Protocol
1. Síntesis procesable PANI
- Disolver anilina (1 ml, 11 mmol) completamente en 60 ml de cloroformo en un matraz de 250 ml de fondo redondo. Se agita a 600 rpm durante 5 min y se enfría a 0-5 ° C con hielo. Esto suele tardar 15-20 minutos (Figura 2A).
- Añadir sodio dodecil benceno sulfonato (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) a la solución de anilina en un matraz de fondo redondo mientras se agitaba a 600 rpm.
- Disolver persulfato de amonio (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) en 20 ml de agua y añadir todos de la misma gota a gota durante 30 minutos para evitar el sobrecalentamiento de la reacción.
- Llevar a cabo la reacción a 0-5 ° C durante 24 horas, y permita que alcance la temperatura ambiente durante otras 24 horas.
- Observar la mezcla de reacción encender inicialmente de color blanco lechoso después de 15 minutos, a continuación, de color marrón oscuro después de 2 horas, y finalmente a verde oscuro después de 24 horas (Figura 2B-F).
- Filtrar la solución PANI-NaDBS con un embudo Buchner. Mezclar con 80 ml de cloroformo y 120 ml de agua en taneparation embudo (Figura 2G).
- Incubar la solución durante 24 horas a temperatura ambiente y recoger el PANI verde oscuro desde el embudo de separación, dejando NaDBS sin reaccionar y APS en el sobrenadante acuoso.
2. Mezcla PANI-sonda y la irradiación UV
- Diluir solución PANI 10x con cloroformo-agua (1: 3 v / v) y mezclar 200 l de PANI diluye con 6,4 mol de oligonucleótidos de ADN de la sonda por agitación suave durante 15 min en un tubo de microcentrífuga.
- Irradiar la solución PANI-ADN con 1200 mu J / cm 2 de UV en un agente de reticulación para 2 min. Es crítico que la exposición UV se limita a la cantidad indicada. La exposición prolongada a los rayos UV compromete el cambio de fluorescencia en el PANI, probablemente debido a la reticulación covalente del PANI y el ADN.
- complejos de pellets por centrifugación a 17.000 xg durante 6 minutos, y se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se precipitan de nuevo y volver a suspender en PBS.
3. Hybridization del PANI-sonda
- Añadir 8 l de 100 mM oligonucleótidos de ADN complementario o ácidos nucleicos diana de 200 l de complejos PANI-sonda.
- Realizar la hibridación por balanceo mezcla en solución durante 15 minutos a 40 DO.
- Se precipitan los complejos PANI por centrifugación a 17.000 xg durante 6 minutos. Lavar con PBS y resuspender en agua.
4. Emisión Steady Estado Medición de fluorescencia
- Añadir PANI de diferentes tratamientos en una microplaca de 96 pocillos y medir la fluorescencia de emisión en el rango de 270 a 850 nm mediante excitación a 250 nm. Un pico de emisión para el PANI se debe observar alrededor de 500 nm.
5. microscopía de fluorescencia Medición de Hibridada Duplex
- Caída de PANI abrigo en un cubreobjetos de vidrio de borosilicato y se seca a 40 ° C durante 48 horas.
- Añadir la sonda (8 l de 100 mM) en una película de PANI seca e irradiar con luz UV (1.200 mu J / cm2
- Se lava la película de PANI-sonda con PBS y se seca a 40 ° C durante 48 horas.
- Realizar la hibridación durante 15 min mediante la adición de ácidos nucleicos diana. Esto podría ser una muestra biológica o un oligonucleótido objetivo de control (8 l de 100 mM). Siga con un lavado PBS.
- Obtener las imágenes fluorescentes en un aumento de 40X, con un filtro de paso largo 500 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 2A captura la configuración de la reacción en el comienzo del proceso de polimerización, es decir, antes de la adición de APS. La formación de micelas es el paso inicial en la reacción se produce la síntesis de proceso de PANI en la interfase micelar. La Figura 2B muestra una solución lechosa después de 5 min. 30 min después de APS se añade la reacción se convierte en un color ligeramente marrón. Figura 2C muestra el cambio de color asociado con la formación de oligómeros. Figura 2D muestra un color marrón oscuro después de 4 horas, lo que indica una alta concentración de cadena corta PANI, en consonancia con una reacción muy lenta. Finalmente, después de 48 hr se puede observar una solución de color verde oscuro de PANI de alto peso molecular que se dispersa en cloroformo-agua (Figura 2E). Figura 2F muestra una solución PANI bien dispersada, homogénea en el embudo de separación, sin separación de fases.
(Figura 2) o en la superficie de las películas con revestimiento de gota (figura 3). La fluorescencia basal de las películas PANI es relativamente baja (Figura 3A). se añade la sonda de ADN sobre la película, y se dejó secar a temperatura ambiente. Cuando las formas complejas de ADN-PANI esperados, se pueden observar un intenso aumento de la fluorescencia (Figura 3B). Electron afluencia a partir del ADN cargado negativamente hace que la densidad de electrones en las moléculas de mayor PANI, causando el aumento de fluorescencia. Después de la hibridación inducida disociación del dúplex sonda-diana, PANI fluorescencia vuelve a la intensidad basal (Figura 3C). La disociación es causada por los cambios en la columna vertebral del ADN tras la hibridación que la interacción compromiso PANI-sonda. Ácidos nucleicos de detección con esta tecnología también se pueden realizar directamente en emulsión (Figura 3D). Una ventaja de utilizar la emulsión sistema basado es la compatibilidad con los instrumentos lector de placas. Esto permite una medición muy precisa de la fluorescencia PANI, y evita las dificultades causadas por irregularidades en recubrimiento de película. Un sensor basado en PANI en formato emulsión es altamente específico. La introducción de un único desajuste (mm) en el oligo de destino no puede restaurar la fluorescencia basal PANI (Figura 3D).
Figura 1. La unión de sondas mediadas por la exposición UV aumenta el PANI fluorescencia. La hibridación de ácidos nucleicos diana da como resultado el desprendimiento de PANI, y la reversión del polímero a la fluorescencia basal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
iles / ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
Figura 2. Síntesis del PANI procesable. (A) de inicio de la reacción de polimerización. (B) Después de 5 minutos cuando se añade lentamente APS. (C) 30 minutos después de la adición de APS. (D) Después de 1 hora. (E) Después de 4 horas. (F) Producto verde después de 48 h de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Uso de PANI de fluorescencia para detectar hibridación de ácidos nucleicos. Película (A) PANI creado a través de la gota de recubrimiento sobre el vidrio de borosilicato, seguido por secado durante 48 horas a 40 ° C. (B) de fluorescencia PANI después de la inmovilización de la sonda. (C)Después de la hibridación del ADN diana con sondas inmovilizadas-PANI. (D) La fluorescencia a 500 nm de la emulsión PANI antes y después de la hibridación con cualquiera desajuste complementaria o única (mm) oligonucleótidos diana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un sensor basado en PANI de los ácidos nucleicos requiere la solubilización del polímero en agua con el fin de interactuar con el ADN y el ARN. La dispersión de la PANI en el agua se logra usando agentes tensioactivos, que forman micelas como se informó anteriormente 8. Además de los NaDBS utilizados aquí otros tensioactivos aniónicos, tales como éster de dodecilo de ácido 4-sulfoftálico, tensioactivos no iónicos como los etoxilatos de nonilfenol, o tensioactivos catiónicos tales como bromuro de cetiltrimetilamonio también podrían utilizarse para la síntesis de procesable PANI 9,10. La síntesis descrita aquí comienza con una proporción fija de los NaDBS de tensioactivo aniónico añadido a la anilina de monómero en una relación molar 2: 1. Los NaDBS tensioactivo tiene un elevado equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) que permite la polimerización del monómero de anilina emulsionado en cloroformo-agua mediante el establecimiento de un equilibrio entre las gotitas de aceite y agua micelar poliméricos. Después se añade la APS oxidante en una relación molar 1: 1,5 para generar micelas de grdebido PANI, donde el núcleo interno actúa como un agente de nucleación. Esto conduce a la cabeza a la cola de unión de monómeros, al mismo tiempo mantener PANI en equilibrio dinámico con el disolvente 11,12 circundante. La reacción transcurre en una manera controlada hasta polímeros de alto peso molecular se forman 13. Este protocolo va a generar partículas que van desde 50 nm a 1.500 nm 3. Fundamental para el establecimiento de una reacción en la que el PANI crece lentamente aún permanece soluble es la adición lenta de la APS oxidante, baja temperatura, y la ausencia de ácidos protónicos fuertes. Algunos optimización de las proporciones de reactivos puede ser necesario para generar bien dispersada PANI. PANI sintetizado por este método es estable durante más de un año como una emulsión. dilución excesiva debe evitarse ya que el equilibrio HLB de la dispersión puede ser interrumpido, provocando PANI precipite. La mezcla a alta velocidad puede ayudar a mantener el PANI en solución. solubilidad perfecta no es deseable, ya que impediría formati de pellets, lo cual es un criterio importante para procedimientos de hibridación en un sensor basado en la emulsión.
Después de generar dispersado PANI, oligos de sondas de ADN se unen a la matriz de polímero a través de interacción electrostática. La interacción de los grupos de imina PANI y los fosfatos del esqueleto del ADN se producen espontáneamente. Las interacciones no específicas de ácido nucleico-PANI complican la detección de analitos en muestras biológicas complejas 14. Para lograr asociación entre PANI y sonda de ADN que puede distinguirse de interacciones espontáneas, el complejo es irradiado con UV. La creación de restos polares inducidas por localización de carga provocada UV-aumenta la humectabilidad de la superficie del polímero 15. La exposición óptima es de aproximadamente 2 minutos, y se puede confirmar si el PANI fluorescencia a 500 nm se eleva más o menos 5 veces (Figura 3). La exposición excesiva del complejo a la radiación UV puede conducir a reticulación entre el PANI y el ADN, que a diferencia de las interacciones electrostáticas, gamas no causar una elevación de la fluorescencia PANI.
El proceso de generación de sensores es fácil y rápido. La reacción de polimerización se completa después de 48 horas seguido de 24 horas a separarse de oxidante sin reaccionar y NaDBS. tendrá que ser llevado a cabo con poca frecuencia como la cantidad de de la PANI producido por el protocolo en este artículo de síntesis es muy grande en relación con la cantidad utilizada en un sensor. PANI emulsión a altas concentraciones es estable; Sin embargo, cualquier dilución que se produce durante la unión de la sonda puede conducir a la precipitación del PANI, comprometer el rendimiento del sensor. El uso inmediato de los complejos de PANI-sonda para detectar objetivos evitará este problema. Juntos, la creación de complejos y la hibridación puede realizarse en menos de una hora. películas PANI-sonda son más estables y se pueden utilizar después de un almacenamiento a largo plazo. Una limitación de esta tecnología sensor es que no es muy susceptible de multiplexación. Cada evento de detección debe llevarse a cabo en un tubo separado. Las películas puedenproporcionar un mejor formato para la multiplexación como diferentes sondas podrían ser vistos en diferentes regiones de una película. Una muestra puede ser aplicada sobre la matriz de punto, y la fluorescencia en cada punto utilizado para evaluar la expresión de un gen diferente.
El mecanismo de detección descrito aquí proporciona varias ventajas sobre otros sistemas. Los informes de detección de ácidos nucleicos a través de un mecanismo que implica la disociación PANI dependen de los fluoróforos unidos a la sonda de ADN oligos 5. Otras estrategias usan la unión covalente de las sondas, que no distinguen las diferencias individuales de pares de bases en los ácidos nucleicos diana 16-17. La omisión de otros modos secundarios de la detección de esta tecnología de etiquetado o crea oportunidades para utilizar otras propiedades del PANI electro-activa. La respuesta del sensor por lo tanto podría extenderse a la medición de propiedades electroquímicas alterados por la dinámica de unión-separación del sensor. Laboratorios que adoptan esta técnica encontrarán los sEnsor sistema para ser rentable, además de rápido y sencillo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
