Abstract
I dette papir beskrives en protokol for den hurtige og standardiserede berigelse af leukocytter fra små fuldblodsprøver. Denne procedure er baseret på hypotonisk lyse af erythrocytter og kan anvendes på humane prøver samt til blod af ikke-human oprindelse. Den lille indledende prøvevolumen på omkring 50 til 100 pi gør denne metode anvendes på tilbagevendende blodprøveudtagning fra små forsøgsdyr. Desuden er leukocyt berigelse opnås inden for få minutter og med lave materielle indsats vedrørende kemikalier og instrumentering, hvilket gør denne metode anvendelig i flere laboratorie miljøer.
Standardiseret oprensning af leukocytter er kombineret med en meget selektiv farvning metode til at evaluere halogeneringsmiddel peroxidase aktivitet af hæm peroxidaser, myeloperoxidase (MPO) og (EPO), dvs. dannelsen af hypochlorsyrling og hypobromsyrling (HOCI og HOBr). Mens MPO udtrykkes kraftigt i neutrophils, den mest rigelige immun celletype i humant blod og i monocytter, det tilknyttede enzym EPO udelukkende udtrykkes i eosinofiler. Halogeneringsmidlet aktivitet af disse enzymer er rettet ved hjælp af næsten HOCl- og HOBr-specifikke farvestof aminophenyl fluorescein (APF) og den primære peroxidasesubstrat hydrogenperoxid. Ved efterfølgende flowcytometrianalyse alle peroxidase-positive celler (neutrofiler, monocytter, eosinofiler) kan skelnes og deres halogenerende peroxidase aktivitet kan kvantificeres. Da APF farvning kan kombineres med anvendelsen af celleoverflademarkører, kan denne protokol udvides til specifikt leukocyt sub-fraktioner. Metoden kan anvendes til at påvise HOCI og HOBr produktion både i menneskelig og gnavere leukocytter.
I betragtning af den udbredte og forskelligt diskuteret immunologisk rolle af disse enzymatiske produkter i kroniske inflammatoriske sygdomme, kan denne protokol bidrage til en bedre forståelse afimmunologisk relevans af leukocytafledte hæm peroxidaser.
Introduction
Polymorfonukleære leukocytter (PMN'er, også kaldet granulocytter) og monocytter repræsenterer vigtige cellulære komponenter i det medfødte immunsystem i blodet 1,2. De bidrager til den primære forsvar mod patogener samt til aktivering af aktiv immunisering og påbegyndelsen af en systemisk inflammatorisk respons 2-4. Men især neutrofiler, den mest rigelige type granulocytter og monocytter også bidrage væsentligt til regulering og opsigelse af akutte inflammatoriske begivenheder 5. Derfor disse celler kan også spille en vigtig rolle i kroniske inflammatoriske sygdomme som rheumatoid arthritis 6,7. Faktisk astma, en kronisk inflammatorisk luftvejssygdom, er kendetegnet ved en svækket apoptose af eosinofiler, den anden mest granulocyt type i blodet 8. Men apoptose af granulocytter og deres hurtige fjernelse af makrofager er to væsentlige skridt i løbet af cellulære opsigelseaf inflammation 9-11.
I de nævnte immunceller to nært beslægtede enzymer, nemlig myeloperoxidase (MPO, neutrofiler og monocytter) og (EPO, eosinofiler) findes 12,13. Disse hæm peroxidaser er klassisk relateret til den humorale immunrespons, som de to-elektronisk oxidere (pseudo) halogenider til de tilsvarende hypo (pseudo) halous syrer, som er kendt for deres baktericide egenskaber 14-16. Under fysiologiske betingelser MPO hovedsagelig former hypochlorsyrling (HOCl) og hypothiocyanite (- OSCN), mens sidstnævnte og hypobromsyrling (HOBr) udgøres af EPO 17-19. Nye resultater tyder på, at dette (pseudo-) halogenerende enzymaktiviteten også kan bidrage til regulering af inflammatoriske reaktioner og til afslutning af immunreaktioner 20,21. Faktisk blev det HOCI produktion af MPO og afledte produkter vist sig at undertrykke T-celle-baserede adaptive immunresponser 22-2Fire.
For at få mere indsigt i den immunologiske rolle af leukocytter fra det medfødte immunsystem ved kroniske inflammatoriske sygdomme og til at bestemme bidraget fra MPO og EPO til denne fysiologiske funktion udviklede vi en metode til hurtigt at berige leukocytter fra små blodprøver for en efterfølgende specifik bestemmelse af halogenerende peroxidase-aktivitet i disse celler. For erythrocyt udtømning har vi valgt en standardiseret fremgangsmåde, der indbefatter to efterfølgende hypotonisk lyse trin med destilleret vand, hvilket fører til en hurtig leukocyt berigelse ved lave materialeomkostninger. For efterfølgende bestemmelse af halogeneringsmidlet MPO og EPO aktivitet HOCl- og HOBr-specifikke farvestof aminophenyl fluorescein (APF) blev anvendt 25-27. I modsætning til anvendelsen af uspecifik peroxidase farvningsmetoder 28,29, denne fremgangsmåde tillader selektiv detektion af halogenerende peroxidase aktivitet, som ofte forringet på svær inflammation 30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle humane blodprøver blev opnået fra raske frivillige, og den anvendte leukocyt berigelse protokol følger retningslinjerne etiske kommission af det medicinske fakultet ved universitetet i Leipzig. Forsøgene med rotte blod blev godkendt af den ansvarlige lokale etiske udvalg (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), i henhold til de tyske retningslinjer for pasning af dyr og brug.
1. Eksperimentel opsætning
BEMÆRK: Da den hypotonisk procedure lysis for udtømning af erytrocytter fra blodprøverne er en tidskritisk procedure, forberede alle nødvendige udstyr (f.eks, buffere) for denne del af protokollen på forhånd.
- Mærk et 15 ml centrifugerør til hypotonisk lyse og en 1,5 ml prøveglas til efterfølgende aminophenyl fluorescein (APF) farvning pr blodprøve.
- Hvis leukocyt berigelse vil blive udført under sterile forhold, udføre denne mærkning under en strømboks.
- Forbered ca. 12 ml phosphatbufret saltvand (PBS, 10 mM) per prøve. Afhængigt af om leukocytterne isoleres under sterile betingelser eller ej, forberede PBS enten ved anvendelse af steril klar opløsning fra en leverandør eller ved opløsning PBS tabletter i destilleret vand. Kontroller pH-værdi og om nødvendigt, justeres til pH 7,4 ved anvendelse af små mængder af 0,1 M HCI og NaOH-opløsninger.
- Opløs PBS tabletter (se tabel Materialer) i 200 ml destilleret vand til opnåelse af en ikke-steril puffer tilstrækkelig opløsning i ca. 16 prøver. Hvis det ønskes, steriliseres denne opløsning ved sterilfiltrering.
- Forbered ca. 1 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) suppleret med Ca2 + per prøve.
- Opløs 970 mg HBSS salt i 100 ml (slutvolumen) dobbelt-destilleret vand. Inden påfyldning op til det endelige volumen, kontrollere pH-værdien, og tilpasse det til pH 7,4. På grund af sin lave bufferkapacitet, forberede denne buffer frisk hver dag end udføre pH-justeringen med særlig omhu ved anvendelse af små mængder af 0,1 M HCI og NaOH-opløsninger.
BEMÆRK: Steril opløsning kan anvendes, afhængigt af forsøget. Opløsningen kan steriliseres ved sterilfiltrering.
- Opløs 970 mg HBSS salt i 100 ml (slutvolumen) dobbelt-destilleret vand. Inden påfyldning op til det endelige volumen, kontrollere pH-værdien, og tilpasse det til pH 7,4. På grund af sin lave bufferkapacitet, forberede denne buffer frisk hver dag end udføre pH-justeringen med særlig omhu ved anvendelse af små mængder af 0,1 M HCI og NaOH-opløsninger.
- Udover to buffere, label og forberede et rør (fx 50 ml centrifugerør) eller kolbe (f.eks 250 ml målebæger) med dobbelt-destilleret vand til hypotonisk lyse procedure på forhånd. Forbered ca. 10 ml vand per prøve.
- Forbered en beholder med knust is til APF farvning (afsnit 3), som udføres på is.
- Forbered portioner af APF på forhånd at tillade hurtig tilberedning af arbejdsopløsninger anvendes under farvning (trin 3.2) og for at undgå gentagne gange nedfrysning og optøning af APF løsningen.
BEMÆRK: APF er almindeligt opnået som en 5 mg / ml (11,81 mM) stamopløsning i methylacetat.- Frys alikvoter af 10-100 pi i 0,5 ml rør. På APF farvning en endeligkoncentration farvestof med 10 pM anvendes (trin 3.8).
2. hypotonisk lyse af erythrocytterne
BEMÆRK: Udfør hypotonisk lyse trin (undtagen centrifugeringsfaciliteterne trin) under en laminar strømning bænk for at undgå forurening. Udfør hele proceduren ved stuetemperatur. Som det hypotonisk lyse er en tid kritisk proces, justere pipetter til vand (2 ml) og PBS (5 ml) tilsætning i forvejen og åbne vand og PBS kolber før start proceduren. PBS-opløsning og destilleret vand ved stuetemperatur før brug opbevares.
- Fra hver blodprøve transfer 100 pi til den relevante 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: I vores eksperimenter blodprøver indeholder sædvanligvis 10 U / ml heparin, for at undgå koagulation. Endnu på grund af forskellige kilder af prøvematerialet arten og koncentrationen af anti-koagulationsmiddel kan variere. Dens indflydelse på APF farvning testes ved Comparing resultaterne til resultater opnået fra blodprøver suppleret med andre typer eller koncentrationer af antikoagulerende. - Tilsæt 2 ml destilleret vand og blandes prøverne ved anvendelse af en vortex-blander indstillet på et medium niveau. Inkuber prøverne i 60 sek, hvorefter der tilsættes 5 ml PBS per prøve og blandes ved hjælp af vortex-blander.
kan tilberedes op til ca. 5 prøver parallelt: OBS. Hold prøve orden den samme for tilsætning af vand og PBS for at opnå sammenlignelige inkubationstider. - Efter regenerering af isotoniske betingelser ved PBS tilsætning (trin 2.2) pelletere de resterende intakte celler i alle prøver ved centrifugering i 6 minutter ved stuetemperatur og 450 x g.
- Fjern supernatanten ved at hælde det i en tabel affaldsspand. Fjern så meget væske som muligt ved at vende centrifugerør og trykke på åbning på en papirserviet. Sikre, at cellepelleten er så tør som muligt.
- Gentag hypotonisk lyse procedure som beskrevet før (trin 2.2).
NOTE: I princippet (trin 2.3 til 2.5) denne hypotonisk lysis procedure kan gentages mere end én gang, afhængigt af renheden af den blandede leukocyt fraktion, der skal opnås. Efter to lyse trin andelen af resterende erythrocytter i den opnåede fraktion blandet celle er omkring 25%. - Pelletere resterende intakte celler ved centrifugering i 6 minutter ved stuetemperatur og 450 x g. Fjern supernatanten (se trin 2.4). Tilføj 500 pi HBSS til pelleten og forsigtigt opløse det indtil en homogen opløsning er opnået. Overfør hver prøve til den tilsvarende mærkede 1,5 ml prøveglas.
- Afhængigt af forsøget direkte analysere opnåede prøver (fx via flowcytometri) 25, pletten med fluorescensmærkede antistoffer (til identifikation af enkelte celletyper) 32, inkuberes med cellestimuli (for aktiveringen af celler eksperimenter) 33 eller opbevaret på is og anvendelse senere. Afhængigt af formålet med undersøgelsen, straks foretage efterfølgende eksperimenter påden blandede leukocytfraktionen eftersom granulocytter har en forholdsvis kort halveringstid på omkring 20 timer.
BEMÆRK: Dette gælder også for peroxidase aktivitet farvning beskrevet nedenfor.
3. halogenering peroxidaseaktivitet Staining
BEMÆRK: HOCl- og HOBr-produktion ved de blodafledte hæm peroxidaser MPO og EPO kvantificeres ved hjælp APF, som oxideres til fluorescein af de navngivne hypohalous syrer. Derfor hvis cellemærkning med fluorescensmærkede antistoffer udføres i kombination med APF-farvning, undgå fluoroforer, som interfererer med emissionen signal af fluorescein.
- Udfør APF-farvning ved 4 ° C på is.
- Til fremstilling af en arbejdsdag opløsning af APF tø en passende alikvot af farvestoffet (f.eks 10 pi, 11,81 mM) og fortyndes med HBSS til præcis 1 mM (dvs. føje 108,1 pi buffer til 10 pi).
- For hver prøve (500 pi celle opløsning) forberede 5 μl den beskrevne APF brugsopløsning. Følgelig bruge en 10 pi alikvot af APF (11,81 mM), hvilket giver 118,1 pi APF arbejdsopløsning (1 mM) til fremstilling af omkring 20 prøver. På grund af tab under pipettering forberede omkring 10% mere APF arbejder løsning end beregnet.
- For at kontrollere den peroxidase specificiteten af APF-farvning, forberede kontrolprøver med hæm peroxidase inhibitor 4-aminobenzoesyre hydrazid (4-ABAH) 35.
- Der fremstilles en 1 M stamopløsning af 4-ABAH (151,17 g / mol) i dimethylsulfoxid (DMSO) ved at fortynde 75,6 mg 4-ABAH i 500 pi opløsningsmiddel. Fortynd 4-ABAH 1/10 i HBSS.
- Til fremstilling af en H 2 O 2 brugsopløsning label to 1,5 ml centrifugeringsrør med "70 mM H 2 O 2" og "7 mM H 2 O 2" hhv.
- I rør mærket "70 mM H 2 O 2", frisk fortyndet 10 piaf en 30% stamopløsning (8,8 mM) H 2 O 2 under anvendelse af 990 pi destilleret vand for at opnå en koncentration på ca. 88 mM. Opbevar på is og anvendes inden for 4 timer.
BEMÆRK: H 2 O 2 leveres typisk som en 30% stamopløsning af leverandørerne. Ved opbevaring ved 4 ° C, er den stabil i ca. 3 år. Udføre fortyndinger af H 2 O 2 i destilleret vand for at undgå nedbrydning. H 2 O 2 fortyndinger kunne også fremstilles i 0,1 M NaOH-opløsning. - Til bestemmelse af den nøjagtige H 2 O 2 koncentration udarbejde endnu 1 til 10 fortynding fra det første H 2 O 2 stamopløsning (ca. 88 mM) ved tilsætning af 100 pi af denne opløsning til 900 pi destilleret vand i 1,5 ml rør mærket "7 mM H 2 O 2".
- Optag et spektrum i nær UV-området (f.eks 200-300 nm) ved hjælp af en UV-Vis photospectrometer og bruge absorbansen ved 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm-1) for at bestemme det faktiske H 2 O 2 koncentrationen i den anden H 2 O 2 stamopløsning 34. Sørg for, at henvisningen kuvetten indeholder kun destilleret vand. Til måling brug kvartskuvetter som et spektrum i UV-området registreres.
- Fra dette resultat, beregne den nøjagtige koncentrationer af begge H2O 2 stamopløsninger. Indstille koncentrationen af den første stamopløsning i "70 mM H 2 O 2" prøverør til nøjagtigt 70 mM ved tilsætning af en passende mængde destilleret vand. den opnåede brugsopløsning på is opbevares og anvendes inden for en time.
- I rør mærket "70 mM H 2 O 2", frisk fortyndet 10 piaf en 30% stamopløsning (8,8 mM) H 2 O 2 under anvendelse af 990 pi destilleret vand for at opnå en koncentration på ca. 88 mM. Opbevar på is og anvendes inden for 4 timer.
- Tilsæt 5 pi af 4-ABAH arbejdsopløsning (100 mM) til de passende prøver til en slutkoncentration på 1 mM. Inkuber prøverne i 15 minutter ved 37 ° C i inkubatoren før APF tilsætning.
- Tilsæt 5 pi APF arbejdsopløsning (1 mM) til hver500 pi prøve at opnå en endelig farvestof koncentration på 10 uM. Bland prøverne forsigtigt (fx ved hjælp af vortex-blander på en mellemlang indstilling) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt 5 pi H2O 2 arbejdsopløsning (70 mM) til hver 500 pi prøve til en slutkoncentration på 700 uM. Bland forsigtigt prøverne og inkuberes dem i 60 minutter ved 37 ° C. Udføre relevante kontrolmålinger parallelt.
BEMÆRK: Kontrol målinger viste, at 700 uM H 2 O 2 ikke er toksiske for cellerne. blev alle væsentlige cellulære reaktioner observeret Nor.
BEMÆRK: APF-farvning kan også udføres ved at udelade tilsætningen af H2O 2, afhængigt af den videnskabelige spørgsmål. I fravær af hydrogenperoxid kun den basale chloreringsmiddel MPO og EPO-aktiviteten bestemmes, mens tilsætningen af H2O 2 muliggør påvisning af den maksimale HOCl og HOBr produktion af cellerne. Than sidste betyder en væsentlig højere fluorescerende signal. - For pelletering af cellerne, centrifugeres prøverne i 10 minutter ved stuetemperatur og 400 x g. Fjern omhyggeligt supernatanten uden at ødelægge pellet og tilføje 250 pi HBSS til at opblande cellerne.
BEMÆRK: Prøverne er nu klar til analyse via flowcytometri 25. - prøverne i mørke lagre indtil analyse for at undgå blegning. Efter excitation ved 480 til 490 nm detektere emissionen af fluorescein ved ca. 525 nm 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som tidligere rapporteret den ovenfor beskrevne metode viste sig at være anvendelig både til mennesker og ikke-menneskelige materiale 32. Desuden som vist for mus med astmasymptomer APF farvning kan være et egnet værktøj til at detektere forskelle i det systemiske pro-inflammatorisk status. Derfor vil der i en efterfølgende undersøgelse, vi brugte denne protokol til gentagne gange at evaluere halogenerende aktivitet MPO (og EPO) i kvindelige Mørk Agouti rotter med pristan-induceret arthritis (PIA). Et repræsentativt eksempel på leukocyt berigelse og farvning udføres i dette eksperiment er vist i figur 1. Ca. 200 pi helblod blev opnået fra retrobulbær venøse plexus af dyret under anæstesi og hepariniseret. Erythrocyt udtømning og en efterfølgende APF-farvning blev udført ved anvendelse af 100 pi prøvevolumen. Bagefter blev prøven analyseret ved flowcytometri.
(figur 1A), en stærk udtømning af erytrocytter fra prøven blev opnået. Desuden forskellige leukocyttyper var klar og tydelig, som blev identificeret ved anvendelse af fluorescensmærkede celleoverflademarkører (ikke vist). Kort på erythrocyt (CD235a-positive) / celle debris region kun tegnede sig for 22% af de begivenheder, mens omkring 48% af de begivenheder, blev identificeret som CD16-positive neutrofiler. Desuden blev hver identificeret 3% af de begivenheder som CCR3-positive eosinofiler og CD14-positive monocytter og omkring 19% af de begivenheder tegnede sig for CD5 / CD19-positive B og T-lymfocytter, hhv. Intensiteten fordeling af APF-afledte fluorescens (figur 1B) klart tillod diskrimination af peroxidase-negative erythrocytter og lymfocytter, mens monocytter og eosinofiler førte til en moderat APF oxidation og neutrofiler var stærkt peroxidase-positive under lmOsen forsøgsbetingelser. Disse resultater er i overensstemmelse med den høje forekomst af MPO i de sidstnævnte celler sammenlignet med koncentrationen af enzymet i monocytter 20. Den relativt svage respons af eosinofiler kan forklares ved det faktum, at ingen bromid blev tilsat, som eventuelt har fået EPO-afledte dannelse af HOBr. Indledende undersøgelser på isolerede eosinofiler overraskende viste ikke en stor indflydelse af eksternt tilsat bromid om APF oxidation ved hjælp af disse celler. Stadig, oxidation af APF af eosinofiler observeret, hvilket kan forklares ved indføring af små mængder af Br - via pufferopløsninger anvendte (PBS og HBSS). Alternativt EPO kan også producere små mængder af HOCI, i det mindste under sure betingelser (f.eks i phagolysosomes).
Figur 1: Leukocyt berigelse og APF-udleded fluorescens i en blod mikro-prøve fra en rotte. En mængde på omkring 200 pi helblod blev opnået fra retrobulbær venøse plexus af en kvindelig Mørk Agouti rotte. Efter påføring af den beskrevne hæmolyse procedure til 100 pi blod og en efterfølgende APF farvning fraktionen blandet celle blev analyseret ved flowcytometri. Som det fremgår af FSC / SSC- Plot (A) erytrocytterne var stærkt forarmet fra prøven, og de forskellige leukocyt typer kunne nemt skelnes. Fordelingen af APF-afledte fluorescensintensitet (B) viste klart hæm peroxidase-negative celler (erythrocytter og lymfocytter) samt leukocytter med moderate (eosinofile og monocytter) eller stærke (neutrofiler) halogenerende peroxidase aktivitet. Klik her for et større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Da neutrofiler er de mest udbredte leukocytter i menneskeblod isoleringen af peroxidase-positive celler ofte kun fokuserer på disse celler og omfatter en adskillelse af neutrofiler fra andre leukocytter ved densitetsgradientcentrifugering 38. Men som neutrofiler er meget mindre rigelige i murine blodprøver 39 for sidstnævnte mere komplicerede metoder skal anvendes 40. Desuden begge metoder også føre til fjernelse af peroxidase-positive monocytter fra prøverne, og på grund af behovet for større blod mængder (f.eks 400 pi 41), finder ikke anvendelse på mikro-prøver opnået under tilbagevendende blodprøveudtagning fra små forsøgsdyr 38,40. Rensningen af murine neutrofiler fra peritoneale ekssudater også brug ofringen af dyrene og i øvrigt ikke giver blod-afledte granulocytter 38,40. For nylig udviklet metoder til at opnå højt oprensede granulocyt fraktioner fra murine blood (f.eks anvendelsen af antistoffer) er ofte dyre, komplicerede og tidskrævende 40,42,43 og igen kun fokusere på oprensningen af en peroxidase-positive leukocyt type.
metoden præsenteres her har således et par fordele frem for andre metoder, der anvendes til oprensning af peroxidase-positive leukocytter. Da den er baseret på små blodprøver de opnåede celler repræsenterer situationen i omløb. På grund af den lille indledende prøvevolumen er nødvendig for protokollen fremgangsmåden er anvendelig til både humane og ikke-humane blod på trods af de artsspecifikke forskelle i overflod af neutrofiler. Faktisk var vi selv i stand til at anvende den beskrevne metode til indledende blod mængder så små som 50 pi (data ikke vist). Den lille blodprøve er nødvendig for metoden gør det også egnet til gentagen blod tilbagetrækning fra små forsøgsdyr eller til særlige medicinske anvendelser (f.eks nyfødte diagnose). Som than leukocyt berigelse er baseret på udtømningen af erythrocytter alle peroxidase-positive celler (neutrofiler, eosinofiler, monocytter) er inkluderet i den opnåede blandede leukocyt fraktion og kan separat analyseret ved hjælp af flowcytometri. Metoden er hurtig, pålidelig og har lave krav til kemikalier og instrumentering, hvilket gør protokollen egnet til flere videnskabelige miljøer.
Da neutrofiler nemt aktiveres et afgørende skridt i den beskrevne metode er den præcis justering af pH-værdien af de heri løsninger, der anvendes (PBS og HBSS, se trin 1.2 og 1.3 i protokollen afsnit). Endvidere inkubationstiden af blodcellerne med destilleret vand bør ikke være længere end 60 sekunder, før gendannelse normosmotic betingelser (se trin 2.2 af protokollen sektion. Den (næsten) fuldstændig fjernelse af opløsningsmiddel fra cellepelleten (trin 2.4) før tilsætning vand til den anden hypotonisk lyse er endnu et afgørende skridt som buffER rester vil mindske effektiviteten af hypotonisk lyse procedure. Et andet afgørende skridt henviser til anvendelsen af H 2 O 2 under APF farvning. Selvom den anvendte mængde ikke bør være cytotoksisk, bør kontrolleres celle vitalitet. Under vores undersøgelser vi typisk anvender farvestoffet 5,5 ', 6,6'-tetrachlor-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine iodid (JC-1) til påvisning af tidlige apoptotiske begivenheder.
Desuden er der et par begrænsninger i den beskrevne forenklede leukocyt berigelse metode. Mens teknikken kan anvendes på blodprøver fra flere arter (menneske, rotte og mus er blevet forsøgt), leukocyt beløb opnået efter lysis af erytrocytter afhænger af deres oprindelige overflod i blodet. Sidstnævnte bestemt varierer mellem arter 39 og er også afhængig af den inflammatoriske tilstand af tastede individ. Endvidere medens proceduren lysen kan gøres med op til enhundrede prøver parallelt de mellemliggende centrifugeringstrin udgør en begrænsning som, afhængigt af centrifugen anvendes, kun op 30 prøver kan behandles parallelt. Endvidere mens APF let detekterer HOCI og HOBr i nærvær af SCN -, halogeneringsmidlet aktivitet af MPO og EPO påvirker også til sidstnævnte pseudo-halogenid. Derved hypothiocyanite (- OSCN) dannes der ikke er i stand til at oxidere APF. En anden begrænsning kommer fra egenskaberne for APF farvestof, der anvendes til bestemmelse af HOCl- og HOBr-produktion af MPO og EPO. Som farvestoffet oxideres til fluorescein, kan farvningen ikke kombineres med fluorescerende antistoffer med et emissionsspektrum i samme område. Selvfølgelig eventuelle interferenser mellem APF-afledte fluorescens og signalet af yderligere fluorescerende signaler har skal kontrolleres og kompenseres for i flowcytometeret.
Ellers, hvis detektionen af halogenerende peroxidase aktivitet ikke omfanget af denstudere, efter anvendelse af erythrocyt udtømning metode andre analytiske metoder kan anvendes i stedet for APF. Som beskrevet hypotonisk lyse procedure fører kun til en delvis nedbrydning af erythrocytter og som alle leukocyt er stadig til stede i den opnåede blandede cellefraktion kun metoder, der tillader bør anvendes en enkelt celleanalyse. Metoder, som omfatter lysis af celler (f.eks Western plot analyse) vil ikke give pålidelige resultater. Den lille indledende prøvevolumen kan være en anden hindring for sådanne analysemetoder.
Vedrørende undersøgelsen af MPO (og EPO) i leukocytter ofte kun den generelle oxidant produktion af cellerne er rettet i stedet for specifikt at evaluere hæm peroxidase aktivitet 44,45. Desuden ofte ingen man forsøger at skelne mellem halogeneringsmidlet og peroxidase aktivitet MPO og EPO 46,47. Metoder, som afføder den kloring MPO aktivitet ved quantifying HOCl-afledte produkter som chlortyrosin ikke registrerer over-oxideret og / eller metaboliseres produkter og dermed ofte fører til en undervurdering af den virkelige HOCl-produktion 48. Endvidere har denne metode samt påvisning af HOCl-afledt 2-chloroethidium er også tidskrævende, kostbare analyseudstyr og omfatter lyse af celler 48-50 .Der er mange rapporter om nye farvestoffer til den specifikke bestemmelse af chloreringsmiddel MPO-aktivitet inden vitale celler 44,51,52. Alligevel til dato kun APF og dens beslægtede forbindelse hydroxyphenyl fluorescein (HPF) er kommercielt tilgængelige, og derfor rutinemæssigt anvendes i forskning 25,33.
Faktisk ved anvendelse af APF kunne vi vise, at chlorering MPO aktivitet ikke alene kan kvantificeres ved hjælp af isolerede enzym 53, men også ved at anvende farvestoffet til levende celler 26,33. Således ved at kombinere den hurtige leukocyt berigelse fra blod mikro-prøver anført ovenfor med enn APF-farvning vi udviklet en protokol, som er egnet til specifikt og samtidigt behandle halogeneringsmiddel aktivitet af MPO og EPO i alle peroxidase positive leukocytter, dvs. neutrofiler, monocytter og eosinofiler 32. Endvidere fremgangsmåden ikke kræver cellelyse, som tillader en bred række analytiske metoder, herunder flowcytometri og konfokal fluorescensmikroskopi. Endvidere har denne peroxidaseaktivitet farvning kan kombineres med anvendelsen af celleoverflademarkører, der tillader den specifikke analyse af leukocyt sub-fraktioner, afhængigt af videnskabelig opgave. Men det skal tages i betragtning, at de anvendte fluorescensmærkede antistoffer ikke interfererer med fluorescein-baserede fluorescenssignal anvendes til at kvantificere HOCl- og HOBr-afledt APF oxidation.
Sammenfattende denne fremgangsmåde kan tilvejebringe et nyt værktøj til at få mere indsigt i den fysiologiske rolle af halogeneringsmidlet peroxidaseaktivitet af det immunologiske reLevant blodafledte peroxidaser MPO og EPO, som stadig ikke godt forstået 8,20,23. Desuden i et dyr undersøgelse om leddegigt vi kunne for nylig konstatere, at denne protokol kan føre til evalueringen af MPO-afledte HOCI produktion som en ny klinisk markør ved kroniske inflammatoriske sygdomme (upublicerede data).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials/Equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | - |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | - |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g., 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | - |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | - |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450 x g |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400 x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1 M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | - |
References
- Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
- Henson, P. M.
- Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
- Kankaanranta, H., et al.
- Peng, S. L.
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
- Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
- Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
- Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
- Klebanoff, S. J.
- Klebanoff, S. J.
- Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
- Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
- Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
- van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
- Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
- Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
- Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
- Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
- Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
- Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
- Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
- Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
- Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
- Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
- Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
- Lanza, F.
- Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
- Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
- Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
- Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
- Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
- Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
- Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
- Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
- Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
- Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
- Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
- Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
- Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
- Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
- Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
- Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).
