Protocol
هي ولدت كل الفئران والمحافظة في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وتجرى جميع البروتوكولات الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.
1. إعداد المخازن والكواشف
- إعداد المعهد التذكاري الكامل روزويل بارك (RPMI) متوسطة (10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، البنسلين (100 وحدة دولية / مل) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، 55 ميكرومتر 2-المركابتويثانول ).
- إعداد 20x والمتوازن محلول الملح (BSS) سهم 1 و 2 سهم، وبشكل منفصل.
- إعداد 20x والأسهم BSS 1 (111 ملي سكر العنب، 8.8 ملي فوسفات البوتاسيوم، 26.7 ملي فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة في 1 لتر ماء معقم) وإضافة 40 مل 0.5٪ الفينول الأحمر إلى 20x والأسهم BSS 1 قبل تعديل الحجم النهائي. تصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون التصفية قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد 20x وBSS الأوراق المالية 2 (25.8 ملم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم، و 107 ملي كلوريد البوتاسيوم، الفصل 2.73 M الصوديومloride، 19.6 ملي هيدرات كلوريد المغنيسيوم، 16.6 ملي كبريتات المغنيسيوم في 1 لتر ماء معقم). تصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون التصفية قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.
- لإعداد 1X BSS للاستخدام التجريبي، وتمييع 50 مل الأسهم BSS 1 و 50 مل الأسهم BSS 2، بشكل منفصل، في 400 مل من الماء المعقم لكل منهما. الجمع بين الحلول المخففة، والتكيف مع درجة الحموضة 7، وإضافة 20 مل FBS (2٪). أعلى ما يصل إلى 1 لتر باستخدام الماء المعقم وتصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون فلتر.
ملاحظة: يجب أن تكون على استعداد الحلول الأسهم BSS بشكل منفصل بسبب اختلاط الأسهم BSS المركزة مباشرة يمكن أن يؤدي إلى هطول الأمطار.
- خلايا الدم الحمراء (RBC) الاحتياطي تحلل
- لإعداد العازلة تحلل كريات الدم الحمراء، مزيج 9 أجزاء كلوريد الأمونيوم الأوراق المالية (155 كلوريد الأمونيوم مم في الماء المعقم) إلى 1 الأسهم جزء تريس قاعدة (130 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane في الماء المعقم، ودرجة الحموضة 7.65) قبل الاستخدام.
ملاحظة: مخزن الحلول الأسهم معقمة من كلوريد الأمونيوم وتريس قاعدة في 4 درجات مئوية. إعداد تحلل بuffer جديدة لضمان تحلل كفاءة من كرات الدم الحمراء.
- لإعداد العازلة تحلل كريات الدم الحمراء، مزيج 9 أجزاء كلوريد الأمونيوم الأوراق المالية (155 كلوريد الأمونيوم مم في الماء المعقم) إلى 1 الأسهم جزء تريس قاعدة (130 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane في الماء المعقم، ودرجة الحموضة 7.65) قبل الاستخدام.
2. جيل من الخلايا الليمفاوية تعليق من الطحال أو الغدد الليمفاوية
ملاحظة: من المهم إعداد جميع الكواشف والمعدات المطلوبة للتجربة قبل القتل الرحيم الماوس وتوليد تعليق خلية واحدة من الخلايا الليمفاوية في أقرب وقت ممكن للحفاظ على viabilities خلية عالية.
- الموت ببطء الماوس التجريبية خلع عنق الرحم أو CO 2 الخنق.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية جو معقم و مطهر. - تراجع الماوس بأكمله إلى 70٪ من الإيثانول قبل اتخاذ أي شقوق. إزالة الطحال والغدد الليمفاوية جو معقم و مطهر 8، ووضعها في منفصلة 15 مل أنابيب تحتوي على 5 مل الجليد الباردة RPMI / FBS (RPMI مع FBS 2٪) أو BSS / FBS (من الخطوة 1.2.3).
ملاحظة: منذ BSS يمنع كفاءة تحلل كريات الدم الحمراء، واستخدام RPMI لإعداد تعليق خلية الطحال والتحول إلى BSS بعد عملية الشراءص RBC تحلل. - لتوليد تعليق خلية واحدة من الطحال أو الغدد الليمفاوية، ضع الجهاز (ق) في بين قطعتين من معقمة 100 ميكرون خلية شبكة مصفاة في طبق بتري تحتوي على 2 مل الجليد الباردة RPMI / FBS أو BSS / FBS. باستخدام المكبس من حقنة 1 مل، الهريس الجهاز (ق) حتى تمزقت إلى أجزاء دقيقة جدا.
- نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وغسل مصفاة الخلية شبكة مع الثلج الباردة RPMI / FBS أو BSS / FBS. جمع تعليق خلية المتبقية، إضافة إلى نفس أنبوب 15 مل، وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف.
ملاحظة: إعادة تعليق الخلايا مكعبات عبها الأنبوب مع الأصابع قبل أن يضيف RBC العازلة تحلل أو المتوسطة في الخطوات اللاحقة. - إعداد درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل (RT) RBC أثناء الطرد المركزي لتعليق الخلية (راجع الخطوة 1.3). بعد التكوير الخلايا وإزالة طاف، وإعادة تعليق-الخلايا مع 1 مل RBC تحلل العازلة لكل 10 8 خلايا. Incuباتي رد فعل تحلل في RT لمدة 3-4 دقيقة.
- وقف RBC تحلل مع 14 مل من الجليد الباردة BSS / FBS وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
3. تنقية B وخلايا T
- تنقية خلايا B
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. اعادة تعليق ما يصل إلى 10 8 خلايا الطحال في 300 ميكرولتر BSS / FBS وإضافة 50 ميكرولتر مكافحة CD43 ميكروبيدات المغناطيسية 9،10. لإزالة الخلايا الميتة، إضافة 30 ميكرولتر Annexin V حبات مغناطيسية. احتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 30 دقيقة.
- تنقية خلايا T
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. اعادة تعليق ما يصل إلى 10 8 خلايا في غير-T نضوب خلايا الجسم المضاد كوكتيل (الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز ضد CD19، B220، GR-1، TCR-γδ، CD49b، CD11c و، CD11b، Ter119 وCD4 أو CD8 تبعا لعدد السكان الخلية المستهدفة ل يمكن تنقيته)، المخفف 1: 200 في 200 BSS ميكرولتر / FBS 4،5. احتضان تعليق خلية في4 ° C الثلاجة لمدة 15 دقيقة.
- بعد الحضانة، إضافة 10 مل BSS / FBS لغسل الخلايا وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 165 ميكرولتر BSS / FBS مع 30 ميكروبيدات streptavidin ميكرولتر و 15 ميكرولتر Annexin V حبات مغناطيسية. احتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: لضمان حتى وصفها مع ميكروبيدات المغناطيسية، واحتضان الخلايا مع ميكروبيدات لمدة 15 دقيقة، ثم خلط تعليق خلية بلطف من خلال الاستفادة من أنبوب 15 مل واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى خلال خطوة 3.1.1. أو 3.2.2.
- إعداد العمود فصل لتنقية خلية
- إعداد عمود الفصل غير المستخدمة خلال وضع العلامات ميكروبيدات من الخلايا (الخطوة 3.1.1. أو 3.2.2.). قبل الدافئة BSS (بدون FBS) إلى RT واستخدام 2 مل لغسل وتتوازن العمود جو معقم و مطهر. بعد موازنة مع BSS، لا ينبغي أن يسمح للعمود غسلها لتجف.
ملاحظة: نحن نستخدم LS جolumn بدلا من العمود LD الموصى بها نظرا لإعادة الاستخدام (انظر الخطوة 3.4). - بعد وضع العلامات مع حبات مغناطيسية، إضافة 14 مل BSS / FBS لغسل الخلايا وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 1-3 مل RT BSS.
- إرفاق العقيمة 21 G الإبرة إلى غيض من عمود للحد من معدل تدفق أثناء عملية التنقية. تحميل تعليق الخلية على العمود معايرتها وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء.
ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات في العمود أثناء التحميل. - غسل العمود مرة واحدة مع 1 مل BSS / FBS وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء. تحديث العمود مع تدفق من خلال مرة أخرى. جمع التدفق من خلال بعد التحميل الثاني في نفس أنبوب 15 مل.
- غسل العمود 3 مرات مع 1 مل BSS / FBS وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء. بعد ذلك، إضافة 5 مل BSS / FBS إلى thالعمود الإلكترونية، ومع الغطاس، بمسح الخلايا المسمى مغناطيسيا للخروج من عمود في أنبوب 15 مل الجديد.
- تحقق نقاء من الخلايا التي تم جمعها عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة التي تربط على سطح المستضدات من تنقية باء أو خلايا تي 4،5.
- إعداد عمود الفصل غير المستخدمة خلال وضع العلامات ميكروبيدات من الخلايا (الخطوة 3.1.1. أو 3.2.2.). قبل الدافئة BSS (بدون FBS) إلى RT واستخدام 2 مل لغسل وتتوازن العمود جو معقم و مطهر. بعد موازنة مع BSS، لا ينبغي أن يسمح للعمود غسلها لتجف.
- إعادة استخدام عمود الفصل
ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها العمود LS تصل إلى 4 مرات دون أن يؤثر كفاءة تنقية.- غسل العمود 3 مرات مع 5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و 3 مرات مع 5 مل من الماء المقطر من أعلى باستخدام المكبس.
- غسل العمود مع 5 مل 70٪ من الإيثانول وتجفيف عمود على نطاق واسع باستخدام صنبور الهواء لمنع تراكم الصدأ في العمود.
- لإعداد عمود LS المستخدمة لإجراء تجربة تنقية منفصلة، وغسل عمود من أسفل إلى أعلى مع 5 مل 70٪ من الإيثانول باستخدام محول حقنة. التالي، وغسل عمود من الأسفل إلى الأعلى مرتين مع 5 مل العقيمة برنامج تلفزيوني، تليها 5 مل PBS مرة واحدة من أعلى العمود. إضافة 2مل RT BSS للتوازن العمود ومن ثم المضي قدما لتحميل العمود مع الخلايا المسمى.
4. CFSE وصفها وتحفيز
ملاحظة: تنقية الخلايا يمكن أن تخضع لمجموعة متنوعة من في المختبر والمقايسات الفنية الجسم الحي. هنا، ونحن نستخدم خلايا T النقاء لتحديد T القدرة على تحفيز الخلايا من ناقلات الجنود المدرعة 5.
- حل قبل الدافئ وضع العلامات (0.1٪ FBS في برنامج تلفزيوني) إلى 37 درجة مئوية قبل CFSE التحميل.
ملاحظة: استخدام نسبة منخفضة من FBS في برنامج تلفزيوني يقلل موت الخلايا خلال CFSE التحميل ويقلل من فقدان الخلايا خلال الطرد المركزي. ومع ذلك، يمكن FBS الكثير تتداخل مع CFSE التحميل. - غسل الخلايا تنقيته مرتين مع وضع العلامات الحل، ثم إعادة علقت في 2 × 10 7 خلية / مل في حل وضع العلامات قبل تحسنت في أنبوب 15 مل.
- إعداد 10 ميكرومتر حل CFSE (1: 500 التخفيف من 5 ملي CFSE حل الأوراق المالية) في قبل تحسنت حل وضع العلامات. ينبغي CFSE الحلأن طازجة في كل مرة لتحقيق وضع العلامات الأمثل.
- لتحميل الخلايا مع CFSE، إضافة تعليق خلية جزء 1 إلى 1 جزء 10 حل ميكرومتر CFSE في أنبوب 15 مل واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ويستخدم تركيز النهائي من 5 ميكرومتر CFSE لتسمية 1 × 10 7 خلية / مل.
- عكس الأنبوب كل دقيقة 2 لضمان خليط متجانس من الخلايا خلال CFSE التحميل.
- لوقف رد الفعل، إضافة عدة مجلدات من اكتمال المتوسطة RPMI الجليد الباردة وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. على النجاح CFSE تحميل، ستظهر بيليه خلية مصفر.
- غسل CFSE تحميل خلية واحدة لمزيد من الوقت مع كامل المتوسطة RPMI الجليد الباردة وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية قبل استخدام لفي المختبر زراعة أو في تنشيط الجسم الحي.
5. في المختبر تحفيز
- يعد حل 2X الأسهم من المحفزات (2X المحفزات حل الأسهم) مباشرة قبل الاستعمال بحيث 100 ميكرولتر من 2X حل الأسهم المحفزات يمكن أن تضاف إلى 100 ميكرولتر من الخلايا إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 96-جيدا.
- إذا كنت بحاجة لوحة المغلفة مع المثيرات (الغلوبولين المناعي أو CD40 للخلايا B أو CD3 وCD28 للخلايا T)، يخفف من المحفزات في برنامج تلفزيوني وقبل معطف لوحة الثقافة في 4 درجات مئوية خلال الليل. بدلا من ذلك، لوحة الثقافة يمكن أن تطلى عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في اليوم من هذه التجربة. غسل لوحة المغلفة مرتين مع برنامج تلفزيوني (لا تسمح لوحة لتجف في أي وقت).
| لخلايا B | |
| المحفزات | التركيز النهائي |
| F (أ ب ') 2 الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي | 0،6-2،4 ميكروغرام / مل |
| مكافحة فأر CD40 ماب | 0.5-2 ميكروغرام / مل |
| المؤتلفالماوس IL-4 | 25 U / مل |
| lipopolysaccharide في | ،1-10 ميكروغرام / مل |
| (LPS) من E. القولونية المصلي 055: B5 | |
| للخلايا T | |
| المحفزات | التركيز النهائي |
| مكافحة CD3 (المغلفة لوحة) | 2-10 ميكروغرام / مل |
| (50 ميكرولتر / جيد لطلاء) | |
| مكافحة CD28 (المغلفة لوحة) | 2 ميكروغرام / مل |
| المؤتلف IL-2 | 40 U / مل |
| PDBu (Phorbol استر) | 5-50 نانوغرام / مل |
| A23187 (الكالسيوم حامل الأيون) | 250 نانوغرام / مل |
الجدول 1: التركيزات من المحفزات المستخدمة لتحفيز الخلايا الليمفاوية في ثقافة في المختبر.
- لخلايا B وصفت CFSE، إعادة تعليق ل3 × 10 6 خلية / مل في كامل المتوسطة والثقافة RPMI في ثلاث نسخ مع 3 × 10 5 خلايا جيدا / في 96-جيدا لوحات مسطحة القاع لمدة 72 ساعة.
- للخلايا T المسمى CFSE، إعادة تعليق ل0.5-3 × 10 6 خلية / مل في كامل المتوسطة RPMI والثقافة في ثلاث نسخ مع 0.5-3 × 10 5 خلايا جيدا / في 96-جيدا لوحات أسفل الجولة لمدة 48 أو 72 ساعة .
6. في فيفو تحفيز
- في الجسم الحي التحفيز، نقل adoptively 4 × 10 6 المسمى CFSE خلايا T في الماوس (عن طريق الوريد (IV) في 200 ميكرولتر PBS) إلى كل فأر متلق MHC المطابقة.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، وخلايا T وصفت CFSE ويمكن نقل adoptively باستخدام الوريد الذيل أو حقن الرجعية المداري حيث أن هذه الخلايا سوف تضم اللمفاوية أجهزة مثل الطحال والغدد الليمفاوية. - تحدي الفئران المتلقي في وقت لاحق يوم واحد مع المستضد.
ملاحظة:في هذا المثال، ونحن نستخدم ألبومين البيض (البروتين OVA، 50 ميكروغرام / الماوس) كما مستضد لOVA محددة، تم نقل الخلايا التائية مستقبلات (TCR) خلايا T -transgenic adoptively في الفئران المتلقي. إعداد البروتين OVA في برنامج تلفزيوني العقيمة وحقن 100 ميكرولتر من OVA بروتين / برنامج تلفزيوني أو السيطرة برنامج تلفزيوني، عن طريق الحقن تحت الجلد (سي)، إلى كل فأر متلق 5. - الحصاد وتوليد تعليق خلية واحدة من الأجهزة اللمفاوية (الغدد الليمفاوية والطحال) من الفئران المتلقي بعد 3 أيام التحصين مع البروتين OVA أو برنامج تلفزيوني. الغدد الليمفاوية منفصلة إلى الغدد الليمفاوية القريبة (PLN)، والذي يتضمن إبطي، العضدية والغدد الليمفاوية العنقية سطحية) والعقد الليمفاوية البعيدة (DLN)، التي تضم المساريقي، مأبضي، الاربية، وأسفل الظهر، والغدد الليمفاوية الذيلية. خلايا وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة نظام مراقبة الأصول الميدانية المناسبة للتحقق من انتشار الخلايا التائية.
ملاحظة: في هذا CFSE خلية تجربة تتبع، CFSE المسمى خلايا T من السيطرة على الفئران المحقونة برنامج تلفزيوني تأسيس مضان الأساس لعدم دىviding الخلايا. انقسامات الخلية من المتكاثرة، وتصور، الخلايا المسمى CFSE-حفز مستضد عن طريق قياس قمم مضان 12،13. مع تحكم في برنامج تلفزيوني، وعدد من انقسامات الخلية من المتكاثرة، وخلايا T وصفت CFSE-يمكن تحديد 12،13. - تحليل البيانات تكاثر الخلايا المسمى CFSE بمقارنة عدد من انقسامات الخلية أو قمم بين العينات (الشكلان 1 و 2).
ملاحظة: على سبيل المثال، CFSE المسمى، وخلايا T-OVA محددة نقل adoptively في الفئران المتلقي تلقي مستضد OVA سيخضع انتشار نشاطا مقارنة مع السيطرة على الفئران المحقونة برنامج تلفزيوني 5،12. وعلاوة على ذلك، من الجدير بالذكر أن نشير إلى أن هناك العديد من الطرق لتحليل البيانات تكاثر الخلايا CFSE، كما يتبين من هوكينز وزملاؤه 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تنقية الخلايا المغناطيسية من الخلايا الليمفاوية يسمح للمستخدمين لتنقية السكان الخلية المستهدفة في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. باستخدام بروتوكول استنزاف لدينا، كنا قادرين على زيادة النسبة المئوية للخلايا التائية CD8 (OT-I في وتفعيل إعادة التركيب الجيني 1 (الفريق الاستشاري-1) الفئران -deficient) من 72.8٪ (قبل تنقية) إلى 94.2٪ (بعد تنقيتها. الشكل 1A) 4،5. ويمكن بعد هذه الخلايا الليمفاوية تنقيته أن تستخدم لفحوصات وظيفية المصب لتحديد انتشار الخلايا اللمفاوية ونقل الإشارة 4،5. على سبيل المثال، يمكن أن ندرس في الجسم الحي T قدرة تحفيز الخلايا من ناقلات الجنود المدرعة عن طريق نقل المسمى CFSE، خلايا تي مستضد معين في wildtype (WT) ومتحولة (MT) الفئران تحصين مع مستضد مناسبة 5.
في تجربة تمثيلية لدينا، ونقل النقي، وصفت CFSE، ألبومين البيض (OVA) محددة OT-I CD8 T جملتعلمي اللغة اإلنكليزية إلى سيطرة (WT) ومتحولة الفئران (MT)، وتحصين هذه الفئران بعد يوم واحد من البروتين OVA. بعد ثلاثة أيام التحصين، ونحن تحصد الغدد الليمفاوية (القريبة والبعيدة) والطحال وتحليل خلايا T التدفق الخلوي. ويمكن استخدام CD45 أشكال أليلية لأفضل فصل الفاصل، CFSE المسمى والجهات المانحة خلايا OT-I CD8 من المتلقي الخلايا غير المسمى، CD8 T. في هذا المثال، المانحة والمتلقية الخلايا من CD45.1 وCD45.2 الفئران، على التوالي (الشكل 1B). وتستخدم مستويات CFSE من الباقين على قيد الحياة، وخلايا OT-I T unstimulated عند هذه النقطة الوقت لتحديد الذروة للخلايا غير المتكاثرة (الشكل 1C، الخط المنقط). على التحفيز، وشدة مستويات CFSE في الخلايا OT-I T يقلل بمقدار النصف مع كل شعبة. تي تكاثر الخلايا وبذلك يمكن تحديد عن طريق حساب عدد من CFSE قمم 6،12. في نتائج تمثيلية لدينا، ونحن لا نرى الاختلافات في القدرات عبر تقديم WT وMT ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1C، خطوط الصلبة)، منذ خلايا T تتكاثر بمعدلات مماثلة في كل من الفئران.
في تجربة منفصلة، أجرينا [3 H] التأسيس -thymidine فحص لدراسة تكاثر الخلايا من السيطرة تنشيط الخلايا وMT تي. وقد حفز خلايا تنقيته WT وMT T مع مختلف المحفزات لمدة 48 ساعة ونابض مع [3 H] -thymidine ل8 ساعة الأخيرة. وتكاثر الخلايا في S-مرحلة من مراحل دورة الخلية دمج النوكليوتيدات رديولبلد، [3 H] -thymidine، إلى حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين تصنيعه حديثا (DNA)، لذلك، وذلك باستخدام عد التلألؤ السائل، ويمكن قياس تكاثر الخلايا بواسطة [3 H] امتصاص -thymidine. عدد من التهم في الدقيقة (CPM) يرتبط بشكل مباشر مع كمية من [3 H] امتصاص -thymidine في تكاثر الخلايا T. في نتائج تمثيلية، وانخفاض عدد التدوير تم الحصول عليها من خلايا MT T على التحفيز مقارنة جounts من خلايا WT T تشير إلى قدرة التكاثري للخطر من خلايا MT T (1D الشكل).
لتحديد الخلايا البائية قدرة التكاثري، ونحن تنقية الخلايا البائية الطحال باستخدام استراتيجية استنزاف وصفها. على تنقية، كنا قادرين على زيادة النسبة المئوية للخلايا B220 B (WT الفئران) من 63.9٪ (قبل تنقية) إلى 98.4٪ (بعد تنقيتها، الشكل 2A) 4. مماثلة لتنقية خلايا تي، الخلايا البائية الطحال النقاء يمكن أن تستخدم أيضا لالمقايسات الفنية المصب لتقييم انتشار الخلايا اللمفاوية ونقل الإشارة 4. وفي وقت لاحق، ونحن المسمى خلايا الطحال WT النقاء B مع CFSE وتحفيز هذه الخلايا في المختبر باستخدام لوحات مغلفة مع مكافحة CD40 تستكمل مع خلوى IL-4. بعد ثلاثة أيام من التحفيز، وقمنا بتحليل قابلة للحياة، وخلايا B تفعيلها من خلال التدفق الخلوي. مستويات CFSE من الباقين على قيد الحياة، وتستخدم الخلايا البائية unstimulated في هذه المرحلة من الوقت لتحديد الذروة للخلايا غير المتكاثرة (الشكل 2B، الخط المنقط). مماثلة لخلايا T، فإن شدة مستويات CFSE في خلايا B يقلل بمقدار النصف مع كل شعبة 6،12.
الشكل 1: الشخصية CFSE من adoptively خلايا OT-I T تنقيته نقل بعد التحصين (A) CD4 و CD8 تلطيخ الخلايا المعزولة من OT-I؛ الفريق الاستشاري-1-نقص الفئران قبل (اللوحة العليا) وبعد (اللوحة السفلى) استنزاف الخلايا غير T. (B) المؤامرات FACS التمثيلية للخلايا T من الطحال (SP)، والعقد الليمفاوية القريبة (PLN)، والعقد الليمفاوية البعيدة (DLN). الجهات المانحة خلايا OT-I CD8 T وCD45.1 إيجابي. ملامح (C) الممثل CFSE من، وصفت CFSE-OT-I المانحة خلايا T نقلها من الطحال (SP)، والعقد الليمفاوية القريبة (PLN)، والعقد الليمفاوية البعيدة (DLN) من WT (مظللة منحنيات) وMT (خطوط الصلبة) الفئران المتلقي 3 أيام بعد التطعيم مع البروتين OVA وLPS. خط منقط يشير خلايا OT-I T من الفئران المتلقي WT دون التحصين (حقن PBS). (د) تكاثر الخلايا من السيطرة المنشط أو خلايا تي MT مقاسا [3 H] فحص امتصاص -thymidine. يتم عرض النتائج في التهم لكل دقيقة (CPM). السيطرة النقاء (بار مفتوح) أو MT (شريط مغلقة) وحضنت الخلايا T لمدة 48 ساعة في المتوسط فقط (المتوسطة) أو في وجود محدد لوحة لمكافحة CD3 أو مكافحة CD3 زائد مكافحة CD28 مع أو بدون ايل المؤتلف 2. واندلعت تنشيط الخلايا بولكلونل من قبل سلطة النقد الفلسطينية (phorbol استر) وA23 (حامل الأيون الكالسيوم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الشخصية CFSE منالخلايا البائية عليها في المختبر التحفيز. (A) B220 وCD3 تلطيخ الخلايا الطحال معزولة عن WT الفئران قبل (اللوحة العليا) وبعد (اللوحة السفلى) استنزاف الخلايا غير B. (ب) لمحة الممثل CFSE من WT المسمى CFSE (منحنى مظللة) خلايا B الطحال بعد 3 أيام في المختبر التحفيز مع لوحات مغلفة مع مكافحة CD40 وIL4. خط منقط يشير المسمى CFSE خلايا WT B دون التحفيز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود إجراءات لتنقية الخلايا الليمفاوية من الأجهزة اللمفاوية. تنقية الخلايا باستخدام الفرز حبة المغناطيسي هي طريقة سريعة وبسيطة يمكن أن ينتج قابلة للحياة، الخلايا المستهدفة عالي النقاء.
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
بقاء الخلية والعائد الخلية
الحفاظ على سلامة خلايا النسب المكونة للدم في المختبر أمر بالغ الأهمية لضمان التجارب الناجحة وقابلة للتكرار. الكيميائية والبيولوجية والكواشف، الظروف التجريبية دون المستوى الأمثل أو ظروف التخزين غير لائق من أجهزة رفعه يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية. على الختان من الفئران، تحتاج إلى تخزينها على الجليد وتعليق خلية واحدة مستعدة في أقرب وقت ممكن الأجهزة اللمفاوية. وينبغي أيضا تجنب السرعة الفائقة الطرد المركزي من الايقاف الخلية. وعلاوة على ذلك، ينبغي خففت الكريات الخلية عبها أنابيب مع الأصابع بعد إزالة طاف. ليسوأوصت لاعادة تعليق الكريات مباشرة مع كميات كبيرة من المتوسطة من قبل pipetting.
ما يقرب من 2-4 × 10 7 خلايا الطحال B و 2 × 10 7 خلايا تي من جميع الغدد الليمفاوية الرئيسية يمكن أن تكون معزولة عن بعضها الماوس WT القديم أسابيع 8-10. تناقص أعداد تنقية البائية والخلايا التائية (أقل من القيمة المتوقعة) إلى ظروف دون المستوى الأمثل، كما ذكر في وقت سابق.
نقاء خلية
متوسط نقاء خلايا معزولة باستخدام هذا البروتوكول هو في نطاق بين 90 و 95٪، والذي هو محض بما فيه الكفاية لاحقا في المختبر أو في التجارب المجراة (الشكل 1A). ومن المستحسن ألا تفرط في عمود الفصل مع أرقام زائدة من الخلايا خلال عملية الانفصال لأن ذلك يمكن أن تمس نقاء الخلية نظرا لقدرة ملزمة محدودة العمود.
جودة FBS
الجودة FBS المستخدمة لاستكمال مستنبت أمر بالغ الأهمية من أجل بقاء في المختبر من الخلايا الليمفاوية. FBS من مصادر ودفعات مختلفة قد تختلف في قدرتها على دعم في استجابات الخلايا اللمفاوية في المختبر. وبالتالي، فمن المهم لاختبار أنواع مختلفة من FBS العثور على واحد أن يعطي استجابة عالية محددة مع الخلفية منخفضة. وينبغي بعد ذلك احتفظ عدد كبير من زجاجات باعتباره الأسهم.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
شروط وضع العلامات CFSE
على الرغم من CFSE وضع العلامات يعمل في سهل RPMI، وجدنا أن استخدام نسبة منخفضة من FBS في برنامج تلفزيوني يقلل موت الخلايا أثناء عملية التحميل، دون المساس كفاءة وضع العلامات. وعلاوة على ذلك، فإن وجود FBS يقلل من فقدان الخلية أثناء الطرد المركزي.
جانب هام من جوانب CFSE الوسم هو ضمان حتى وسم الخلايا من أجل رؤية ذروة متميزةالصورة التي تمثل انقسام الخلايا. الحمولة الزائدة من CFSE يمكن أن يؤدي إلى زيادة موت الخلايا في المختبر أو ضعف الانتعاش من الخلايا المسمى في الجسم الحي. من ناحية أخرى، وعدم كفاية CFSE وضع العلامات أو عدم التجانس في تعليق خلية الهدف أثناء عملية وضع العلامات يمكن أن يؤدي إلى سوء حلها CFSE قمم 12. وبالتالي، فمن المهم تحسين الظروف CFSE وضع العلامات. يجب أن تبقى كمية CFSE تستخدم لوضع العلامات عند أدنى مستوى ممكن للحد من الآثار السامة المحتملة من الحمولة الزائدة، ولكن لا يزال يحقق العلامات كافية للكشف عن القمم حل لطيف على التحفيز ضمن الإطار الزمني التجريبي. وبالإضافة إلى ذلك، لتجنب قمم سيئة حلها، يجب إزالة كتل الخلايا من تعليق خلية واحدة قبل CFSE التحميل.
كتل الخلايا وفقدان الخلية
ومن الأهمية بمكان التأكد من أن الخلايا تماما إعادة علقت قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لأن remova دائملتر من كتل الخلايا خلال التجربة يخفض بشكل كبير أعداد الخلايا. عادة ما ترتبط كتل الخلايا مع انخفاض بقاء الخلية أو عدم كفاية اعادة تعليق بيليه الخلية.
CFSE والأطياف الانبعاثات التداخل
خلايا CFSE المسمى يمكن زيادة المعرفة مع الأجسام المضادة fluorophore مترافق بعد يوم واحد في الثقافة، ولكن هذه الخلايا المسمى CFSE لا تزال فلوري الزاهية بعد يوم في الثقافة. باستخدام مزيج من الأجسام المضادة مترافق fluorophores مشرقة مع كميات ضئيلة من التداخل أطياف الانبعاث مع CFSE، مثل فيكوإيريترين (PE) وفيكوإيريترين-cyanine 7 (PeCy7)، يقدم نتائج تلطيخ الأمثل. ومع ذلك، والتعويض للحد ما زالت هناك حاجة أطياف الانبعاث التداخل. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لكثافة عالية من CFSE إشارة (FL-1 قناة) الذي يصب في قناة FL-2، قناة FL-2 يجب أن يكون التعويض عن طريق خصم نسبة عالية من قيمة FL-2 لتحقيق التقيدالملف الشخصي آي مال CFSE. يمكن للمرء أن يشير إلى ورقة نشرتها كواه وآخرون، والتي توفر حلولا لوصفها استكشاف الأخطاء وإصلاحها CFSE وتحليل نتائج 12.
بدائل لCFSE
طيف انبعاث CFSE يقيد استخدام مزيج من CFSE مع المشتقات فلوريسئين مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وثيوسيانات فلوريسئين (FITC) الأجسام المضادة -conjugated. هناك، ومع ذلك، وغيرها من الأصباغ خلية المتاحة تجاريا مع كثافة عالية بالتساوي مضان وسمية منخفضة خلية في اللون البنفسجي (CTV، الإثارة / الانبعاثات: 405/450 نانومتر) والأصفر (كتي، 555/580 نانومتر)، أحمر بعيد (CTFR، 630 / 661 نانومتر أو CPD670، 647/670 نانومتر) والأحمر (PKH26، 551/567 نانومتر). باستخدام الأصباغ خلية وضع العلامات مع أطياف الانبعاث مختلفة توفر المرونة في التصميم التجريبي. من ناحية أخرى، ليس كل من الأصباغ خلية وضع العلامات المذكورة أعلاه يمكن أن تولد متميزة قمم انقسام الخلايا. أجريت دراسة مقارنة باستخداموخلصت الأصباغ المختلفة خلية البطاقات التي CTV هو استبدال أفضل لCFSE لCTV يمكن من اكتشاف عدد من ذروات انقسام الخلايا واضحة المعالم (13).
القيود
الحد الرئيسي لفرز الخلايا المغناطيسي هو أنه لا يصلح إلا للفرز الخلايا بسيط. في هذا المثال، يمكن أن نستخدم CD43 في استنزاف جميع الخلايا غير B-من الطحال. ومع ذلك، ونحن لن تكون قادرة على فصل الخلايا البائية مسامي من منطقة هامشية الخلايا البائية. ويمكن تعريف هؤلاء السكان الفرعي فقط مع علامات سطح متعددة. في حين أنه من الممكن لتحديد إيجابيا الخلايا باستخدام الخلايا المغناطيسية الفرز على أساس علامات سطح متعددة، أنها تعتمد على الكواشف معدة خصيصا، المتاحة تجاريا التي تمكن من الافراج عن ميكروبيدات من الخلايا المستهدفة بعد الجولة الأولى من الفرز قبل الانتقال إلى علامة ثانية. وبالتالي، فإن المستخدم سيكون تعتمد اعتمادا كليا على مجموعات المتاحة تجاريا. في مثل هذه الحالة، FACS طهو أكثر فائدة بكثير في فصل السكان خلية المكرر.
أهمية تقنية
خلية فرز النهج القائم على الأجسام المضادة، مثل فرز الخلايا المغناطيسي ونظام مراقبة الأصول الميدانية، هي الخلايا الأكثر موثوقية فرز التقنيات حتى الآن 15. وسائل أخرى للفصل الخلية موجودة، بما في ذلك التقنيات المعتمدة الكثافة وعلى أساس الالتزام، ومع ذلك، الخلايا الليمفاوية هي الخلايا سيئة ملتصقة والقطعان متشابهة نسبيا في الكثافة، وبالتالي adherence- وتقنيات إما أن تكون غير قابلة للتطبيق على أساس الكثافة أو غير فعالة جدا 15 .
كما ذكر في المقدمة، سريعة وبسيطة، وارتفاع بقاء الخلية، ومستقلة عن أي معدات متطورة هي ملامح الفائز من الخلايا المغناطيسية فرز أكثر من نظام مراقبة الأصول الميدانية. ولا سيما، نضوب السلبي باستخدام الخلايا المغناطيسية فرز العلامات ويستنزف الخلايا غير المرغوب فيها باستخدام عمود الفصل المغناطيسي، وعزل الخلايا المستهدفة مع الحد الأدنى من modificatioنانو ثانية إلى سطح الخلية والحفاظ على الدولة ساذجة.
التطبيقات المستقبلية
الخلايا اللمفية عالي التخصيب، قابلة للحياة، وساذجة تنقيته باستخدام هذه التقنية تنقية مقرها المغناطيسي يمكن أن تخضع لفحوصات وظيفية مختلفة من السلوك لمفاوية ويشير الآليات في التجارب المختبرية والحية. في هذا البروتوكول، وأثبتنا باستخدام اثنين من مختلف المقايسات تكاثر الخلايا - [3 H] -thymidine فحص التأسيس وCFSE تكاثر الخلايا الفحص - للتحقيق قدرات خلية التكاثري من الخلايا اللمفية تفعيلها.
الاختيار بين [3 H] -thymidine فحص التأسيس وCFSE تكاثر الخلايا فحص يعتمد إلى حد كبير على حجم العينة والظروف التجريبية. الاستفادة من [3 H] فحص التأسيس -thymidine في تجارب مع أحجام عينة كبيرة يولد البيانات تكاثر الخلايا الإنتاجية العالية. من أجل ضمان الأمثل [<سوب> 3 H] امتصاص -thymidine واستنساخ نتائج، [3 H] -thymidine يجب أن تضاف إلى ثقافة عندما تكون الأغلبية من الخلايا هي تقسيم بنشاط. مطلوب الأمثل لوضع العلامات بروتوكول لأنواع مختلفة من الخلايا والمحفزات. وعلاوة على ذلك، نظرا لطبيعة المشعة من [3 H] -thymidine، لا يمكن إلا أن يتم تنفيذ هذا الاختبار في المختبر التأسيس، على عكس وضع العلامات CFSE من الخلايا، والتي يمكن تفعيلها في المختبر (الشكل 2B) أو adoptively نقلها إلى الفئران المتلقي (الشكل 1B و1C).
وCFSE تكاثر الخلايا الفحص، من ناحية أخرى، ويقدم المزيد من المعلومات عن انتشار الخلايا من [3 H] التأسيس -thymidine. منذ كثافة CFSE في الخلايا المسمى CFSE يقلل بمقدار النصف مع كل انقسام الخلايا، يمكن للمرء تحديد عدد من الانقسامات الخلوية ونسبة الخلايا في كل قسم عن طريق حساب عدد وحجم القمم
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويدعم هذه الدراسة من قبل وزارة التربية والتعليم، سنغافورة (AcRF Tier1-RG40 / 13 و Tier2-MOE2013-T2-2-038). تم تحرير مخطوطة كتبها ايمي سوليفان من Obrizus الاتصالات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
- Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765 (2013).
- Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
- Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
- Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
- Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).
