Protocol
Questo studio è in accordo con l'Università Nazionale di Singapore Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (protocollo approvato senza. R15-0225).
1. Preparazione chirurgica del modello animale
- cannulazioni nave
- Anestetizzare a ratti maschi Sprague-Dawley (6 - 7 settimane) di pesatura (203 ± 20) g con ketamina (37,5 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) cocktail attraverso intraperitoneale (ip) iniezione (2 ml / kg) . Non ricoprire l'ago o rimuoverlo dalla siringa dopo l'iniezione.
- Una volta che l'animale è stato anestetizzato (confermata dalla punta pizzicare), posizionarlo su una piastra elettrica per mantenere la sua temperatura corporea a 37 ° C. radere delicatamente i capelli sulla scapole, collo dell'utero anteriore, basso addome, zampa posteriore mediale e sacco scrotale. frenare delicatamente le gambe utilizzando nastri di carta adesiva.
- Eseguire tutte le procedure chirurgiche con le forbici di microdissezione e pinze ad angolo, mentre la visualizzazione attraversouno stereomicroscopio. Mettere tutti gli strumenti chirurgici taglienti su un vassoio resistente alla perforazione per evitare lesioni durante l'intervento chirurgico.
- Scrub tutti i siti chirurgici 3 volte con alternanza di iodio e il 70% di alcool prima di eseguire l'incisione. Lavare tutti i cateteri con 30 / soluzione di eparina-salina ml UI.
- Fare A 1 - 1,5 centimetri incisione cutanea mediana sulla scapole usando un paio di forbici chirurgiche sopra la vena giugulare destra. Separare la fascia per via smussa per esporre la vena giugulare e cannulate con un tubo di polietilene (PE-50) riempita con eparina-salino con 5-0 punti di sutura in seta. Infondere anestesia supplementare quando necessario (1/3 a 1/2 della dose iniziale, per via endovenosa (iv)) durante tutto il corso della chirurgia e dell'esperimento.
- Eseguire tracheostomia per mantenere la pervietà delle vie aeree. Fare un 1 - cm un'incisione 1.5 nella zona cervicale anteriore. Incannulare la trachea utilizzando un tubo di polietilene (PE-205) con 2-0 suture di seta per fissare il catetere in posizione.
- Monitorare la pressione sanguignaattraverso incannulamento a livello dell'arteria femorale. Fare un 1 - cm un'incisione 1.5 sulla superficie mediale sinistro della zampa posteriore. Separare l'arteria femorale per via smussa. Incannulare l'arteria femorale con un tubo di polietilene (PE-10) riempito di eparina-salina utilizzando 5-0 suture di seta.
- Cremaster muscolare Preparazione e flusso di visualizzazione
- Inserire una sutura 5-0 seta attraverso l'apice del sacco scrotale per estenderlo. Fare un'incisione lungo la superficie ventrale del sacco scrotale. Regolarmente applicare soluzione calda isotonica (37 ° C, pH 7,4) al muscolo esposto.
- Rimuovere circostante tessuti connettivi attentamente e accuratamente con un applicatore con punta di cotone.
- Inserire una sutura 5-0 seta attraverso l'apice del muscolo cremastere. Tagliare la sutura in due parti di uguale lunghezza e un nodo su ogni lato. Tagliare il muscolo tra i due nodi e si estendono su una piattaforma di plexiglas trasparente personalizzato tirando delicatamente la sutura. fissarel'estremità della sutura sulla piattaforma con l'aderenza blu.
NOTA: la rimozione completa dei circostante tessuto connettivo è di fondamentale importanza per ottenere ottimale contrasto dell'immagine. - Ripetere 1.2.3 passo fino al 5 a 6 fissazioni sono fatti. Rimuovere con attenzione il muscolo cremastere dall'epididimo utilizzando alte temperature cauterizzazione. Superfuse soluzione isotonica calda al muscolo esposto per prevenire la disidratazione del tessuto.
- Circondano il muscolo cremastere con pezzi piegati di garza. Coprire il muscolo esposta con un film di polivinile. I pezzi di garza con il film formano un bacino poco profondo per tenere soluzione isotonica calda per l'obiettivo dell'acqua immersione microscopio (Figura 1A).
- Trasferire l'animale sul palco animale di un microscopio intravitale (Figura 1C). Collegare l'incannulamento arterioso ad un sistema di acquisizione dati fisiologici per il monitoraggio continuo della pressione (Figura 1E).
- Mantenere la temperat muscolareure a 35 ° C con un elemento riscaldante allegata sotto la piattaforma animale (Figura 1B). Inserire una sonda di temperatura vicino al muscolo per fornire un feedback negativo al controllore potenza dell'elemento riscaldante (Figura 1D).
- Lasciare l'animale sulla scena per 15 minuti per equilibrare con l'ambiente.
- Visualizza il flusso di sangue al microscopio intravitale con un obiettivo di acqua-immersion 40X e un condensatore nel tempo.
- Scegliere un arteriole ramificati (<60 micron) basata su una chiara focalizzazione e il contrasto tra il nucleo RBC, CFL e dalle pareti del recipiente, al fine di concentrarsi microscopio sul piano diametrale del vaso sanguigno. Ruotare la fotocamera montata sul microscopio per allineare la parete del serbatoio verticale.
- Registrare il flusso di sangue utilizzando una videocamera ad alta velocità ad un frame rate di 3.000 / sec per 1 sec. Salvare il video registrato in formato AVI non compresso in scala di grigi a 8 bit per preservare la qualità delle immagini.
NOTA: Si raccomanda un frame rate minimo di registrazione di 3.000 fotogrammi / sec per garantire che la misura CFL può essere eseguita almeno una volta al RBC in condizioni di flusso arteriolare fisiologiche. - Utilizzare un filtro blu con trasmissione di picco alla lunghezza d'onda di 394 nm e banda passante spettrale 310 - 510 nm per aumentare il contrasto tra i globuli rossi e plasma.
NOTA: Assicurarsi che lo spettro di luce che passa attraverso il filtro blu dalla sorgente luminosa microscopica (lampada alogena 100 W) è di bassa intensità della luce per evitare qualsiasi potenziale danno tissutale. - Alla fine dell'esperimento, eutanasia l'animale con una overdose di pentobarbital sodico.
Analisi 2. Immagine
- Pre-elaborazione per la misura della larghezza CFL
- Aprire MATLAB ed eseguire il file 'CFL_pre.m'. (Questo ed altri file MATLAB può essere trovato nelip "> Supplemental MATLAB Archive.)
- Fare clic su 'Apri file' per selezionare il file video da analizzare.
- Regolare il dispositivo di scorrimento 'rotazione' di allineare le pareti dei vasi in verticale.
NOTA: Gli utenti possono visualizzare le linee della griglia assistenza per l'allineamento nave selezionando il pulsante di opzione 'griglia su', e regolare il livello di zoom dell'immagine facendo scorrere il cursore 'Zoom'. - Fare clic sul pulsante 'Conferma Modifica' per confermare l'allineamento nave.
- Fare clic sul pulsante 'Imposta ROI per ritagliare' per definire la regione di interesse (ROI). L'immagine allineata verrà visualizzato in una finestra pop-up. Regolare l'obiettivo rettangolare sull'immagine, e fare doppio clic per confermare il ROI. Ignorare questo passaggio se non è richiesto il ritaglio dell'immagine.
NOTA: includere solo una singola nave in ROI per analizzare la larghezza CFL dalla nave. Fare clic sul pulsante 'Reset immagine' per ripristinare l'immagine alla sua forma originale, se necessario. - Clicca il9; Estrarre 'pulsante per estrarre tutti i fotogrammi video modificati in immagini po' mappa consecutivi (8-bit in scala di grigi 'immagini in formato bmp'). Le immagini estratte possono essere trovate nella cartella con lo stesso nome del file video selezionato.
- La misura della larghezza CFL
- Aprire MATLAB ed eseguire il file 'CFL_measure.m'.
- Fare clic su 'Seleziona cartella' per selezionare la cartella contenente le immagini estratte.
- Fare clic sulla cartella contenente le immagini e cliccare su 'Seleziona cartella'. Il primo fotogramma immagine nella cartella verrà caricato e mostrato nel pannello 'Scala di grigi immagine', insieme con il suo colore grigio istogramma intensità nel pannello 'immagine Istogramma'.
- Selezionare la cornice immagine desiderata dalla casella di riepilogo per effettuare l'analisi, in caso contrario verrà selezionato il primo fotogramma dell'immagine.
- Fare clic su 'Trova nave Walls' per identificare la parete del vaso interno nell'immagine, che è determinata nel punto in cui illuce profilo di intensità transiti di punta dal buio alla luce più di due pixel.
- Controllare 'filtro mediano' applicare un filtro mediano l'immagine per ridurre il rumore 'sale e pepe'.
- Controllare 'Contrasto automatico' per regolare l'intensità dell'immagine digitale per migliorare il contrasto dell'immagine.
- Selezionare un algoritmo di soglia nella casella di riepilogo che determina automaticamente un valore soglia (τ) che divide i livelli di grigio in due classi - pixel bianchi con livelli di grigio sopra τ (CFL), e pixel neri con livelli di grigio inferiori τ (core RBC).
NOTA: Come metodo alternativo, utilizzare soglia manuale se nessuno di algoritmi automatizzati-soglia fornisce un adeguato soglia immagine. Fare clic sul pulsante 'Manuale' radio e regolare il cursore per definire il valore soglia manuale. - Per misurare la variazione spaziale delle larghezze CFL, inserire la risoluzione in pixel nella casella 'Pixel Resolution' (la risoluzionecon questa configurazione sperimentale era 0,42 micron / pixel).
- Fare clic sul pulsante 'Calcola' per ottenere la variazione spaziale delle larghezze CFL. Fare clic su 'Esporta .csv' per esportare i dati di larghezza CFL in forma di tabelle.
- Per misurare la variazione temporale delle larghezze CFL ad una specifica linea di analisi lungo il vaso, cliccare sul pulsante di opzione 'temporale Variation' e inserire le informazioni frame rate (il tasso di frame utilizzato in questa configurazione sperimentale era 3.000 fotogrammi / sec).
- Inserisci il primo fotogramma e l'ultimo fotogramma delle immagini per l'analisi dei 'Frame Start' e scatole 'ultimo fotogramma', rispettivamente.
- Selezionare la posizione della linea di analisi lungo il vaso facendo scorrere il 'Analisi Line' barra di scorrimento. Conferma la posizione della linea di analisi, che è illustrato sia sul 'immagine in scala di grigi' e 'immagine binaria'.
- Fare clic su 'Calcola' per ottenere la variazione temporale delle larghezze CFL. Click 'Export .csv' per esportare i dati di larghezza CFL in forma di tabelle.
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Representative Results
La visualizzazione del CFL in vivo dipende in larga misura le preparazioni chirurgiche dell'animale. eccessiva perdita di sangue o la durata intervento chirurgico esteso possono sottoporre l'animale a urti e le aberrazioni del flusso sanguigno. Mantenimento della temperatura del tessuto utilizzando una piastra elettrica, nonché una piattaforma personalizzata durante l'intervento chirurgico e esperimento è cruciale per mantenere le condizioni fisiologiche del ratto. Utilizzando una lampada alogena da 100 W nel sistema microscopio, nessun danno tissutale discernibile è stata osservata anche alla fine dell'esperimento.
La figura 2A mostra un tipico flusso RBC attraverso un arteriole non ramificato nel muscolo di ratto cremastere, dove il CFL può essere osservata tra il nucleo RBC e la parete del serbatoio interno (Figura 2C). Un buon contrasto tra questi componenti durante l'esperimento è fondamentale per garantire la precisione delle misure di larghezza CFL. La fase iniziale di analisi dell'immagine comporta larilevazione della parete del vaso interno. Con l'acquisizione del profilo di intensità della luce lungo la linea di analisi perpendicolarmente alla nave, la posizione è approssimata al picco che transita dal buio alla luce più di due pixel (Figura 2b).
Come globuli rossi e CFL possiedono diversi trasmissione della luce, la differenza nei livelli di grigio può essere suddivisa in due classi (immagine binaria). Tuttavia, l'identificazione di un valore di soglia preciso tra i due picchi nell'istogramma dell'immagine può essere limitato da una scarsa qualità dell'immagine e contrasto (Figura 3A). Per migliorare il contrasto tra RBC e CFL, un filtro blu può essere utilizzato (Figura 3B). Questo è anche evidente in figura 4, in cui i confini del nucleo RBC possono essere più accuratamente identificate con l'uso di un filtro blu. Inoltre, la selezione di algoritmo thresholding 20-23 può influenzare la misura della larghezza CFL (Figura4). E 'evidente nella figura 4A che i diversi algoritmi di thresholding provocato diversi confine nucleo RBC identificato, che potrebbe a sua volta portare a misurazioni errate CFL. Per meglio illustrare l'influenza dell'algoritmo thresholding sulla misura della larghezza CFL in Figura 4B, i profili spaziali per le larghezze CFL ottenuti utilizzando diversi algoritmi di thresholding sono mostrati in Figura 5 e riassunti in Tabella 1.
Figura 1:. Intravitale sistema microscopico e Cremaster preparazione muscolare A:. Chirurgicamente esteriorizzato muscolare di ratto cremastere B: Su misura piattaforma con elementi riscaldanti in commercio del muscolo cremastere e mantenendo la temperatura a 35 ° C. C: sistema microscopico con cusmata associati animale da palcoscenico e la macchina fotografica ad alta velocità per la visualizzazione dei flussi di sangue del microcircolo nella cremaster muscolo D:. regolatore di temperatura feedback negativo e alimentazione E:. sistema di acquisizione dati per il monitoraggio fisiologico pressione continua. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Image Processing per la determinazione della parete del serbatoio posizione e la larghezza CFL A:.. Tipica immagine in scala di grigi del flusso di RBC in un arteriola (diametro del vaso = 52 micron) B: profilo di intensità della luce lungo la linea di analisi (linea continua nel pannello A) . C: risultato rappresentativo di misura CFL lungo il vaso. Ilfrecce continue e tratteggiate indicano la parete del serbatoio interno e il bordo esterno del nucleo RBC rispettivamente. (LWB & RWB: sinistra e destra nave muro di cinta, LCB & RCB: destra e sinistra RBC nucleo confine) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:.. Miglioramento del contrasto delle immagini con un filtro blu ottico d'immagine istogramma delle immagini in scala di grigi quelli senza (A) e con filtro blu (B) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
figure 4: RBC core Larghezza determinato utilizzando cinque diversi algoritmi soglia confini del nucleo RBC e parete dei vasi sovrapposto sulle immagini in scala di grigi nella figura 3.. (riga in alto (A): senza filtro blu, riga inferiore (B): con filtro blu) utilizzando (da sinistra a destra) il metodo di Otsu, il metodo minimo, il metodo Intermode, iterativo metodo di selezione (ISODATA) e soglia entropica fuzzy (Shanbhag). Le linee continue e tratteggiate indicano la parete del serbatoio interno e il bordo esterno del nucleo RBC, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Spatial Variazione CFL Larghezza larghezze CFL corrispondente alla figura 4B lungo la sinistra (A).e destro (B) le pareti dei vasi, rispettivamente. (D: distanza in diametro del vaso) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: valori soglia e CFL Ampiezza dati in Figura 5. * p <0,001: una differenza significativa dal metodo di Otsu. † p <0.001: differenza significativa da sinistra. Le analisi statistiche sono state eseguite usando due code t-test non appaiati.
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Discussion
La misura della larghezza CFL è essenziale per una migliore comprensione delle emodinamica del microcircolo. In particolare, la misurazione delle larghezze CFL è stata eseguita in mesenterica 6, spinotrapezius 24 e cerebrali 25 microcircolazione. La misura convenzionale in vivo larghezze CFL è stato limitato a stime mediante ispezione manuale dei fotogrammi video registrati. Le misurazioni manuali necessari la media di diversi fotogrammi video successivi prima di identificare visivamente i confini del nucleo e dalle pareti del recipiente RBC 15,16. In un altro studio, isotiocianato di fluorescina (FITC) marcati con globuli rossi e rodamina-B isothiocynate (RITC) plasma l'etichetta sono stati utilizzati per determinare la larghezza media CFL a Cat microvasi cerebrali 25. Questi metodi di misurazione precedenti richiedono molto tempo e richiedono passaggi aggiuntivi per la marcatura fluorescente, che limita la risoluzione spaziale e temporale del wi CFLmisurazione DTH. Al contrario, accoppiando registrazioni telecamera ad alta velocità per un'efficace segmentazione e analisi d'immagine, la tecnica dimostrata qui consente la quantificazione delle variazioni spazio-temporali del CFL con una risoluzione spaziale (0,42 micron) di un ordine inferiore alla dimensione di un RBC e una risoluzione temporale di 1 / 3.000 sec.
La corretta preparazione chirurgica del muscolo cremastere è critico nel determinare la precisione delle misure di larghezza CFL. In particolare, la rimozione completa dei tessuti connettivi adiacenti è indispensabile per garantire una buona focalizzazione delle arteriole nel muscolo cremastere. Inoltre, la risoluzione temporale e spaziale della misura dipende dalle microscopio e telecamera specifiche. Mentre un obiettivo di ingrandimento maggiore può migliorare la risoluzione spaziale, riduce il campo visivo, che a sua volta limita la lunghezza imbarcazione ottenibile per quantificare la variazione spaziale della larghezza CFL. Pertanto, l'microscopiconfigurazioni c possono essere modificati secondo la specifica applicazione della tecnica.
Immagine segmentazione è un altro fattore importante per la precisione della misura della larghezza CFL. Tra le varie tecniche sviluppate, immagine della soglia in base al livello istogramma grigio fornisce un approccio semplice ed efficace per la segmentazione e l'analisi delle immagini. Pertanto, oggetti in primo piano vengono estratti dallo sfondo in base alla differenza nei loro livelli di grigio. Nel caso ideale, l'istogramma dell'immagine sarà bimodale e un valore di soglia al fondo della valle è banale. Tuttavia, in vivo immagini sperimentali non sempre mostrano tali profili di livello in scala di grigi. I nostri risultati hanno dimostrato come la qualità dell'immagine e il contrasto possono influenzare il processo di segmentazione delle immagini. L'uso di un filtro blu ottica significativamente migliorato il contrasto tra i globuli rossi e il plasma in una arteriole (figura 3), e sembra essere essenziale quando che appg la soglia istogramma-based per la misura della larghezza CFL indipendentemente algoritmi (Figura 4). Ciò si traduce in un netto istogramma dell'immagine bimodale, che consente di identificare in modo efficace il valore di soglia. Tuttavia, va notato che anche con un istogramma bimodale ottenuti dalle immagini in vivo, una varianza estremamente disuguale dei due picchi (maxima locale) e un'ampia valle (minimo locale) dell'istogramma possono ancora influenzare la selezione soglia (Tabella 1 ). Pertanto, la selezione di un algoritmo thresholding appropriata deve essere esaminato in base alla qualità di immagine e gli utenti devono considerare le limitazioni di ogni algoritmo soglia per la migliore idoneità quantificare larghezze CFL.
Poiché le larghezze CFL sono largamente dipendenti dalle condizioni di flusso, della pressione arteriosa continua durante tutto il corso dell'esperimento è essenziale. Al fine di determinare le condizioni di flusso locale,il tasso pseudoshear del flusso sanguigno può essere calcolata misurando la velocità media del flusso nel vaso sanguigno 5.
In sintesi, i protocolli per la preparazione chirurgica di un muscolo di ratto cremastere e analisi d'immagine quantitativa descritti qui sono stati utilizzati per acquisire informazioni quantitative sulla variazione dinamica delle larghezze CFL in vivo. Le sfide principali nel garantire l'accuratezza delle misure di larghezza CFL includono una corretta preparazione chirurgica del muscolo e segmentazione delle immagini, entrambi i quali sono stati affrontati in precedenza. Questa tecnica può essere facilmente adattato ad altri studi microcircolatori per indagare il emoreologici e aberrazioni emodinamici in varie condizioni fisiologiche e patologiche. Di conseguenza, questi risultati contribuiscono al futuro sviluppo di approcci terapeutici microvascolari e intervento clinico.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
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