de PBS + 50 mM MgCl 2. Ajouter 200 pi de solution diluée dans les échantillons de cellules chambre d'imagerie comportant des étapes (1.1.8 / 1.2.6) pendant 10 min. Ensuite, lavez avec du PBS trois fois.
- Démarrez le système d'imagerie PALM. Dans le logiciel d'imagerie associée, sélectionnez le "canal IRFP &# 34; bouton (642 excitation laser nm, 700/75 nm émission). Trouver la membrane cellulaire exprimant des sondes de pH dans le canal IRFP.
NOTE: La feuille de membrane doit avoir une bille fluorescente à proximité. Ceci est nécessaire pour la correction de dérive plus tard. - Utilisez le bouton "Capture" pour recueillir une image de la FRBR conventionnelle de la membrane cellulaire dans le canal IRFP comme une référence pour la future reconstruction d'image. Définissez un angle de la FRBR normale (ie, après avoir atteint l'angle critique, tourner encore 1,5 degrés) en tapant 2140 à l'angle FRBR réglage pour l' imagerie. Utilisez ce paramètre pour toutes les étapes, sauf indication contraire angle.
NOTE: Dans le système de la FRBR décrit ici, 3500 est l'angle vertical up, 2200 est l'angle critique FRBR, et 2140 est l'angle de la FRBR normale, qui est de 1,5 degré plus après FRBR angle critique. L'angle de la FRBR étroite mentionnée ci-dessous au paragraphe 3.2.3 est 2120, qui est un autre 2 degrés après avoir atteint FRBR angle critique. - Basculer vers le canal PAmCherry1 en cliquant thbouton de canal de RFP e (561 nm excitation, 600/50 nm filtre d'émission). Réglez la barre de défilement dans le bloc "AOTF" tout le chemin vers le droit d'avoir un éclairage à pleine puissance du laser 561 nm pour 10-20 sec pour blanchir la fluorescence de la membrane de fond.
- Définissez le réglage optimal de la caméra (2x2 binning) dans l'onglet "Format" et le protocole d'acquisition rapide dans l'onglet "d'acquisition de séquence ND" (typiquement 10,000-40,000 images à 20 Hz).
- Lancer l'acquisition d'images PAmCherry1 (561 de laser nm à pleine puissance, 50 msec / frame) avec activation simultanée de laser de 405 nm à un faible niveau (0,1% - 1%) en cliquant sur le bouton "Exécuter maintenant". Ajuster l'intensité de 405 nm laser, de sorte que les points individuels spatialement isolés dans chaque trame sont facilement identifiables.
NOTE: Le nombre de molécules de PAmCherry1 activables diminue progressivement lors de l'acquisition. 405 intensité du laser nm doit être augmentée progressivement pour maintenir la densité optimale des signaux individuels de molécules dans chaqueCadre. - Continuer l'acquisition d'images jusqu'à ce qu'aucun signal PAmCherry1 seule molécule est activée.
- PALM imagerie dans les cellules vivantes
- Avant l'imagerie, on dilue des billes fluorescentes dans la chambre d'imagerie pendant 10 minutes comme décrit dans l'étape 3.1.1. Puis commencez imagerie PALM en ouvrant le logiciel d'imagerie associée.
NOTE: Utiliser une chambre d'imagerie à dégagement rapide magnétique pour imagerie des cellules vivantes. Maintenir le centre du champ de formation d'image à 35 ° C avec un régulateur de température sous perfusion constante avec le tampon extracellulaire (Extracellulaire Solution: NaCl 135 mM , KCl 5,6, 2,6 mM de CaCl2, 1,2 mM MgCl 2 mM de glucose 3, et 20 mM HEPES; pH = 7,3). - Cliquez sur le bouton de canal de GFP (525/50 nm d'émission). Identifier la membrane cellulaire exprimant des sondes fluorescentes sur la base de la fluorescence verte mEOS3 sous excitation à 488 nm du laser. Assurez-vous que des billes fluorescentes à proximité sont également inclus lors de l'imagerie, car cela est nécessaire plus tard pour déconnecté dricorrection ft.
- Cliquez sur le bouton "Capture" pour recueillir une image de la FRBR de la membrane cellulaire dans mEOS3 (vert) canal comme une image de référence. Utilisez un évanescente illumination d'excitation d'onde peu profonde (après avoir atteint l'angle critique, tourner encore 2 degrés) en tapant 2120 à l'angle de la FRBR mise pour l'imagerie des cellules vivantes.
REMARQUE: Ceci minimise la fluorescence du mEos3-PH non lié dans le cytosol adjacent à la membrane plasmique. - Basculer vers le "canal de RFP" bouton (561 nm excitation, 600/50 nm émission). Utilisez la pleine puissance 561 nm laser pour blanchir la fluorescence de fond des feuilles de membrane pour 10 ~ 20 sec avec la barre de défilement dans le "pad AOTF" (voir 3.1.4).
- Lancer l'acquisition de l'image en cliquant sur le bouton "Exécuter maintenant" dans le canal rouge (561 nm pleine puissance, fixé à 10 msec / cadre dans la "caméra" mise tab) avec simultanée activation laser de 405 nm. Réglez l'intensité du laser de 405 nm pour activer des points séparés dans l'espacedans chaque trame.
NOTE: Comme produit d'acquisition, non converti mEOS3.1-PH PLC δ1 nombre de molécules diminue lentement. Augmenter progressivement la puissance du laser de 405 nm pour optimiser le signal de la molécule unique. La durée d'acquisition des images dépend du but expérimental. Acquérir des images en continu pendant 5 min dans des conditions normales. Si une acquisition plus longue est nécessaire, recueillir plusieurs piles au lieu d'une seule grande pile d'images image. La taille du fichier de chaque pile d'image ne doit pas dépasser 4 Go ou il aura une incidence sur l'analyse du logiciel plus tard.
- Avant l'imagerie, on dilue des billes fluorescentes dans la chambre d'imagerie pendant 10 minutes comme décrit dans l'étape 3.1.1. Puis commencez imagerie PALM en ouvrant le logiciel d'imagerie associée.
4. SMLM Transformation et reconstruction image
- Transférez les fichiers d'image (.tif des piles d'images) à une station d'analyse d'image. Lancez le programme de reconstruction d'image ( sur mesure écrite) dans Matlab comme décrit précédemment 37 et charger la pile de l' image en cliquant sur l'onglet "Fichier" dans le menu principal, puis "ouvrir", puis "nouveau fichier".
- Identifier et locaLize événements moléculaires individuels de chaque trame. Régler le filtrage seuil d'intensité avec un nombre seuil (1-10) dans le "ondelettes". Vérifiez les réglages des paramètres optimaux pour la détection des points visuellement avant la reconstruction. Ensuite, allez à l'onglet "PALM" et cliquez sur "un processus d'étape" pour commencer la reconstruction de l'image.
NOTE: Seuil d'intensité pour la détection de point est arbitraire et dépend de l'expérience personnelle. Plusieurs essais peuvent être nécessaires pour générer un seuil de détection optimale qui ne ramasse trop de non qualifiés (dim) des points, ni les filtres trop nombreux points (brillants) qualifiés. Ajuster d'autres paramètres afin d'optimiser l'analyse des données. Ici, la distance de voisinage (points de fluorescence dans les trames voisines sont situées à une distance combinées) est définie comme 65 nm (1/2 de la largeur de pixel) et monté en une seule molécule. cadres de Gap (événements individuels de molécules qui se sont produits au sein de ces cadres et de voisinage la distance ont été combinés et équipé comme un événement de la molécule unique) estdéfinie comme 26 images (1.3 sec) pour l' imagerie PAmCherry1 40. Réglez ces paramètres en fonction des propriétés de sondes moléculaires simples et taux d'acquisition pour éviter de trop compter 40 en SMLM. Appliquer la correction de dérive avec des perles fluorescentes pendant les reconstructions.- Pour l' imagerie des feuilles de membrane fixe marqués par IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, reconstruire l'ensemble des piles d'images de la même feuille de membrane en une seule image de super-résolution 37.
- Pour les échantillons de cellules vivantes marquées par mEOS3.1-PH PLC δ1, séparer l'ensemble de la pile d'image en plusieurs petites piles de 1.000 images de telle sorte que la pile de 1000 consécutive trame est reconstruite comme une image de super-résolution unique, qui a une résolution temporelle de 10 sec. En fin de compte , combiner toutes les images de la série de temps dans la dernière fois la pile de la série 23.
NOTE: Dans PALM imagerie en temps réel des cellules, un petit nombre de sondes activées peut déplacer ou dissocierde PI (4,5) P 2 dans la PM avant le blanchiment. Pour tenir compte du suréchantillonnage des sondes, combiner les signaux de molécules individuelles dans les trames voisines à moins de 130 nm (au lieu de 65 nm) en un événement unique d'émission lors de l'analyse d'image.
- Après avoir obtenu les images reconstruites, effectuer une analyse plus approfondie de l' image avec le programme écrit sur mesure en Matlab pour quantifier la densité molécule, la densité micro-domaine / taille, et l' analyse de cluster avec une paire de corrélation 41.
Representative Results
L'incertitude de localisation (σ) de notre système de super-résolution est 14,73 nm 23. Les comparaisons directes entre FRBR et images PALM ont démontré une amélioration significative de la résolution spatiale. Figure 3A-B montre la PI représentant (4,5) P 2 images TIRF marqués avec PI (4,5) P 2 anticorps et IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 en feuilles de membrane typiques et des cellules vivantes. Les images en microscopie TIRF classique dans les feuilles de membrane sont remarquablement semblables à celles dans des cellules vivantes intactes marquées avec la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) marqués domaines PH (EGFP-PH PLCδ1) (figure 3C). Tous les échantillons ont montré une répartition uniforme des sondes. En revanche, la fixation non-optimale des échantillons a donné lieu à PI dense forte (4,5) P 2 clusters et une diminution de l'intensité du signal (figure 4). Dans des conditions optimales de fixation, til a des images de super-résolution de PI (4,5) P2 dans des cellules fixées (figure 5) a révélé une répartition homogène de sondes dans une partie importante de la PM , avec seulement des gradients de concentration limitée. Quelques plaques de membranes enrichies en PI (4,5) P 2 sondes ont été clairsemées et avait différentes tailles. Cellules vivantes images PALM affichent une distribution spatiale similaire à celle des cellules fixées (Figure 6). Une analyse détaillée de PI (4,5) P 2 signaux sur les résultats en temps en dynamique rapide dans les zones locales, sans modifications importantes de leur abondance dans les zones larges.
Figure 1. Schéma de sondes fluorescentes utilisées dans cette étude. La sonde de (AB) IRFP-PAmCherry1-PH PLC utilisé dans les expériences de la feuille de membrane fixe. Lors de l' imagerie TIRF classique (A), un 640 nm laser est utilisé pour exciter le IRFP (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). L' image FRBR pris dans cet état sert une image de référence de la FRBR pour l'imagerie super-résolution obtenue par imagerie de PALM (B). Un laser à 405 nm est utilisée pour la photo-activer le fluorophore PAmCherry1 et un laser 561 nm est utilisée pour exciter PAmCherry1 (ex: 564 nm; Em: 595 nm) pour l'imagerie de palme. (DR) de la sonde de PLCδ1 mEos3.1-PH utilisé dans les expériences sur les cellules vivantes. (C) Pendant l' imagerie TIRF classique, un laser 488 nm est utilisée pour exciter mEOS3.1 (ex: 506 nm; Em: 519 nm). (D) Après photoconversion par un laser de 405 nm, mEos3.1 se transforme en la forme rouge (Ex: 573 nm; Em: 584 nm). Et un laser 561 nm est utilisée pour les acquisitions PALM S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.
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Figure 2. Schéma pour la préparation de cellules INS-1 feuille de membrane. (A) Placer la lamelle avec des cellules cultivées faisant face vers le bas sur une lamelle PDL-enduit et attendre 7 ~ 10 min à 4 ° C pour permettre la fixation des cellules à l'PDL- lamelle couvre-objet revêtu. (B) Retirez la lamelle supérieure avec des pincettes et fixer la feuille de membrane attachée à la lamelle pré-enduit PDL. (C) l' image des échantillons avec TIRFM et PALM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 PI (4,5) P2 organisation spatiale est similaire entre les feuilles de membrane et des cellules vivantes intactes au microscope TIRF conventionnel. (A)image typique TIRF des feuilles de membrane fixé à 4 ° C avec 4% de PFA et de 0,2% GA. PI (4,5) P2 a été marqué avec PI (4,5) P2 anticorps spécifique. (B) Une feuille de membrane de la cellule INS-1 exprimant IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. L' image (C) FRBR de deux cellules vivantes intactes exprimant EGFP-PH PLCδ1 à différents niveaux. Barres d'échelle: (A): 3 um; (B) et (C):. 5 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. PI (4,5) P2 organisation spatiale dans les feuilles de membrane est sensible aux conditions de fixation communes. (A) des feuilles de membranes fixées à 37 ° C avec 4% PFA seulet marquées avec un anticorps spécifique 2 PI (4,5) P (comme sur la figure 3A). Feuille (B) à membrane fixé à température ambiante avec le PFA seul et marqué avec PI (4,5) P2 anticorps spécifique. On notera que les amas denses de PI (4,5) P2 sondes sont clairement visibles au microscope TIRF, contrairement aux images encore beaucoup plus fluorescence représentés sur la figure 3A. Barres d'échelle: AB:. 3 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. PALM imagerie de PI (4,5) P 2 sondes révèle leur distribution à l'échelle nanométrique dans un PM INS-1 cellule. (A) l' image IRFP FRBR d'une feuille de membrane d'une cellule INS-1 exprimant IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) image PALM du PM correspondant dans la même région sur la base de la reconstruction du signal PAmCherry1. Notez la PI homogène (4,5) P 2 distribution spatiale dans les principales régions de PM et plusieurs PI (4,5) P 2 microdomaines. (C) une vue agrandie de la région encadrée en (B). Les flèches indiquent peu distribués PM microdomaines enrichis en PI (4,5) P 2 sondes. Barres d'échelle: A et B: 3 pm; C: 500 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. PALM imagerie en direct des cellules INS-1. (A) image FRBR de PI (4,5) P2 dans un live INS-1 cellule exprimant mEos3.1-PH PLCδ1. L'image a été rapidement acquis dans le canal vert avant acquisition PALM (35 ° C). (B) séquentiels cellules vivantes PALM images à intervalle de 10 secondes. Insets montrent les profils d'intensité de la PI locale (4,5) P 2 densité le long de la même ligne droite 1 position à des moments différents dans (B) et (C). Notez leurs grandes variations d'intensité locales dans 10 sec. (D) du cours Le temps des changements d'intensité moyenne de PI (4,5) P 2 dans la grande surface (box2, 3x3 pm) et de petits cercles (3, 4, et 5, diamètre de 500 nm) dans (B) pendant 5 min de l'imagerie PALM (cadre / 10 sec). Notez les fluctuations d'intensité rapides de PI local (4,5) P 2 sondes (cercle 3, 4 et 5) par rapport à de très petits changements dans la zone large (encadré 2). Images (E) élargi PALM de la région de box2 dans (B) à des moments indiqués. Les flèches indiquent PI (4,5) P 2 plaques de membranes enrichies sous pconditions hysiological. Barres d'échelle: C: 3 pm; E: 500 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Pour le dépannage, deux processus nécessitent une attention particulière: la production de la feuille membrane et fixation échantillon. Comme décrit dans le protocole, le temps d'incubation des lamelles à l'étape 1.1.6 est importante pour la production de feuille de membrane. Temps d'incubation optimale sous notre condition expérimentale est 7-10 min (Figure 2). Plus de 10 minutes d'incubation va produire des cellules intactes au lieu des feuilles de membrane sur des lamelles PDL et incubation plus courte conduira à moins ou aucune feuille de membrane sur les lamelles PDL revêtues. Comme décrit dans le protocole, les fixatifs et la température au cours de la fixation sont essentielles pour le maintien de la PI (4,5) P2 distribution dans le PM. Fixation à la température ambiante ou l'utilisation de 4% -PFA seule pourrait fausser la répartition des lipides normale dans le PM.
En appliquant la microscopie PALM à la membrane recherche lipidique, nous sommes en mesure d'observer la distribution à l'échelle nanométrique de PI (4,5) P 2, une phosphoinositide clé qui médie mtoutes les activités cellulaires fondamentales. Cette répartition spatiale de la PI (4,5) P 2 avec des gradients de concentration limitées cellules INS-1 fournit un cadre pour repenser les interactions lipide-protéine et des événements de signalisation locaux de PI (4,5) P 2 dans ces cellules. En outre, les méthodes développées dans ce travail peuvent également être appliquées à d'autres recherches de phospholipides de la membrane avec des sondes appropriées, ce qui, en offrant de nouveaux outils pour étudier phosphoinositides dans les processus biologiques.
L'utilisation de feuilles de membrane dans ce travail contourne deux préoccupations majeures dans les études morphologiques phospholipides: traitement de détergent et de contamination potentielle du signal du cytosol. Détergents provoquent souvent le regroupement et une perte significative de signal de phospholipides PM. La contamination des signaux cytosolique est particulièrement problématique dans le cas de phosphoinositides de faible abondance sur le PM 23, tels que PI (3,4,5) P 3 et PI (3,4) P2. Des échantillons de feuille de membrane sont capables de circumvent ces problèmes sans perturber de manière significative des structures associées à la membrane plasmique, tels que le maillage d'actine corticale et des puits recouverts de clathrine 42,43. La répartition homogène relative de PI (4,5) P2 dans le PM est en bon accord avec d' autres études congélation EM rapides utilisant des sondes δ1 GST-PH PLC dans la membrane de fibroblaste 44.
Il est important de noter que des conditions inadéquates de traitement des échantillons peuvent générer des résultats trompeurs. Tout d'abord, il est essentiel d'effectuer les étapes de fixation à une température inférieure (4 ° C) et utiliser le fixateur GA pour la production de feuille de membrane. Comme le montre la figure 3, la température chaude et PFA fixation sans GA ne suffit pas de fixer phosphoinositides dans la cellule PM. Cela pourrait fausser le PI intact (4,5) P 2 distribution et générer des grappes pointues qui ne sont pas observés dans les cellules vivantes dans des conditions physiologiques. En second lieu, l'utilisation de PAmCherry1 quela sonde SMLM, plutôt que d'autres sondes, est essentiel pour l'imagerie quantitative de PALM. Le bénéfice de l' application PAmCherry1 provient de ses propriétés bien caractérisées simples moléculaires photo-physique 35,40,45, tels que la luminosité, l' efficacité photo-activation élevée et surtout, très limité photo clignotant. Ces propriétés permettent d'éliminer les artefacts de cluster potentiels de photo-clignoter et quantitativement analyser la densité moléculaire de PI de la membrane (4,5) P 2.
Cette approche a aussi ses limites. Tout d' abord, la méthode de la feuille de membrane utilisée dans cette étude ne peut pas reproduire entièrement la distribution physiologique de PI (4,5) P2 parce que la cellule est interrompue avant l' imagerie. Cependant, notre imagerie en temps réel PALM montre similaire répartition relativement homogène de PI (4,5) P2, supportant les résultats observés sur des échantillons de feuille de membrane. Deuxièmement, comme nous avons discuté dans nos travaux précédents 23, SMLM nécessite une expertise d'imagerie et supplémentaire àtention pour éviter des artefacts d'imagerie qui pourraient résulter de différents processus, y compris les sondes utilisées, la préparation des échantillons et de fixation, l'image d'échantillonnage et de reconstruction. Enfin, bien que des sondes et des anticorps en fonction du domaine de PH de ont été largement utilisés dans les études de phosphoinositide 46,47 il est possible que pas tous PI (4,5) P2 dans la membrane peut être détectée par cette méthode. Par exemple, PI (4,5) P 2 lié par d' autres protéines endogènes peuvent ne pas être accessibles aux sondes de pH ou des anticorps, et cela peut entraîner une sous - estimation de la PI (4,5) P 2 en raison de l'encombrement de l' espace de se sonder. Un autre moyen de marquage PI (4,5) P2 utiliserait les plus Fluor PI (4,5) P2 48, PI préétiqueté (4,5) P2 analogique avec une modification sur la queue d'origine PI (4,5) P2. Cependant, il peut être converti rapidement dans d'autres sous-types de phosphoinositide par le métabolisme des cellules vivantes rapide depuis son cycle inositol est le même que endogenous PI (4,5) P2. Cela soulève le problème de savoir si cette PI pré-étiquetés (4,5) P 2 analogiques dans des cellules vivantes peut représenter fidèlement PI (4,5) P 2 plutôt que de ses produits métaboliques. Par conséquent, en dépit de certaines limitations, des sondes à base de domaine de PH sont toujours parmi les meilleures sondes qui ont été largement utilisés pour surveiller PI (4,5) P2 distribution et la dynamique de la PM des cellules.
L'application future de cette méthode peut être étendue à d' autres études de phosphoinositide, comme PI (3,4,5) P 3 et PI (3,4) P2. En résumé, l'approche SMLM roman utilisée ici ouvre de nouvelles voies pour étudier phosphoinositide dans les cellules. Utilisation de PI (4,5) P2 , par exemple, nous démontrons les propriétés uniques de l' imagerie palme dans l'étude morphologique et quantitative des molécules de la membrane cellulaire, ainsi que ses inconvénients. Cette approche peut être adaptée à d'autres molécules d'intérêt, et aura de larges applications en biologie cellulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-U | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
| High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405 nm: 15 mW & 13 mW; 488 nm: 45 mW & 42 mW; 561 nm: 45 mW & 40 mW; 640 nm: 35 mW & 16 mW. |
| 100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12 mm | |
| Nikon acquisition and analysis software (NIS Element) | Nikon | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18 mm coverslip, #1.5 |
| Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
| Lipofectamin 3000 (transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
| PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
| secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
| Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
| magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
| temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
| EGTA | Sigma | 3780 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| CaCl2•2H2O | Sigma | 223506 | |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M9272 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |
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