Protocol
1. processável PANI Síntese
- Dissolve-se anilina (1 ml, 11 mmol) completamente em 60 ml de clorofórmio num balão de 250 ml de fundo redondo. Agita-se a 600 rpm durante 5 min e arrefecer a 0-5 ° C com gelo. Isso normalmente leva 15-20 min (Figura 2A).
- Adicionar sulfonato de sódio dodecil benzeno (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) para a solução de anilina em um balão de fundo redondo, enquanto se agitava a 600 rpm.
- Dissolver persulfato de amónio (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) em 20 ml de água e adicionar tudo isso gota a gota ao longo de 30 min para evitar o superaquecimento da reação.
- Efectua-se a reacção a 0-5 ° C durante 24 h, e permitir-lhe atingir a temperatura ambiente durante mais 24 h.
- Observe-se a mistura de reacção inicialmente transformar branca leitosa após 15 min, em seguida, castanho escuro após 2 horas, e, finalmente, para verde escuro após 24 h (Figura 2B-F).
- Filtra-se a solução PANI-NaDBS com um funil de Buchner. Misturar com 80 ml de clorofórmio e 120 ml de água, em queeparation funil (Figura 2G).
- Incubar a solução durante 24 horas à temperatura ambiente e recolher o PANI verde escuro a partir do funil de separação, deixando NaDBS que não reagiram e APS no sobrenadante aquoso.
2. A mistura PANI-sonda e irradiação UV
- Diluir solução PANI 10x com clorofórmio-água (1: 3 v / v) e misturar 200 ul de PANI diluída com 6,4 pmol de oligonucleótidos de DNA sonda por agitação suave durante 15 min num tubo de microcentrífuga.
- Irradiar a solução de ADN com 1.200 PANI μJ / cm 2 de UV em um reticulador durante 2 min. É crítico que a exposição UV é limitado ao valor indicado. A exposição prolongada à radiação UV compromete a mudança de fluorescência no PANI, provavelmente devido à ligação covalente cruzada de PANI e ADN.
- complexos por centrifugação a 17000 xg durante 6 minutos, e lava-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Sedimentar novamente, e re-suspensão em PBS.
3. Hybridization de PANI-sonda
- Adicionar 8 uL de 100 uM oligonucleótidos de ADN complementares ou ácidos nucleicos alvo com 200 ul de complexos PANI-sonda.
- Realizar hibridação por mistura de balanço solução durante 15 min a 40 ° C.
- Agregar as complexos PANI por centrifugação a 17000 xg durante 6 min. Lavar com PBS e re-suspensão em água.
4. Emissão constante Medição Estado de fluorescência
- Adicionar PANI de diferentes tratamentos para uma microplaca de 96 poços e medir a emissão de fluorescência na gama de 270-850 nm por excitação a 250 nm. Um pico de emissão para PANI devem ser observadas cerca de 500 nm.
5. Medição da Microscopia de Fluorescência duplex hibridado
- Gota revestimento PANI sobre uma lamela de vidro de borosilicato e seco a 40 ° C durante 48 h.
- Adicionar sonda (8 uL de 100 uM) num filme de PANI e secou-se irradiar com luz UV (1200 μJ / cm2
- Lava-se a película PANI-sonda com PBS e seco a 40 ° C durante 48 h.
- Realizar a hibridação durante 15 min pela adição de ácidos nucleicos alvo. Esta poderia ser uma amostra biológica, ou um oligonucleótido alvo de controlo (8 uL de 100 uM). Siga com uma lavagem PBS.
- Obtenção das imagens fluorescentes em aumento de 40 vezes, com um filtro de passagem longa de 500 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 2A capta a configuração de reacção no início do processo de polimerização, isto é, antes da adição APS. A formação de micelas é o passo inicial na reacção de síntese de processo de PANI ocorre na interface micelar. A Figura 2B mostra uma solução leitosa após 5 min. 30 min após a APS é adicionada a reacção se vira para uma cor ligeiramente castanha. A Figura 2C mostra a alteração de cor associada com a formação de oligómeros. A Figura 2D mostra uma cor castanha escura depois de 4 h, indicando uma elevada concentração de cadeia curta PANI, consistente com uma reacção muito lenta. Finalmente, depois de 48 h uma solução verde escura de alta PANI peso molecular pode ser observado que é disperso em clorofórmio-água (Figura 2E). A Figura 2F mostra uma solução PANI bem dispersa, homogénea na ampola de decantação, sem separação de fases.
(Figura 2) ou sobre a superfície de filmes revestidos por gota (Figura 3). A fluorescência basal de filmes PANI é relativamente baixa (Figura 3A). ADN sonda é adicionada sobre a película, e deixou-se secar à temperatura ambiente. Quando as formas de complexo de ADN-PANI esperados, um aumento intenso na fluorescência pode ser observado (Figura 3B). afluxo de elétrons a partir do DNA carregado negativamente provoca maior densidade de elétrons em moléculas PANI, causando o aumento de fluorescência. Após a hibridação induzida dissociação do duplex alvo-sonda, PANI fluorescência regressa a intensidade basal (Figura 3C). A dissociação é causado por alterações na estrutura do DNA após hibridação que a interação compromisso PANI-sonda. Os ácidos nucleicos de detecção com esta tecnologia também pode ser realizada directamente na emulsão (Figura 3D). Uma vantagem de utilizar a emulsão sistema baseado é a compatibilidade com instrumentos leitor de placas. Isto permite uma medição muito precisa da PANI fluorescência, e evita as dificuldades causadas por irregularidades na película de revestimento. Um sensor baseado no formato PANI emulsão é altamente específica. A introdução de um único desfasamento (mm) de oligo-alvo não consegue restaurar basal de fluorescência PANI (Figura 3D).
Figura 1. Fixação de sondas mediadas pela exposição aos raios UV aumenta PANI fluorescência. A hibridização de ácidos alvo resultados nucleicos no desapego de PANI, e reversão do polímero a fluorescência basal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
iles / ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
Figura 2. Síntese de PANI processável. (A) início da reacção de polimerização. (B) Depois de 5 minutos quando APS é adicionado lentamente. (C) 30 min após a adição APS. (D) Depois de 1 hr. (E) Após 4 hr. (F) do produto verde após 48 horas de reação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Utilização de PANI fluorescência para detectar hibridização de ácido nucleico. Película (A) PANI criado através gota-revestimento em vidro de borossilicato, seguido por secagem durante 48 horas a 40 ° C. (B) de fluorescência PANI após a imobilização da sonda. (C)Após a hibridação do ADN alvo com sondas PANI-imobilizadas. (D) de fluorescência a 500 nm de emulsão de PANI antes e depois da hibridação com qualquer incompatibilidade complementar ou simples (mm) oligonucleotídeos alvo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Um sensor baseado em ácidos nucleicos de PANI requer a solubilização do polímero em água, a fim de interagir com o DNA e RNA. A dispersão de PANI em água é realizada usando tensioactivos, formando micelas, como relatado previamente 8. Além dos NaDBS utilizados aqui outros agentes tensioactivos aniónicos, como éster de dodecilo de ácido 4-sulfophthalic, tensioactivos não iónicos tais como etoxilato de nonil-fenol, ou tensioactivos catiónicos como brometo de cetiltrimetil amónio também pode ser utilizado para a síntese de processável PANI 9,10. A síntese aqui descrita começa com uma proporção fixa da NaDBS tensioactivos aniónicos adicionados à anilina monómero a uma razão molar 2: 1. Os NaDBS surfactante tem um equilíbrio hidrófilo-lipófilo alta (HLB) permitindo a polimerização de monómero emulsionado anilina em clorofórmio-água pelo que estabelece o equilíbrio entre as gotículas de óleo micelares poliméricos e água. O APS oxidante é então adicionada a uma razão molar 1: 1,5 para produzir micelas de grdevido PANI, onde o núcleo interior actua como um agente de nucleação. Isto leva a cabeça para fixação da cauda de monômeros, ao mesmo tempo mantendo PANI em equilíbrio dinâmico com a envolvente solvente 11,12. A reacção prossegue de uma maneira controlada até polímeros de elevado peso molecular são formados 13. Este protocolo irá gerar partículas que variam entre 50 nm e 1500 nm 3. Fundamental para a criação de uma reacção onde PANI cresce lentamente ainda permanece solúvel é a adição lenta da APS oxidante, baixa temperatura, e a ausência de ácidos protónicos fortes. Alguns optimização das proporções dos reagentes podem ser necessários para gerar bem dispersa PANI. PANI sintetizados por este método é estável durante mais de um ano, como uma emulsão. diluição excessiva deve ser evitada, pois o equilíbrio HLB da dispersão pode ser interrompida, causando PANI a precipitar. de mistura de alta velocidade pode ajudar a manter o PANI em solução. solubilidade perfeita não é desejável, uma vez que impediria formati pelotasna, que é um critério importante para os procedimentos de hibridação de um sensor à base de emulsão.
Depois de gerar disperso PANI, oligos de sondas de ADN são ligados à matriz do polímero através da interacção electrostática. Interação de grupos imina PANI e os fosfatos de a espinha dorsal do DNA ocorrem espontaneamente. Interações ácido nucleico PANI-não-específicas complicar a detecção de analitos em amostras biológicas complexas 14. Para alcançar a associação entre PANI e ADN-sonda que pode ser distinguido de interacções espontâneas, o complexo é irradiada com raios UV. A criação de porções polares induzidas pela localização de carga accionada por UV aumenta a molhabilidade da superfície do polímero 15. A exposição ideal é de cerca de 2 min, e pode ser confirmado se PANI fluorescência a 500 nm é aproximadamente 5X elevada (Figura 3). Sobre-exposição do complexo de UV pode levar à ligação cruzada entre PANI e DNA, o que ao contrário de interacções electrostáticas, gamaS não causar uma elevação de PANI fluorescência.
O processo de geração de sensores é fácil e rápida. A reacção de polimerização é completada depois de 48 horas seguido de 24 horas para separar a partir de oxidante que não reagiu e NaDBS. Síntese terá de ser efectuada com pouca frequência como a quantidade de PANI estoque produzido pelo protocolo neste artigo é muito grande em relação à quantidade utilizada num sensor. emulsão de PANI em altas concentrações é estável; No entanto, qualquer diluição que ocorre durante a fixação da sonda pode levar à precipitação de PANI, comprometer o desempenho do sensor. O uso imediato de complexos PANI-sonda para detectar alvos irá evitar este problema. Juntos, a criação de complexos de hibridização e pode ser feita em menos de uma hora. filmes PANI-sonda são mais estáveis e podem ser usados depois de armazenamento a longo prazo. Uma limitação desta tecnologia de sensor é que ele não é altamente passível de multiplexação. Cada evento de detecção deve ser levada a cabo num tubo separado. filmes podemproporcionar uma melhor formato para multiplexação de diferentes sondas poderiam ser vistos em diferentes regiões de um filme. Uma amostra pode ser aplicada sobre a matriz de ponto, e a fluorescência em cada ponto usada para avaliar a expressão de um gene diferente.
O mecanismo de detecção descrito aqui fornece várias vantagens sobre outros sistemas. Relatórios de detecção de ácidos nucleicos através de um mecanismo de dissociação envolvendo PANI contar com fluoróforos ligados a sondar oligos de DNA 5. Outras estratégias usar ligação covalente de sondas, que não conseguem distinguir diferenças de pares de base individuais em ácidos nucleicos alvo 16-17. A omissão de rotulagem ou outros modos secundários de detecção nesta tecnologia cria oportunidades para usar outras propriedades de PANI electro-ativa. A resposta do sensor, portanto, poderia ser estendido para a medição das propriedades eletroquímicas alterados pela dinâmica de fixação-descolamento do sensor. Labs que adotam esta técnica vai encontrar as sEnsor sistema para ser rentável para além rápido e simples.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
