Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Single-molekyle Super-resolution Imaging af Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Published: October 15, 2016 doi: 10.3791/54466
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison

Summary

PI (4,5) P2 regulerer forskellige cellulære funktioner, men dens nanoskala organisation i cellen plasmamembranen er dårligt forstået. Ved mærkning PI (4,5) P2 med en tofarvet fluorescerende probe fusioneret til pleckstrin homologidomænet beskriver vi en ny tilgang til at studere PI (4,5) P2 rumlige fordeling i plasmamembranen på nanometerskala .

Introduction

Phosphoinositider bidrager til en lille del af de samlede membranlipider, men spiller kritiske roller i en række forskellige cellulære processer. De omfatter syv medlemmer afledt af reversibel phosphorylering eller dephosphorylering af inositol ringe på 3., 4. og 5. position 1. Phosphatidylinositol 4-phosphat (PI4P) og phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P2) er to vigtige phosphoinositider der fungerer relativt uafhængigt som de afgørende lipider af cellens plasmamembran (PM) 2,3. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) er meget mindre forekommende end PI4P og PI (4,5) P2, men det har unikke funktioner i forskellige cellulære processer, herunder cancer 4 og diabetes 5. Disse lipider har komplekse molekylære interaktioner med deres effektorer og mange andre proteiner. Derfor er det afgørende at forstå den rumlige organisering af disse phosphoinositides i PM på nanometer skala.

Montering beviser har vist, at protein komplekser eller molekyle klynger i de snævre PM områder kan fungere som signalering hotspots 6. For eksempel, syntaxin 1a, en nøgle protein, der regulerer membran fusion 7-9, viser klynge organisation i PM. Adskiller sig fra konsensus visning af klyngen organisation syntaxin 1a, den rumlige fordeling af phosphoinositider i PM er kontroversiel. PI (4,5) P2 distributionsmønstre spænder fra uniform 10-12, store pletter 13,14, til tætte klynger 14-18, afhængig af celletyper og eksperimentelle metoder. Den rumlige organisering af PI (4,5) P2 ved højere opløsning er også inkonsekvent. En undersøgelse ved hjælp stimuleret emission-depletion (STED) mikroskopi 19 har afsløret en lang række tætte PI (4,5) P 2 nano-klynger (~ 73 nm i diameter) i PM plader af PC-12 celler 20 21,22, en tilgang, der bevarer den intakte PM struktur af levende celler meget bedre end kemisk fiksering. Sidstnævnte viste særskilte puljer af PI (4,5) P2; forholdsvis koncentreret PI (4,5) P2 i caveolae og coatede gruber samt ensartet fordeling på den flade PM-regionen. Desuden kan nanoskala PI (4,5) P2 organisation i membranplader forskellige i levende og fikserede celler. Vores seneste arbejde undersøgte dette spørgsmål i både faste og lever INS-1 celler ved hjælp af single-molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM) 23.

SMLM er baseret på stokastisk tændes kun en lille delmængde af fluoroforer på ethvert givet tidspunkt, således at individuelle fluoroforer kan lokaliseres med høj præcision. Der er udviklet mange super opløsning billedteknik anvendelse af lignende principper at overgå diffraktionsgrænsen af ​​konventionel lysmikroskopi, sådans fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 24, fluorescens fotoaktivering lokalisering mikroskopi (FPALM) 25, stokastisk optisk genopbygning mikroskopi (STORM) 26,27 og direkte STORM (dSTORM) 28. Med foto-omskiftelig eller fotoaktiverbare fluoroforer (farvestoffer eller fluorescerende proteiner), SMLM teknikker gør det muligt forskere til billedet biologiske strukturer på nanometer opløsning 24,29,30 med video-rate i levende celler 31,32.

Brug PI (4,5) P2 som et eksempel, vi introducerede SMLM tilgang til at studere nanoskala fordeling af phosphoinositider på PM. PH-domænet af PLCδ1 (phospholipase C δ1), der specifikt binder til PI (4,5) P2 er en veletableret probe til billeddannelse PI (4,5) P2 sub-cellulære fordeling og dynamik 33,34 i PM . Vi har genetisk mærkede dette domæne med to fluorescerende proteiner, PAmCherry1 35 og IRFP 36 PLCδ1) (figur 1A-B). PAmCherry1 fungerer som fotoaktiverbare sonde af PH domæne til PALM og IRFP tjener som en generel indikator for at identificere transficerede celler før PALM erhvervelse . Vi anvender denne tofarvet fluorescerende probe til SMLM billeddannelse i de faste membran ark. For levende PALM billeddannelse, vi mærkede mEOS3 37 i stedet for PAmCherry1 til PH PLCδ1 domæne til at generere mEOS3.1-PH PLCδ1 probe for dens bedre foton effektivitet og lysstyrke (figur 1C-D).

SMLM billeddannelse med disse hidtil ukendte prober i PM til insulinproducerende INS-1-celler 38 har afdækket homogen mærkning af PI (4,5) P2 i størstedelen af PM regioner samt koncentreret PI (4,5) P2 mikrodomæner der er tyndt sammenblandet i den flade PM og nogle filopodia-lignende strukturer 23. Den nanoscale fordeling af PI (4,5) P2 tilvejebringer en strukturel basis for genopfinder hvordan den fungerer i levende celler.

Protocol

1. Membrane Sheet Forberedelse og Fiksering

  1. Forbered membran plader mærket med IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1
    1. Forbered DNA plasmid, der koder IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 ved hjælp af standard molekylærbiologiske teknikker.
    2. Kultur INS-1-celler på # 1.5 18 mm runde dækglas præ-coatet med 30 ug / ml fibronectin til 50-70% sammenflydning følge standard INS-1-cellekultur protokoller 38,39. Transficere cellerne en dag efter 50 til 70% konfluens er nået.
    3. Transficere celler med IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 hjælp liposom transfektionsreagens ifølge producentens protokoller. Efter transfektion lade cellerne vokse i 48 timer.
    4. På dagen for eksperimentet coat dækglas (på en side) med -0,5 - 1 ml af 500 ug / ml Poly-D-Lysin (PDL; fortyndet i dH 2 O) i 1-2 timer. Så dræne PDL ved at placere et filtrerpapir påkanten af ​​dækglasset. Placer dækglas på en forud afkølet (4 ° C) metalplade til senere brug.
    5. Vask præ-transficerede INS-1-celler, der vokser på dækglas med -0,5 - 1 ml iskold phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1 mM EGTA. Gentag vask tre gange og afløb PBS.
    6. Placer dækglas med dyrkede celler (celle-side nedad) på PDL-belagte dækglas på en pre-kølet metalplade med en pincet. Efterlad pladen i køleskab (4 ° C) i 7 - 10 minutter for at tillade celler at vedhæfte til PDL-overtrukne dækglas (figur 2).
      BEMÆRK: Inkubationstiden bør være i området fra 7 - 10 min til bedre fastgørelse af cellerne til PDL-coatede overflade. Køleskabet miljø er tør og inkubation bør ikke være for lang.
    7. Fjern metalpladen fra køleskabet. Forsigtigt skrælle dækglasset indeholdende de forud transficerede celler under anvendelse af pincet. Dette frembringer et tyndt lag af cellemembranen ark påPDL-overtrukne dækglas. Forsigtigt vaske membranbanerne med -0,5 - 1 mL iskold PBS og derefter fastgøres med -0,5 - 1 ml iskold 4% paraformaldehyd (PFA) + 0,2% glutaraldehyd (GA) i PBS i 15 minutter ved 4 ° C.
      Forsigtig: Paraformaldehyd og glutaraldehyd er giftige. Håndter dem i et stinkskab med hud og øjenbeskyttelse.
    8. Efter fiksering, billede membranbanerne straks (se afsnit 3) eller opbevare i ~ 0,5-1 ml PBS ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Efter fastsættelse af membranen ark, vil der ikke være nogen ligevægt binding af PH sonder fra cytosol til PI (4,5) P2. De bundne pH-sonder vil gradvist dissociere fra membranen ark og diffunderer ind i opløsningen (selvom det kan tage dage til uger). Derfor anbefales det at billedet de faste prøver lige efter fremstilling prøve.
  2. Forbered membranplader for PI (4,5) P2-specifikt antistof mærkning
    1. Kultur INS-1-celler på # 1.5, 18 mm runde dækglas præ-overtrukket med 30 &# 181; g / ml fibronectin til 50% -70% konfluens. Transficere celler med DNA-plasmid næste dag som beskrevet i trin 1.1.3.
    2. Gentag trin fra 1.1.4 til 1.1.7 som beskrevet ovenfor.
      BEMÆRK: Udfør følgende procedurer ved 4 ° C.
    3. Vask dækglassene indeholdende faste PM ark tre gange med -0,5 - 1 mL iskold PBS indeholdende 50 mM NH4CI. Quench arkene med -0,5 - 1 ml 0,1% natriumborhydrid i PBS i 7 min, og vaskes med -0,5 - 1 mL PBS (uden 50 mM NH4CI).
    4. Blokere prøverne med ~ 0,5 - 1 ml blokerende opløsning (PBS-opløsning indeholdende 5% (v / v) normalt gedeserum, 5% (v / v) bovint serumalbumin og 50 mM NH4CI) i 45 minutter. Derefter inkuberes med ~ 0,5 - 1 ml primære PI (4,5) P2-antistof (1: 300 fortynding) i blokeringsopløsning i 1 time. Vask tre gange (10 min hver gang) med ~ 0,5 - 1 ml PBS indeholdende 50 mM NH4Cl.
    5. Inkuber prøver med ~ 0,5 - 1 ml sekundær F (ab ') 2-gede-anti-museantistof konjugeret med fluoroforer (1: 300) i blokerende buffer i 1 time. Der vaskes tre gange med ~ 0,5-1 ml PBS.
    6. Post-fix prøver med 4% PFA + 0,2% GA i 15 minutter, derefter vaske prøverne tre gange med PBS (7 min hver gang). Fortsæt til afsnit 3 for billedbehandling eller opbevares i ~ 0,5 ~ 1 ml PBS ved 4 ° C til senere brug.
      BEMÆRK: Forbered prøver ved 4 ° C. Brug 4% PFA + 0,2% GA fixativ for at bevare den fysiologiske fordeling af phosphoinositider i PM. RT forberedelse eller fiksering med 4% PFA alene kan forårsage betydelige artefakter (Figur 4).

2. Cell Culture Forberedelse til Live-celle Imaging med mEOS3.1-PH PLC δ1

  1. Forbered DNA-plasmid koder for mEOS3.1-PH PLC δ1 som tidligere 23 beskrevet.
  2. Kultur INS-1-celler på # 1.5 18 mm runde dækglas præ-coatet med 30 ug / ml fibronectin, indtil de når 50% -70% confluency følge standard INS-1 cellekultur protokoller 38,39.
  3. Den følgende dag, transficere INS-1-celler med mEOS3.1-PH PLC δ1 DNA-plasmid under anvendelse af liposom transfektionsreagens efter producentens protokol. Der inkuberes i 48 timer før billeddannelse.

3. PALM Billede Erhvervelse af Membrane Plader og levende celler

  1. PALM erhvervelse af membran plader billede
    BEMÆRK: Her en samlet indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroskop baseret SMLM systemet (100X olie, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 anvendes til alle billedoptagelse.
    1. Før billeddannelse, fortyndes 1 ml af fluorescerende vulst opløsning i 10 ml PBS + 50 mM MgCl2. Tilsæt 200 pi fortyndet løsning i imaging kammer indeholdende celleprøver (fra trin 1.1.8 / 1.2.6) i 10 min. Derefter vaskes med PBS tre gange.
    2. Start PALM imaging system. I den tilhørende imaging software, skal du vælge "IRFP kanalen &# 34; knap (642 nm laser excitation, 700/75 nm emission). Find cellemembranen udtrykker pH-sonder i IRFP kanal.
      BEMÆRK: Membranen ark skal have en fluorescerende perle i nærheden. Dette er nødvendigt for drift korrektion senere.
    3. Brug knappen "Capture" at indsamle en konventionel TIRF billede af cellemembranen i IRFP kanal som reference for fremtidig genopbygning billede. Indstil en normal TIRF vinkel (dvs. efter at den kritiske vinkel, drej yderligere 1,5 grader) ved at skrive i 2140 i TIRF vinkel indstilling for billeddannelse. Brug denne vinkel indstilling for alle trin, medmindre andet er angivet.
      BEMÆRK: I TIRF systemet beskrives her, 3500 er den lodrette op vinkel, 2200 er TIRF kritiske vinkel, og 2140 er den normale TIRF vinkel, hvilket er 1,5 grad mere efter TIRF kritisk vinkel. Den smalle TIRF vinkel nævnt nedenfor i 3.2.3 er 2120, som er en anden 2 grad efter at have nået TIRF kritiske vinkel.
    4. Skift til PAmCherry1 kanal ved at klikke på the RFP-kanal knap (561 nm excitation, 600/50 nm emission filter). Juster scroll bar i "AOTF" pad hele vejen til højre for at få fuld effekt belysning af 561 nm laser til 10-20 sek til blege baggrunden membran fluorescens.
    5. Indstil kameraets indstilling optimale (2x2 Binning) i "Format" fanen og den hurtige overtagelse protokol i fanen "ND erhvervelse sekvens" (typisk 10.000-40.000 billeder på 20 Hz).
    6. Start køb af PAmCherry1 billeder (561 nm laser ved fuld effekt, 50 msek / ramme) med simultan 405 nm laser aktivering på et lavt niveau (0,1% - 1%) ved at klikke på "Kør nu" knappen. Juster intensiteten af ​​405 nm laser, således at rumligt isolerede enkelte punkter i hver ramme er let identificerbare.
      BEMÆRK: Antallet af aktiverbare PAmCherry1 molekyler falder gradvist i løbet erhvervelse. 405 nm laser intensitet bør øges gradvist til at holde den optimale tæthed af individuelle molekyle signaler i hverramme.
    7. Fortsæt erhverve billeder, indtil der ikke PAmCherry1 enkelt molekyle signal er aktiveret.
  2. PALM imaging i levende celler
    1. Før billeddannelse, fortyndes fluorescerende kugler ind afbildningskammeret i 10 minutter som beskrevet i trin 3.1.1. Så starter PALM billeddannelse ved at åbne den tilhørende imaging-softwaren.
      BEMÆRK: Brug en magnetisk quick-release imaging kammer til live-cell imaging. Oprethold midten af billedfeltet ved 35 ° C med en temperaturregulator under konstant perfusion med ekstracellulær puffer (Ekstracellulær Løsning: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCI, 2,6 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 3 mM glucose og 20 mM HEPES; pH = 7,3).
    2. Vælg knappen GFP-kanal (525/50 nm emission). Identificer cellemembranen udtrykker fluorescerende prober baseret på grøn fluorescerende fra mEOS3 under 488 nm laser excitation. Sørg for, at fluorescerende kugler nærheden er også medtaget under billedbehandling, da dette er nødvendigt senere for offline drift korrektion.
    3. Klikke på knappen "Capture" for at indsamle en TIRF billede af cellemembranen i mEOS3 (grøn) kanal som et referencebillede. Brug en lavvandet kortvarig bølge excitation belysning (efter at have nået den kritiske vinkel, drej yderligere 2 grader) ved at skrive i 2120 i TIRF vinkel indstilling for live-cell imaging.
      BEMÆRK: Dette minimerer fluorescens fra den ubundne mEos3-PH i cytosolen tilstødende til plasmamembranen.
    4. Skift til "RFP-kanalen" knappen (561 nm excitation, 600/50 nm emission). Brug den fulde effekt 561 nm laser til at blege baggrund fluorescens af membranen ark til 10 ~ 20 sek med rullebjælken i "AOTF pad" (se 3.1.4).
    5. Start erhvervelse billede ved at klikke på knappen "Kør nu" i den røde kanal (561 nm fuld kraft, fastsat til 10 ms / ramme i "kamera" indstilling fane) med samtidig 405 nm laser aktivering. Juster 405 nm laser intensitet for at aktivere rumligt adskilte punkteri hver ramme.
      BEMÆRK: Som erhvervelse udbytte, un-konverteret mEOS3.1-PH PLC δ1 molekyle nummer langsomt aftager. Gradvist øge 405 nm laser magt til at optimere enkelt molekyle signal. Købet imaging længde afhænger af den eksperimentelle formål. Anskaf billeder kontinuerligt i 5 min under normale forhold. Hvis en længere erhvervelse er påkrævet, indsamle flere billedstakke i stedet for et enkelt, stort billede stack. Filstørrelsen for hvert billede stak bør ikke overstige 4 GB eller det vil påvirke software analyse senere.

4. SMLM Billedbehandling og genopbygning

  1. Overfør billedfiler (.tif billedstakke) til et billede analyse station. Start genopbygning billedet program (custom-skrevet) i Matlab som tidligere beskrevet 37 og indlæse stakken billedet ved at klikke på fanen "Filer" i hovedmenuen, derefter "åben", derefter "ny fil".
  2. Identificere og locaLize enkelte molekylære begivenheder fra hver ramme. Set filtrering tærskel intensitet med en tærskel nummer (1-10) i "wavelet". Kontroller de optimale parameterindstillinger for punkt detektion visuelt før genopbygningen. Så gå til fanen "PALM" og klik på "et skridt proces" for at starte genopbygningen billede.
    BEMÆRK: tærskel Intensitet for punkt detektion er vilkårlig og afhænger af personlig erfaring. Adskillige forsøg kan være nødvendigt for at generere en optimal detektionsgrænsen at hverken picks for mange ukvalificerede (dim) point op eller filtrerer for mange kvalificerede (lyse) point. At justere andre parametre for at optimere dataanalyse. Her kvarter afstand (fluorescens punkter i de omkringliggende rammer inden for en afstand kombineres), der som 65 nm (1/2 pixel bredde) og monteret som et enkelt molekyle. Gap frames (individuelle molekyle begivenheder, der fandt sted inden for disse rammer og kvarter afstand blev kombineret og monteret som et enkelt molekyle begivenhed) erindstillet som 26 rammer (1.3 sek) for PAmCherry1 billeddannelse 40. Juster disse parametre i henhold til egenskaberne af enkelt molekyle prober og erhvervelse sats for at undgå over-tælle 40 i SMLM. Påfør afdrift korrektion med fluorescerende kugler i de rekonstruktioner.
    1. For billeddannelse de faste membran plader mærket af IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, rekonstruere hele billedet stakke fra samme membran ark i en enkelt super-opløsning billede 37.
    2. For levende celleprøver mærket af mEOS3.1-PH PLC δ1, adskille hele billedet stakken i flere mindre stakke af 1.000 frames, så 1000-træk-frame stack er rekonstrueret som en enkelt super-opløsning billede, som har en tidsmæssig opløsning på 10 sek. I sidste ende, kombinere alle de tid serien billederne i den endelige tidsserier stakken 23.
      BEMÆRK: I live-cell PALM imaging, kan et lille antal af aktiverede sonder flytte eller tage afstandfra PI (4,5) P2 i PM før blegning. At tage højde for oversampling af proberne, kombinere individuelle molekyler signaler i de tilstødende rammer i 130 nm (i stedet for 65 nm) til et enkelt emission hændelse under billedanalyse.
  3. Efter opnåelse af de rekonstruerede billeder, foretage yderligere billedanalyse med brugerdefinerede skrevet program i Matlab at kvantificere molekyle tæthed, mikro-domænet tæthed / størrelse, og klyngeanalyse med pair-korrelation 41.

Representative Results

Lokaliseringen usikkerhed (σ) af vores guide opløsning system er 14.73 nm 23. Direkte sammenligninger mellem TIRF og PALM billeder viste en signifikant forbedring af rumlig opløsning. Figur 3A-B viser den repræsentative PI (4,5) P 2 TIRF billeder mærket med PI (4,5) P2 antistof og IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 i typiske membranplader og levende celler. Billederne og konventionelt TIRF mikroskopi i membranark er bemærkelsesværdigt lig dem i intakte levende celler mærket med det forstærkede grøn fluorescensprotein (EGFP) mærkede PH-domæner (EGFP-PH PLCδ1) (figur 3C). Alle prøver viste en jævn fordeling af prober. I modsætning hertil ikke-optimal fiksering af prøverne resulterede i skarp tætte PI (4,5) P2 klynger og et fald i signalintensitet (fig 4). Under optimale fiksering betingelser, than super-opløsning billeder af PI (4,5) P2 i fikserede celler (figur 5) afslørede en homogen fordeling af prober i en betydelig del af PM med kun begrænset koncentrationsgradienter. Nogle membran patches beriget med PI (4,5) P2 prober blev tyndt fordelt og havde forskellige størrelser. Live-celle PALM billeder vises en tilsvarende rumlig fordeling som faste celler (figur 6). Detaljeret analyse af PI (4,5) P 2 signaler end time resultater i hurtige dynamik i lokale områder, uden væsentlige ændringer af deres overflod i brede områder.

figur 1
Figur 1. Ordning for fluorescerende prober anvendt i denne undersøgelse. (AB) IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 sonde anvendes i faste membran ark eksperimenter. Under konventionel TIRF billeddannelse (A), et 640 nm laser bruges til at excitere IRFP (Ex: 692 nm; em: 713 nm). TIRF billede taget i denne tilstand tjener som en TIRF referencebillede for super-opløsning billeddannelse opnås ved PALM imaging (B). En 405 nm laser bruges til foto-aktivere PAmCherry1 fluorofor og en 561 nm laser bruges til at excitere PAmCherry1 (Ex: 564 nm; em: 595 nm) i PALM billeddannelse. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 sonde, der anvendes i de levende celle eksperimenter. (C) Under konventionel TIRF billedbehandling, er en 488 nm laser, der anvendes til at ophidse mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm). (D) Efter fotokonvertering af en 405 nm laser, mEos3.1 bliver til den røde formular (Ex: 573 nm; Em: 584 nm). Og en 561 nm laser bruges til Palm opkøb Klik her for at se en større udgave af dette tal.

s / ftp_upload / 54.466 / 54466fig2.jpg "/>
Figur 2. Ordning for membranbane præparat fra INS-1-celler. (A) Placer dækglasset med dyrkede celler nedad på en PDL-coatet dækglas og vent 7 ~ 10 min ved 4 ° C for at tillade cellebinding til PDL- belagt dækglas. (B) Træk den øverste dækglasset med en pincet og løse membranen ark knyttet til PDL pre-belagt dækglas. (C) Billede prøverne med TIRFM og PALM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. PI (4,5) P2 rumlig organisation er ens mellem membranplader og intakte levende celler under traditionelle TIRF mikroskop. (A) Atypisk TIRF foto af membranark fastsat ved 4 ° C med 4% PFA og 0,2% GA. PI (4,5) P2 blev mærket med PI (4,5) P2-specifikt antistof. (B) En membran ark fra INS-1 celle, der udtrykker IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. (C) TIRF foto af to intakte levende celler, der udtrykker EGFP-PH PLCδ1 på forskellige niveauer. Scale bars: (A): 3 um; (B) og (C):. 5 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. PI (4,5) P2 rumlige organisation i membranplader er følsom over for fælles fiksering betingelser. (A) -membran ark fastsat til 37 ° C med 4% PFA aleneog mærket med PI (4,5) P2-specifikt antistof (som i figur 3A). (B) Membran plade fastgjort ved stuetemperatur med PFA alene og mærket med PI (4,5) P2-specifikt antistof. Bemærk, at de tætte klynger af PI (4,5) P2 prober er klart synlige under TIRF mikroskop, i modsætning til de meget mere selv fluorescensafbildninger vist i figur 3A. Scale barer: AB:. 3 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. PALM billeddannelse af PI (4,5) P 2 sonder afslører deres nanometer skala fordeling i en INS-1 celle PM. (A) IRFP TIRF billede af en membran ark fra en INS-1 celle udtrykker IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) Tilsvarende PALM billede af PM i samme region baseret på genopbygning PAmCherry1 signal. Bemærk den homogene PI (4,5) P2 rumlige fordeling i større PM regioner og flere PI (4,5) P 2 mikrodomæner. (C) et forstørret billede af den indrammede region i (B). Pile angiver tyndt fordelt PM mikrodomæner beriget med PI (4,5) P 2 prober. Scale barer: A og B: 3 um; C: 500 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. PALM billeddannelse med levende INS-1-celler. (A) TIRF foto af PI (4,5) P2 i en levende INS-1 celle, der udtrykker mEos3.1-PH PLCδ1. Billedet blev hurtigt overtaget i den grønne kanal før PALM erhvervelse (35 ° C). (B) Sekventielle live-cell PALM billeder på 10 sek interval. Mellemværker viser intensitetsprofiler for den lokale PI (4,5) P2 tæthed langs den samme lige linie 1 position på forskellige tidspunkter i (B) og (C). Bemærk deres store lokale ændringer intensitet inden for 10 sek. (D) Tidsforløb for de gennemsnitlige ændringer i PI intensitet (4,5) P2 i det store område (box2, 3x3 um) og små cirkler (3, 4, og 5, 500 nm diameter) i (B) i løbet af 5 min af PALM imaging (ramme / 10 sek). Bemærk udsving i lokale PI (4,5) P 2 sonder de hurtige intensitet (cirkel 3, 4 og 5) i forhold til meget små ændringer i det brede område (boks 2). (E) Forstørret PALM billeder af box2 region i (B) på angivne tidspunkter. Pile angiver PI (4,5) P 2 beriget membran pletter under physiological forhold. Scale barer: C: 3 um; E: 500 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

For fejlfinding, to processer har brug for ekstra opmærksomhed: membran plader produktion og prøve fiksering. Som beskrevet i protokollen, inkubationstiden af ​​dækglas i trin 1.1.6 er vigtigt for membran ark produktion. Optimal inkubationstid under vores eksperimentelle betingelse er 7-10 min (figur 2). Længere end 10 minutters inkubation vil producere intakte celler i stedet for membranbanerne på PDL dækglas og kortere inkubation vil føre til mindre eller ingen membran ark på PDL-overtrukne dækglas. Som beskrevet i protokollen, de fikseringsmidler og temperatur under fiksering er afgørende for at opretholde PI (4,5) P2 fordeling i PM. Fiksering ved RT eller brug af 4% -PFA alene kunne fordreje den normale lipid distribution i PM.

Ved at anvende PALM mikroskopi til membran lipid forskning, er vi i stand til at observere nanometer skala fordeling af PI (4,5) P2, en nøgle phosphoinositid der medierer meventuelle grundlæggende cellulære aktiviteter. Denne rumlige fordeling af PI (4,5) P2 med begrænsede koncentrationsgradienter i INS-1 celler giver en ramme for nytænkning lipid-protein interaktioner og lokale signalsystemer begivenheder PI (4,5) P2 i disse celler. Desuden kan de metoder, der er udviklet i dette arbejde også anvendes på andre membran phospholipid forskning med ordentlig sonder dermed tilbyde nye værktøjer til at studere phosphoinositider i biologiske processer.

Brugen af ​​membran plader i dette arbejde omgår to store bekymringer i phospholipid morfologiske undersøgelser: vaskemiddel behandling og potentiel forurening signal fra cytosolen. Rengøringsmidler ofte forårsager klyngedannelse og betydelige tab af PM phospholipid signal. Forureningen af cytosolisk signal er særlig problematisk i tilfælde af lav hyppighed phosphoinositider på PM 23, såsom PI (3,4,5) P3 og PI (3,4) P2. Membranbane prøver er i stand til kredsløb;mvent disse problemer uden i væsentlig grad at forstyrre strukturer i forbindelse med plasmamembranen, såsom cortical actin meshwork og clathrin-overtrukne gruber 42,43. Den relative homogen fordeling af PI (4,5) P2 i PM er i god overensstemmelse med andre hurtig nedfrysning EM undersøgelser under anvendelse GST-PH PLC δ1 prober i fibroblast membranen 44.

Det er vigtigt at bemærke, at forkerte prøve forarbejdningsbetingelser kan generere misvisende resultater. Først er det vigtigt at udføre fikseringen trin ved en lavere temperatur (4 ° C) og bruge fiksativ GA for membran ark produktionslinje. Som vist i figur 3, varm temperatur og PFA fiksering uden GA er ikke tilstrækkelig til at løse phosphoinositider i celle PM. Dette kan fordreje den intakte PI (4,5) P2 fordeling og generere skarpe klynger, der ikke er observeret i levende celler under fysiologiske betingelser. For det andet er anvendelsen af ​​PAmCherry1 somden SMLM sonde, snarere end andre sonder, er afgørende for kvantitativ PALM billeddannelse. Fordelen ved PAmCherry1 ansøgning kommer fra dets velkarakteriserede enkelt molekylære tilgængeligt-fysiske egenskaber 35,40,45, såsom lysstyrke, høj foto-aktivering effektivitet og mest af alt, meget begrænset foto-blinke. Disse egenskaber gør os i stand til at eliminere potentielle klynge artefakter fra foto-blinke og kvantitativt analysere molekylære tæthed af membran PI (4,5) P2.

Denne fremgangsmåde har også sine begrænsninger. Først kan membranen ark metode anvendt i denne undersøgelse ikke helt efterligne den fysiologiske fordeling af PI (4,5) P2 fordi cellen afbrydes før billeddannelse. Men vores live PALM imaging viser, ligner relativt homogen fordeling af PI (4,5) P2, støtter de observerede med membran ark prøver resultater. For det andet, som vi diskuterede i vores tidligere arbejde 23, SMLM kræver billedbehandling ekspertise og ekstra påtention at undgå imaging artefakter, der måtte opstå fra forskellige processer, herunder anvendte prober, prøveforberedelse og fiksering, billede prøvetagning og genopbygning. Endelig selvom PH-domænet baseret prober og antistoffer er blevet meget udbredt i phosphoinositid studier 46,47 det forbliver muligt, at ikke alle PI (4,5) P2 i membranen kan detekteres ved denne fremgangsmåde. For eksempel kan PI (4,5) P2 bundet af andre endogene proteiner ikke være tilgængelige for PH prober eller antistoffer, og dette kan medføre en undervurdering af PI (4,5) P2 på grund af den plads, hindring af sonden selv. En alternativ måde at mærkning PI (4,5) P2 ville bruge Top-Fluor PI (4,5) P2 48, en præ-mærket PI (4,5) P2-analog med en modificering på halen af originalen PI (4,5) P2. Imidlertid kan den omdannes hurtigt til andre phosphoinositid undertyper af hurtig levende cellemetabolisme siden dens inositol ring er den samme som endogenous PI (4,5) P2. Dette giver anledning til bekymring om, hvorvidt denne pre-mærket PI (4,5) P2 analog i levende celler trofast kan repræsentere PI (4,5) P2 snarere end dens stofskifteprodukter. På trods nogle begrænsninger, PH domæne baserede prober er stadig blandt de bedste sonder, der har været almindeligt anvendt til at overvåge PI (4,5) P2 fordeling og dynamik på PM af celler.

Den fremtidige anvendelse af denne metode kan udvides til andre phosphoinositid undersøgelser, såsom PI (3,4,5) P 3 og PI (3,4) P2. Sammenfattende den hidtil ukendte SMLM tilgang, der her åbner nye måder at studere phosphoinositid i celler. Anvendelse af PI (4,5) P2 som et eksempel, viser vi de unikke egenskaber af PALM billeddannelse i morfologiske og kvantitativ undersøgelse af cellemembran-molekyler, såvel som sine ulemper. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til andre molekyler af interesse og vil have brede applikationer i cellebiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Nikon Ti-U
sCMOS camera Andor Neo
Spinning disk Yokogawa CSU X-1, 10,000 rpm 
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. Agilent MLC400 laser original powers & powers at the end of optical fiber)
405 nm: 15 mW & 13 mW;
488 nm: 45 mW & 42 mW;
561 nm: 45 mW & 40 mW;
640 nm: 35 mW & 16 mW.
100X Objective Nikon APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12 mm
Nikon acquisition and analysis software (NIS Element) Nikon
Matlab MathWorks
Coverslip Warner 64-0714 Round 18 mm coverslip, #1.5
Fibronectin Millipore FC010-5MG
Lipofectamin 3000 (transfection reagent) Invitrogen L3000-008
Glutaraldehyde Electron Microscopy Science #16120
PI(4,5)P2 1st antibody Santa Cruz sc-53412
secondary antibody  F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21237
Tetraspeck beads Invitrogen T7279
magnetic quick release imaging chamber  Warner Instruments Cat#641994
temperature controller Warner Instruments TC-344C
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Phosphate buffer saline Sigma P4417-100TAB
EGTA Sigma 3780
NH4Cl Sigma A0171
Goat serum Sigma G9023
bovine serum albumin Sigma A7906
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
CaCl2•2H2O Sigma 223506
MgCl2•6H2O Sigma M9272
Glucose Sigma G7021
HEPES Sigma H4034
Paraformaldyhyde Sigma P6148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
  2. Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, New York, N.Y. 727-730 (2012).
  3. Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
  4. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science. 296, 1655-1657 (2002).
  5. Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
  6. Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
  7. Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
  8. Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
  9. Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
  10. Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
  11. van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
  12. Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
  13. Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
  14. James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
  15. Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
  16. Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
  17. Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
  18. Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
  19. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
  20. van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
  21. van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
  22. Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
  23. Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  27. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
  28. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
  29. Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  30. Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
  31. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
  32. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  33. Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24 (2009).
  34. Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
  35. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
  36. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  37. Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
  38. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  39. Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
  40. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
  41. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
  42. Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
  43. Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
  44. Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
  45. Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, Á, Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
  46. Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
  47. Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
  48. Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).

Tags

Biokemi Super-opløsning billeddannelse PALM Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P2) cellemembran ark phosphoinositid betaceller
Single-molekyle Super-resolution Imaging af Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, C., Lou, X. Single-molecule… More

Ji, C., Lou, X. Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes. J. Vis. Exp. (116), e54466, doi:10.3791/54466 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter