Protocol
1. traitables PANI Synthèse
- Dissoudre l'aniline (1 ml, 11 mmol) complètement dans 60 ml de chloroforme dans 250 ml de ballon à fond rond. Agiter à 600 rpm pendant 5 min et laisser refroidir à 0-5 ° C avec de la glace. Cela prend habituellement 15 à 20 minutes (figure 2A).
- Ajouter dodécylbenzène sulfonate de sodium (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) à la solution d'aniline dans un ballon à fond rond, sous agitation à 600 tours par minute.
- Dissoudre le persulfate d'ammonium (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) dans 20 ml d'eau et ajouter tout cela goutte à goutte sur 30 min pour éviter la surchauffe de la réaction.
- Effectuer la réaction à 0-5 ° C pendant 24 heures, et lui permettre d'atteindre la température ambiante pendant 24 h.
- Observer le mélange réactionnel d' abord tourner blanc laiteux après 15 min, puis brun foncé au bout de 2 h, et enfin au vert foncé après 24 h (figure 2B-F).
- Filtrer la solution PANI-NaDBS avec un entonnoir de Büchner. Mélanger avec 80 ml de chloroforme et 120 ml d'eau en tanta séparation entonnoir (figure 2G).
- Incuber la solution pendant 24 heures à la température ambiante et recueillir le PANI vert foncé de l'entonnoir de séparation, ne laissant pas réagi NaDBS et APS dans le surnageant aqueux.
2. PANI-sonde de mélange et Irradiation UV
- Diluer solution PANI 10x avec du chloroforme-eau (1: 3 v / v) et mélanger 200 pi de PANI dilué avec 6,4 pmol d'oligonucléotides d'ADN de la sonde par doux balancement pendant 15 min dans un tube de microcentrifugation.
- Irradier la solution de PANI-ADN avec 1 200 pJ / cm 2 d'un agent de réticulation UV pendant 2 min. Il est essentiel que l'exposition aux UV est limitée au montant indiqué. Une exposition prolongée aux UV compromet le changement de fluorescence dans PANI, probablement due à une reticulation covalente de PANI et l'ADN.
- complexes à pellets par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 minutes et laver avec du tampon phosphate salin (PBS). Pellet à nouveau, et remettre en suspension dans du PBS.
3. Hybridization de PANI-sonde
- Ajouter 8 ul de 100 uM d'oligonucléotides d'ADN complémentaire ou cibler des acides nucléiques à 200 ul de complexes PANI-sonde.
- Effectuer l'hybridation en basculant mélange de solution pendant 15 min à 40 ° C.
- Pellet les complexes de PANI par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 min. Laver avec du PBS et re-suspension dans l'eau.
4. Emission Steady Mesure État Fluorescence
- Ajouter PANI de différents traitements dans une microplaque à 96 puits et mesurer la fluorescence d'émission dans la gamme 270-850 nm par excitation à 250 nm. Un pic d'émission pour PANI devrait être observée autour de 500 nm.
5. Fluorescence Microscopy Mesure de hybridée Duplex
- Baisse manteau PANI sur une lamelle de verre borosilicate et sec à 40 ° C pendant 48 heures.
- Ajouter la sonde (8 pi de 100 uM) sur un film PANI séché et irradier avec une lumière UV (1200 pJ / cm 2
- Lavez le film PANI-sonde avec du PBS et sèche à 40 ° C pendant 48 heures.
- Effectuer l'hybridation pour 15 minutes en ajoutant des acides nucléiques cibles. Cela pourrait être un échantillon biologique ou d'un oligonucléotide cible de commande (8 ul de 100 uM). Suivi avec un lavage PBS.
- Obtenir les images fluorescentes à 40X, avec un filtre à long passe de 500 nm.
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Representative Results
Figure 2A capture la configuration de réaction au début du processus de polymérisation, à savoir, avant l' addition APS. La formation de micelles est l'étape initiale dans la réaction de synthèse processus PANI se produit à l'interface micellaire. La figure 2B montre une solution laiteuse après 5 min. 30 minutes après l' APS est ajouté la réaction se transforme en une couleur légèrement brune. Figure 2C représente le changement de couleur associée à la formation d'oligomères. Figure 2D montre une couleur brun foncé au bout de 4 heures, ce qui indique une forte concentration de chaîne courte PANI, en accord avec une réaction très lente. Finalement , après 48 heures une solution vert foncé de PANI de haut poids moléculaire peut être observé que l' on disperse dans le chloroforme-eau (figure 2E). Figure 2F montre un bien dispersée, solution de PANI homogène dans l'entonnoir de séparation, sans séparation de phase.
(Figure 2) ou sur la surface des films d'abandon enduit (Figure 3). La fluorescence de base des films PANI est relativement faible (figure 3A). ADN sonde est ajoutée sur le film, et on le laisse sécher à la température ambiante. Lorsque les formes complexes d'ADN-PANI attendus, une augmentation intense de la fluorescence peuvent être observées (figure 3B). Electron afflux de l'ADN chargé négativement provoque la densité d'électrons dans les molécules plus PANI, provoquant l'augmentation de fluorescence. Après hybridation , la dissociation induite par du duplex sonde-cible, la PANI fluorescence retourne à l' intensité de base (figure 3C). Dissociation est causée par des changements dans l'ADN squelette lors de l'hybridation que le compromis PANI-sonde interaction. Acides nucléiques Sensing avec cette technologie peut également être effectuée directement en émulsion (Figure 3D). Un avantage d'utiliser l'émulsion système à base est la compatibilité avec les instruments de lecture de la plaque. Cela permet une mesure très précise de PANI fluorescence, et évite les difficultés causées par des irrégularités dans le revêtement de film. Un capteur à base de PANI-en format d'émulsion est très spécifique. L'introduction d'un seul décalage (mm) dans l'oligo cible ne parvient pas à rétablir la PANI basale fluorescence (Figure 3D).
Figure 1. Fixation des sondes médiées par l' exposition aux UV augmente PANI fluorescence. Hybridation de cibles acides nucléiques résultats dans le détachement de PANI, et la réversion du polymère à fluorescence basale. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette silhouette.
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Figure 2. Synthèse de PANI traitable. (A) Début de la réaction de polymérisation. (B) Après 5 min quand APS est ajouté lentement. (C) 30 minutes après l' addition APS. (D) Après 1 h. (E) Après 4 heures. (F) Produit vert après 48 heures de réaction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Utilisation de la PANI fluorescence pour détecter une hybridation d'acide nucléique. Film (A) PANI créée par goutte-revêtement sur du verre borosilicate, suivie d' un séchage pendant 48 heures à 40 ° C. (B) PANI fluorescence après sonde immobilisation. (C)Après l'hybridation de l'ADN cible avec les sondes immobilisées PANI. (D) Fluorescence à 500 nm de PANI émulsion avant et après hybridation avec soit décalage complémentaire ou simple (mm) oligonucléotides cibles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Un capteur à base PANI-des acides nucléiques nécessite la solubilisation du polymère dans l'eau afin d'interagir avec l'ADN et l'ARN. La dispersion de PANI dans l' eau est effectuée en utilisant des agents tensioactifs, formant des micelles comme indiqué précédemment 8. Outre les NaDBS utilisées ici d' autres tensio - actifs anioniques tels que l' ester dodécylique d'acide 4-sulfophtalique, les tensioactifs non ioniques tels que l' éthoxylate de nonylphénol, ou des agents tensioactifs cationiques tels que le bromure de cétyltriméthylammonium pourraient également être utilisés pour la synthèse de la PANI retraitable 9,10. La synthèse décrite ici commence par une proportion fixe de la NaDBS tensioactifs anioniques a été ajoutée à l'aniline monomère dans un rapport de 2: 1 molaire. Le NaDBS tensioactif a un équilibre hydrophile-lipophile élevé (HLB) permettre à la polymérisation de l'aniline monomère émulsifié dans un mélange chloroforme-eau en établissant un équilibre entre les gouttelettes d'huile micellaires polymères et de l'eau. L'APS oxydant est ensuite ajouté à un rapport de 1: 1,5 molaire pour générer des micelles de gren raison PANI, où le noyau interne agit comme un agent de nucléation. Cela conduit à la tête à la queue de fixation de monomères, tout en gardant PANI en équilibre dynamique avec le solvant environnant 11,12. La réaction se déroule d'une manière contrôlée jusqu'à ce que les polymères de haut poids moléculaire sont formés 13. Ce protocole générer des particules allant de 50 nm à 1500 nm 3. Critique à l'établissement d'une réaction où PANI se développe lentement mais reste soluble est la plus lente de l'APS oxydant, à basse température, et l'absence d'acides protoniques forts. Certains optimisation des proportions des réactifs peut être nécessaire pour générer bien dispersé PANI. PANI synthétisés par cette méthode est stable pendant plus d'un an sous forme d'émulsion. dilution excessive doit être évitée car l'équilibre HLB de la dispersion peut être perturbée, provoquant PANI pour précipiter. mélange à haute vitesse peut aider à garder la PANI en solution. solubilité parfaite est pas souhaitable, car il empêcherait formati à granuléssuite, ce qui est un critère important pour les procédures d'hybridation dans un capteur à base d'émulsion.
Après la génération dispersée PANI oligos de sondes d'ADN sont attachées à la matrice polymère par interaction électrostatique. Interaction des groupes imine PANI et les phosphates du squelette de l'ADN se produisent spontanément. Les interactions non spécifiques d' acides nucléiques PANI compliquent l' analyte dans des échantillons biologiques de détection 14 complexes. Pour atteindre association entre PANI et l'ADN de la sonde qui peut être distingué des interactions spontanées, le complexe est irradié par UV. La création de groupements polaires induits par la localisation de la charge provoquée par les UV augmente la mouillabilité de la surface du polymère 15. Exposition optimale est d' environ 2 min, et peut être confirmée si PANI fluorescence à 500 nm est élevée environ 5X (Figure 3). Au cours de l'exposition du complexe aux UV peut conduire à la réticulation entre PANI et l'ADN, qui, contrairement à des interactions électrostatiques, does ne pas provoquer une élévation de PANI fluorescence.
Le processus de génération de capteurs est facile et rapide. La réaction de polymérisation est terminée après 48 heures puis 24 heures à séparer de l'oxydant et qui n'a pas réagi NaDBS. Synthèse devra être effectuée rarement que la quantité de stock PANI produit par le protocole dans cet article est très grand par rapport à la quantité utilisée dans un capteur. PANI émulsion à des concentrations élevées est stable; cependant, toute dilution qui se produit lors de la fixation de la sonde peut conduire à la précipitation de PANI, compromettre les performances du capteur. L'utilisation immédiate de complexes PANI-sondes pour détecter des cibles va éviter ce problème. Ensemble, et la création de complexes d'hybridation peut être réalisée en moins d'une heure. des films PANI-sonde sont plus stables et peuvent être utilisés après un stockage à long terme. Une limitation de cette technologie de détection est qu'il n'y a pas prête très bien au multiplexage. Chaque événement de détection doit être effectuée dans un tube séparé. Films peutfournir un meilleur format de multiplexage en tant que sondes différentes peuvent être repérés sur différentes régions d'un film. Un échantillon peut être appliqué sur le réseau au comptant, et la fluorescence à chaque endroit utilisé pour évaluer l'expression d'un gène différent.
Le mécanisme de détection décrit ici présente plusieurs avantages par rapport à d'autres systèmes. Les rapports de détection d' acides nucléiques par le biais d' un mécanisme de dissociation impliquant PANI reposent sur des fluorophores fixés à la sonde d'ADN oligos 5. D' autres stratégies utilisent la fixation covalente de sondes, qui ne parviennent pas à distinguer simples différences dans les acides nucléiques cibles 16-17 paires de bases. L'omission de l'étiquetage ou d'autres modes secondaires de détection dans cette technologie crée des occasions d'utiliser d'autres propriétés de PANI électro-actif. La réponse du capteur ainsi pourrait être étendu à la mesure des propriétés électrochimiques modifiées par la dynamique de l'attachement détachement du capteur. Les laboratoires qui adoptent cette technique trouveront les ssystème ensor à être rentable en plus rapide et simple.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
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