Method Article

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

DOI:

10.3791/54596

⸱

October 30th, 2016

 ,  , 
1School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الليمفاوية هي اللاعبين الرئيسيين في الاستجابات المناعية التكيفية. هنا ، نقدم بروتوكول تنقية الخلايا الليمفاوية لتحديد الوظائف الفسيولوجية للجزيئات المرغوبة في تنشيط الخلايا الليمفاوية في المختبر وفي الجسم الحي. الإجراءات التجريبية الموصوفة مناسبة لمقارنة القدرات الوظيفية بين الخلايا الليمفاوية الضابطة والخلايا الليمفاوية المعدلة وراثيا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تتمتع < p class = 'jove_content'>B و T ، بذخيرتها المتنوعة للغاية من مستقبلات المستضد ، بالقدرة على تكوين استجابات مناعية محددة ضد أي مسببات ممرض غازيةتقريبا 1،2. من المفهوم أن هذه القدرات المعقدة يتم التحكم فيها بواسطة عدد كبير من الجزيئات المشاركة في العمليات الخلوية المختلفة لضمان الاستجابات المناعية المنظمة في الوقت المناسبومكانيا 3. هنا ، نصف الإجراءات التجريبية التي تسمح بالعزل السريع للخلايا الليمفاوية الفئرانية عالية النقاء باستخدام تقنية فرز الخلايا المغناطيسية. يمكن بعد ذلك إخضاع الخلايا الليمفاوية المنقاة الناتجة لفحوصات وظيفية مختلفة في المختبر أو في الجسم الحي ، مثل تحديد قدرة إشارات الخلايا الليمفاوية عند التحفيز عن طريق النشاف المناعي4 والتحقيق في القدرات التكاثرية عن طريق دمج 3H-thymidine أو وسم كربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات إستر السكسينيميديل (CFSE)5-7. بالإضافة إلى مقارنة القدرات الوظيفية للتحكم والخلايا الليمفاوية المعدلة وراثيا ، يمكننا أيضا تحديد القدرة التحفيزية للخلايا التائية للخلايا العارضة للمستضد (APCs) في الجسم الحي ، كما هو موضح في نتائجنا التمثيلية باستخدام خلايا OT-I T المزروعة المسماة CFSE.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجد الخلايا الليمفاوية الناضجة بشكل عام في حالة الراحة إذا لم تكن هناك عدوى أو التهاب موجود مسبقا في الفرد. لذلك ، من المهم الاحتفاظ بالحالة الساذجة للخلايا الليمفاوية أثناء عملية العزل قبل إجراء المقايسات الوظيفية في المختبر أو في الجسم الحي. المفتاح لضمان نتائج متسقة وقابلة للتكرار هو الحد من أي تلاعب غير ضروري بالخلايا.

يستخدم فرز الخلايا المغناطيسية

الأجسام المضادة والحبيبات الدقيقة لتسمية الخلايا لإثراء الخلايا ذات الأهمية. مع هذا النهج ، هناك استراتيجيتان للتنقية: الإثراء الإيجابي والاستنفاد السلبي. يثري التخصيب الإيجابي مجموعة الخلايا ذات الأهمية باستخدام جسم مضاد يرتبط بالخلايا المستهدفة. من ناحية أخرى ، يؤ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هي ولدت كل الفئران والمحافظة في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وتجرى جميع البروتوكولات الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. إعداد المخازن والكواشف

  1. إعداد المعهد التذكاري الكامل روزويل بارك (RPMI) متوسطة (10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، البنسلين (100 وحدة دولية / مل) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، 55 ميكرومتر 2-المركابتويثانول ).
  2. إعداد 20x والمتواز....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية الخلايا المغناطيسية من الخلايا الليمفاوية يسمح للمستخدمين لتنقية السكان الخلية المستهدفة في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. باستخدام بروتوكول استنزاف لدينا، كنا قادرين على زيادة النسبة المئوية للخلايا التائية CD8 (OT-I في وتفعيل إعادة التركيب الجيني 1 (الفريق الاستشاري-1) الفئران -deficient) من 72.8٪ (قبل تنقية) إلى 94.2٪ (بعد تنقيتها. الشكل 1A) 4،5. ويمكن بعد هذه الخلايا الليمفاوية تنقيته أن تستخدم لفحوصات وظيفية المصب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود إجراءات لتنقية الخلايا الليمفاوية من الأجهزة اللمفاوية. تنقية الخلايا باستخدام الفرز حبة المغناطيسي هي طريقة سريعة وبسيطة يمكن أن ينتج قابلة للحياة، الخلايا المستهدفة عالي النقاء.

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

بقاء الخلية والعائد الخلية

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم هذه الدراسة من قبل وزارة التربية والتعليم، سنغافورة (AcRF Tier1-RG40 / 13 و Tier2-MOE2013-T2-2-038). تم تحرير مخطوطة كتبها ايمي سوليفان من Obrizus الاتصالات.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>المواد< قوي>
RPMI 1640 (بدون L-Glutamine)Gibco31870025
مصلالجنيني تعطيل الحرارة 
L-glutamineGibco25030024
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140114
2-mercaptoethanolGibco21985023
الميكروبيدات المغناطيسية المضادة ل CD43Miltenyi Biotec130-049-801امزج جيدا قبل الاستخدام
الميكروبيدات StreptavidinMiltenyi Biotec130-048-101تخلط جيدا قبل الاستخدام
الخرز المغناطيسي المضاد للملحق VMiltenyi Biotec130-090-201خلط جيدا قبل الاستخدام
MACS LD & nbsp ؛Miltenyi Biotec130-042-901
96 جيدا U-bottom لوحة ثقافة معقمةGreiner Bio-one650180
96-well F-bottom لوحة ثقافة معقمةGreiner Bio-one655180
100 & mu ؛ شبكةللتعقيم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية قبل الاستخدام
0.2 & mu ؛ m  وحدات التصفية المعقمة التي يمكن التخلصNalgene567-0020يمكن استبدالها بأي جهاز تصفية معقم
CellTrace VioletInvitrogenC34557CTV لفترة قصيرة ؛ بديل ل CFSE
CellTrace YellowInvitrogenC34567CTY لفترة قصيرة ؛ بديل ل CFSE
CellTrace Far RedInvitrogenC34564CTFR لفترة قصيرة ؛ بديل ل CFSE
صبغة تكاثر الخلايا eFluor 670eBioscience65-0840CPD670 لفترة قصيرة ؛ بديل ل CFSE
PKH26Sigma AldrichPKH26GLPKH26 ، بديل ل CFSE
strong>Name< / strong>CompanyCatalog NumberComments
Chemicals
سكر العنبسيجما ألدريتشG7021
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشP5655
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشS5136
الفينول الأحمرسيجما ألدريتشP0290
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشC7902
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتشP5405
كلوريد الصوديومميرك ميليبورS7653يمكن استخدامه من مصادر
أخرى كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتسيجما ألدريتشM2393
كبريتات المغنيسيومسيجما ألدريتشM2643
كلوريد الأمونيومسيجما ألدريتشA9434
تريس بیس
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش   ؛D8418
(5- (و 6-) كربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات إستر السكسينيميديل (CFSE) المجساتالجزيئيةC-1157إعادة التكوين في DMSO
Phorbol 12،13-dibutyrate (PBDU ، Phorbol ester)Sigma AldrichP1269
A23187 (أيونوفور الكالسيوم)Sigma AldrichC7522
Name< / strong>Company< / strong> <قوي>رقم الكتالوجتعليقات
> الأجسام المضادة والبروتين المؤتلف
CD11b البيوتين (استنساخ m1 / 70)Biolegend101204كوكتيل استنفاد الخلايا
التائية CD11c البيوتين (استنساخ N418)Biolegend117304كوكتيل استنفاد الخلايا
التائية Gr-1 البيوتين (استنساخ RB6-8C5)كوكتيل Biolegend108404استنفاد الخلايا التائية
Ter119 البيوتين (استنساخ Ter119) Biolegend116204كوكتيل استنفاد الخلايا
التائية TCR-& جاما ؛ & دلتا. البيوتين (استنساخ GL-3)Biolegend118103كوكتيل استنفاد الخلايا التائية
CD19 البيوتين (استنساخ 6D5)Biolegend115504كوكتيل استنفاد الخلايا التائية
B220 البيوتين (استنساخ RA3-6B2)Biolegend103204كوكتيل استنفاد الخلايا التائية
CD49b البيوتين (استنساخ DX5)Biolegend108904كوكتيل استنفاد الخلايا التائية
CD4 البيوتين (استنساخ GK1.5)Biolegend100404كوكتيل استنفاد الخلايا
التائية CD8 البيوتين (استنساخ 53-6.7)كوكتيل استنفاد الخلايا التائيةBiolegend100704
F (ab')2 ماعز مضاد للفأر IgM (لوحة مطلي)Jackson ImmunoResearch 115-006-07550 & micro; لتر / بئر للطلاء (96 بئر)
مضاد للفأر CD40 مللي أمبير (مطلي بالألوان)Pharmingen & nbsp ؛55372250 & ميكرو; لتر / بئر للطلاء (96 بئر)
المؤتلف IL-4ProSpec   ؛Cyt-282
LPS من الإشريكية القولونية النمط المصلي 055: B5Sigma AldrichL-4005
Anti-CD3 (استنساخ استنساخ OKT3) (لوحة مطلية)eBioscience   ؛16-0037-8550 & مايكرو; لتر / بئر للطلاء (96 بئر)
مضاد ل CD28 (استنساخ استنساخ 37.51) (مطلي بالألوان)eBioscience   ؛16-0281-8550 & مايكرو ؛ لتر / بئر للطلاء (96 بئر)
المؤتلف IL-2ProSpecCyt-370
الألبومين من بياض بيض الدجاج ، OvalbuminSigma AldrichA7641
الأبقار مصفاة الخلايا m منها <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
  2. LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  3. Brownlie, R., Zamoy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Murine LymphocytesMagnetic Cell SortingB Cell PurificationT Cell PurificationFlow CytometryCFSE LabelingImmunoblottingTritiated Thymidine IncorporationAntigen Presenting CellsMagnetic Micro Beads

Related Articles