Protocol
1.加工可能PANI合成
- 250mL丸底フラスコ中で完全にクロロホルム60ml中のアニリン（1 mlの11ミリモル）に溶解します。 5分間600rpmで撹拌し、氷で0〜5℃に冷却します。これは通常、15〜20分（ 図2A）を取ります。
- 600rpmで攪拌しながら、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（NaDBS）（て7.44 gの21ミリモル）丸底フラスコ中のアニリンの溶液に加えます。
- 20ミリリットルの水に過硫酸アンモニウム（APS）（3.072グラム、13.5ミリモル）を溶解し、ドロップワイズ30分かけて反応の過熱を防ぐため、それのすべてを追加します。
- 24のための時間0-5℃で反応を行い、それがさらに24時間室温に到達させます。
- この反応混合物は、最初は15分後に乳白色を回して観察し、2時間後、最終的には24時間（ 図2B-F）の後に暗緑色に暗褐色。
- ブフナー漏斗とPANI-NaDBSソリューションをフィルタリングします。 80 mLのクロロホルムと120ミリリットルの水と混合eparation漏斗（ 図2G）。
- 水性の上清中の未反応NaDBSとAPSを残して、室温で24時間のためのソリューションをインキュベートし、分離漏斗から暗緑色PANIを集めます。
2. PANI-プローブ混合とUV照射
- クロロホルム - 水でPANI液10倍に希釈（1：3 V / V）および微量遠心管中で15分間穏やかに振動することにより、プローブDNAオリゴヌクレオチドの6.4μmolので希釈したPANIの200μLを混ぜます。
- 2分間架橋剤中のUVの1200μJ/ cm 2のPANI-DNA溶液を照射します。 UV露光が示された量に制限されていることが重要です。紫外線に長時間さらさは、PANIとDNAの共有結合架橋に起因する可能性が高いPANI中の蛍光変化を、損ないます。
- 6分間の17000×gで遠心分離によってペレット錯体、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。再びペレット化し、PBS中に再懸濁します。
3. HPANI-プローブのybridization
- PANI-プローブ複合体の200μlに核酸を100μMの相補的なDNAオリゴヌクレオチドを8μlを添加またはターゲット。
- 40で15分間混合液をロッキングすることによりハイブリダイゼーションを行います °C。
- 6分間の17000×gで遠心分離することによってPANI複合体をペレット化。 PBSで洗浄し、水に再懸濁します。
4.排出定常の蛍光測定
- 250 nmで励起することにより、96ウェルマイクロプレートに異なる処理からPANIを追加し、270から850 nmの範囲の発光蛍光を測定します。 PANIのための発光ピークは、500nm付近に観察されるべきです。
ハイブリダイズした二重の5蛍光顕微鏡測定
- 48時間、40℃でホウケイ酸ガラスのカバースリップとドライにコートPANIをドロップします。
- 乾燥したPANI膜の上にプローブ（100μMの8μl）を追加し、UV光（1200μJ/ cm 2のそれを照射
- 48時間40℃でPANI-プローブPBSでフィルムや乾燥を洗ってください。
- 標的核酸を添加することにより15分間ハイブリダイゼーションを行います。これは生物学的サンプルまたは制御目標オリゴヌクレオチド（100μMの8μL）である可能性があります。 PBS洗浄に従ってください。
- 500 nmのロングパスフィルタを用いて、40X倍率で蛍光画像を取得します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図2Aは、APSの添加前に、 すなわち 、重合プロセスの開始時に反応セットアップを取り込みます。ミセル形成は、ミセル界面におけるプロセス-PANI合成が起こる反応の最初のステップである。 図2Bは、5分後に乳白色の解決策を示しています。 APSの30分後、反応はやや褐色に変わり追加されます。 図2Cは、オリゴマーの形成に伴う色の変化を示している。 図2Dはと一致し、短鎖PANIの高濃度を示し、4時間後に暗褐色を示し、とても遅い反応。最後に、クロロホルム-水（ 図2E）中に分散された高分子量のPANIの暗緑色の溶液が観察できる48時間後。 図2Fは無い相分離と分離漏斗中に十分に分散、均質PANIソリューションを示しています。
図2）またはドロップコーティングされたフィルムの表面上に（ 図3）。 PANI膜の基底蛍光は、比較的低い（ 図3A）です。プローブDNAを膜上に添加し、室温で乾燥させます。予想されるDNA-PANI複合体形態は、蛍光の強い増加は、（ 図3B）で観察することができる時。負に荷電したDNAからの電子の流入は、蛍光の増加を引き起こし、PANI分子が高い電子密度を生じさせます。プローブ-標的二本鎖のハイブリダイゼーション誘起解離後、PANIの蛍光は、基底強度（ 図3C）に戻ります。解離は、ハイブリダイゼーションの際にDNA骨格その妥協のPANI - プローブ相互作用の変化によって引き起こされます。この技術を用いて核酸を検出することもエマルション（ 図3D）で直接行うことができます。エマルジョンを使用する利点ベースのシステムは、プレートリーダー機器との互換性です。これは、PANI蛍光の高精度な測定を可能にし、フィルムコーティングのばらつきに起因する問題を回避しています。エマルジョン形式のPANIベースのセンサは、非常に特異的です。ターゲットオリゴにおける単一のミスマッチ（ミリメートル）の導入は、基礎PANI蛍光（ 図3D）を復元することができません。
UV露光によって媒介されるプローブの 図1. 添付ファイルは、PANIの蛍光を増加させる。PANIから離脱中の標的核酸の結果のハイブリダイゼーション、および基底蛍光に対するポリマーの復帰。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ジル/ ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
加工可能なPANIの 図2. 合成。（A）重合反応のスタート。 APSをゆっくりと添加し、5分後（B）。 APS添加後（C）30分。 1時間後に（D）。 4時間後（E）。 （F）は、反応の48時間後のグリーン製品。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
核酸ハイブリダイゼーションを検出するための蛍光PANI図3. 40℃で48時間乾燥したホウケイ酸ガラス上にドロップコーティングして作成（A）PANIフィルム。プローブの固定化後に（B）PANI蛍光。 （C）PANI-固定されたプローブと標的DNAのハイブリダイゼーションに続いて。 （D）の相補的または単一のミスマッチ（mm）の標的オリゴヌクレオチドのいずれかとのハイブリダイゼーション前後のPANIエマルジョンの500nmにおける蛍光。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
核酸のPANIベースのセンサーは、DNAやRNAと相互作用するために、水中でのポリマーの可溶化を必要とします。水中のPANI分散物は、以前8報告されているように、ミセルを形成する界面活性剤を使用して達成されます。 4-スルホフタル酸ドデシルエステルなどの他の陰イオン界面活性剤ここで用いられるNaDBSに加えて、ノニルフェノールエトキシレート、またはセチルトリメチルアンモニウムブロミドのようなカチオン性界面活性剤などの非イオン界面活性剤はまた、加工PANI 9,10の合成のために使用することができます。ここに記載した合成は、アニオン性界面活性剤NaDBSの一定の割合で始まる2で単量体アニリンに追加：1のモル比。界面NaDBSミセルポリマー油滴と水との間の平衡を確立することにより、クロロホルム - 水に乳化アニリンモノマーの重合を可能にする高親水性 - 親油性バランス（HLB）を有します。 GRのミセルを生成するために1.5のモル比：酸化APSを1で添加します内部コアは、核剤として作用するPANIを、による。さらに、周囲の溶媒11,12と動的平衡にPANIを維持しながら、これは、単量体の尾結合をヘッドにつながります。高分子量ポリマーは、13が形成されるまで反応が制御された様式で進行します。このプロトコルは、50ナノメートルから1500 nmの3までの範囲の粒子が生成されます。 PANIはまだゆっくりと成長する可溶性のままで反応を確立するために重要では酸化剤のAPS、低温、および強力なプロトン酸の不在をゆっくりと加えています。反応物質の比率のいくつかの最適化は、十分に分散PANIを発生する必要があるかもしれません。この方法で合成PANIは、エマルジョンとして一年以上安定です。分散剤のHLBバランスが破壊することができるように過度の希釈は、PANIを沈殿させ、回避されるべきです。高速混合は、溶液中のPANIを維持するのを助けることができます。それはペレットformatiを妨げるとしてパーフェクト溶解度は、望ましいことではありませんエマルジョンベースのセンサにおけるハイブリダイゼーション手順のための重要な基準である上に、。
分散PANIを生成した後、DNAプローブオリゴは静電相互作用を介してポリマーマトリックスに結合されています。 PANIのイミン基とDNAのバックボーンのリン酸塩の相互作用が自然に発生します。非特異的PANI -核酸相互作用は複雑な生物学的試料14中の被分析物の検知を複雑。自発的な相互作用から区別することができるPANIとプローブDNAとの間の関連付けを実現するために、複合体はUVを照射します。 UV-トリガーの電荷局在によって誘発される極性部分の作成は、ポリマー表面15の濡れ性を向上させます。最適な露出は、約2分であり、500 nmでPANI蛍光がおよそ5倍（ 図3）に上昇された場合に確認することができます。過剰暴露UVへの複合体のPANIとDNA、静電相互作用とは異なり、雌間の架橋につながることができますPANI蛍光の上昇を引き起こすことはありません。
センサーを生成するプロセスは、簡単かつ迅速です。重合反応は、未反応の酸化剤およびNaDBSから分離するために24時間、続いて48時間後に完了する。合成は、この記事では、プロトコルによって生成在庫PANIの量は、センサに使用される量に比べて非常に大きいようにまれに行われる必要があります。高濃度でPANIエマルジョンは安定です。しかし、プローブアタッチメントの間に発生する任意の希釈は、センサ性能を損なう、PANIの析出につながることができます。標的を検出するためのPANI-プローブ複合体のすぐ使用は、この問題を回避します。一緒に、複合体およびハイブリダイゼーションの作成は時間の下で行うことができます。 PANI-プローブフィルムはより安定であり、長期保存後に使用することができます。このセンサ技術の制限は、多重化に極めて適していない点です。各検出事象は、別々のチューブ中で実施しなければなりません。映画かもしれません異なるプローブは、フィルムの異なる領域にスポットすることができたとして多重化のためのより良いフォーマットを提供します。試料は、スポットアレイの上に適用することができ、各スポットの蛍光は、異なる遺伝子の発現を評価するために使用されます。
ここで説明する検出機構は、他のシステムに比べていくつかの利点を提供します。 PANIを伴う解離機構を介して核酸を検出の報告はDNAオリゴ5をプローブに結合した蛍光色素分子に依存しています。他の戦略は、標的核酸16-17における単一塩基対の違いを区別するために失敗したプローブ、の共有結合を使用します。この技術では、標識または検出の他の二のモードの省略は、電気活性PANIの他のプロパティを使用する機会を作成します。センサ応答は、従って、センサーの着脱ダイナミクスによって変更電気化学特性の測定に拡張することができます。この技術を採用するラボがsを見つけるだろうアンソールシステムは、高速かつ簡単に加えて、費用対効果します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
