Protocol
모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 조건에서 유지되고 모든 마우스 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 실시하고있다.
버퍼 및 시약 1. 준비
- 55 μM 2- 머 캅토 에탄올을 완료 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 페니실린 (100 IU / ㎖) / 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖)을 제조 ).
- 별도로, 20 배 균형 소금 용액 (BSS) 주식 1 재고 2를 준비합니다.
- 20 배 BSS의 1 개 (1 L 멸균 111 mM의 포도당, 8.8 MM의 인산 칼륨, 26.7 mM의 인산 나트륨)를 준비하고 최종 볼륨 조정하기 전에 20 배 BSS의 1 개에 40 ㎖의 0.5 % 페놀 레드를 추가합니다. 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터.
- 20 배 스톡 BSS 2 (25.8 mM의 염화 칼슘 이수화 물, 107 mM의 염화칼륨, 2.73 M 나트륨 CH 준비loride 19.6 mM의 염화 마그네슘 육수화물, 1- L 멸균 16.6 mM의 마그네슘 설페이트). 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터.
- 400 ml의 멸균 각각 별도로, 50 ㎖ BSS의 1 개 및 50 ml의 BSS 주식이 희석, 실험적인 사용을 위해 1X BSS를 준비합니다. 모두 희석 솔루션을 결합하여 pH 7로 조정하고, 20 ㎖의 FBS (2 %)를 추가합니다. 0.2 μm의 필터를 사용하여 멸균 및 살균 필터를 사용하여 1 L까지 최고.
참고 : 농축 BSS 주식 혼합 직접 침전이 발생할 수 있기 때문에 BSS의 재고 솔루션은 별도로 준비해야한다.
- 적혈구 (RBC) 용해 버퍼
- , RBC 용해 버퍼를 준비 사용하기 전에 1 부품 재고 트리스베이스 (멸균 130 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄, 산도 7.65) 9 부에게 재고 암모늄 클로라이드 (멸균 155 MM의 염화 암모늄)를 혼합합니다.
참고 : 4 ° C에서 염화 암모늄 및 트리스베이스의 저장 멸균 재고 솔루션을 제공합니다. 용해 B를 제조적혈구의 효율적인 용해를 보장하기 위해 신선한 uffer.
- , RBC 용해 버퍼를 준비 사용하기 전에 1 부품 재고 트리스베이스 (멸균 130 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄, 산도 7.65) 9 부에게 재고 암모늄 클로라이드 (멸균 155 MM의 염화 암모늄)를 혼합합니다.
비장 또는 림프절에서 림프구 서스펜션의 2 세대
주 : 마우스를 안락사 이전 실험에 필요한 모든 시약 및 장치를 제조 및 높은 세포 생존율을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 림프구의 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 중요하다.
- 자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식에 의해 실험 마우스를 안락사.
참고 : 이후이 단계에서 모든 실험 절차는 무균 적으로 수행해야합니다. - 어떤 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 전체 마우스를 찍어. 비장과 림프절 무균 8을 제거하고 또는 (단계 1.2.3에서) BSS / FBS (2 % FBS와 RPMI) 5 ml의 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS를 포함하는 별도의 15 ml의 튜브에 배치합니다.
주 : BSS 효율적 RBC 용해를 방지하기 때문에, 비장 세포 현탁액의 제조 RPMI를 사용 afte BSS로 전환R RBC 용해. - 2 ml의 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS 또는 BSS / FBS를 포함하는 페트리 접시에 멸균 100 μm의 셀 스트레이너 메쉬의 두 조각 사이에있는 기관 (들)을 배치, 비장이나 림프 노드에서 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 그것은 매우 미세한 부분으로 찢어 때까지 1 ml의 주사기의 플런저를 사용하여, 기관 (들) 매쉬.
- 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고, 셀 스트레이너 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS 또는 BSS / FBS 메쉬 씻는다. 나머지 세포 현탁액을 수집 같은 15 ML 튜브에 추가하고, 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운. 뜨는을 제거합니다.
주 : 다음 단계에서 RBC 용해 버퍼 또는 매체를 추가하기 전에 손가락으로 튜브를 flicking하여 펠렛 세포를 일시 중지 다시. - 세포 현탁액을 원심 분리 동안 실온 (RT) RBC 용해 버퍼를 준비한다 (단계 1.3 참조.). 상층 액을 세포를 펠렛 및 제거한 후, 매 10 8 세포를 1 ml의 RBC 용해 버퍼와 세포를 다시 일시 중지합니다. 인큐BATE 3-4 분 동안 RT에서 분해 반응.
- 14 ml의 얼음처럼 차가운 BSS / FBS와 RBC 용해를 중지하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운.
B 및 T 세포의 정제 3.
- B 세포의 정제
- 혈구 세포를 사용하여 계산. 300 ㎕의 BSS / FBS 최대 10 8 비장 세포를 다시 일시 중지하고 50 μl의 항 CD43에게 자기 마이크로 비드 9,10를 추가합니다. 죽은 세포를 제거 30 μl를 넥신 V 자석 구슬을 추가합니다. 30 분 동안 4 ℃로 냉장고에 세포 현탁액을 부화.
- T 세포의 정제
- 혈구 세포를 사용하여 계산. 비 T 세포 고갈 항체 칵테일 10 8 세포 (CD19, B220, GR-1에 대한 비오틴 항체까지 다시 일시 중지, TCR-γδ, CD49b, 중 CD11c, CD11b를, Ter119 및 CD4 또는 CD8은에 표적 세포 인구에 따라 / FBS -4,5- 200 μL의 BSS 200 :) 정제 1 희석. A의 세포 현탁액을 부화15 분 동안 4 ° C 냉장고.
- 배양 후, 세포를 세척하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운 10 ml의 BSS / FBS를 추가합니다. 상층 액을 제거하고 30 μL의 스트렙 타비 딘 마이크로 비드 15 ㎕를 넥신 V 자기 구슬 165 μL의 BSS / FBS에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 30 분 동안 4 ℃로 냉장고에 세포 현탁액을 부화.
주 : 심지어 자기 마이크로 비드와 라벨을 보장 15 분 동안 마이크로 비드와 세포를 배양 한 후 15 ML 튜브를 눌러 부드럽게 세포 현탁액을 혼합 단계 3.1.1 중에 다른 15 분을 품어. 또는 3.2.2.
- 셀 정화를위한 분리 컬럼의 제조
- 세포의 마이크로 비드 라벨 동안 사용되지 않은 분리 컬럼을 준비한다 (단계 3.1.1. 또는 3.2.2.). RT에 (FBS)없이 사전 따뜻한 BSS 및 세척 및 무균 열 평형을 2 ml를 사용합니다. BSS와 평형 후, 세척 된 열은 건조하도록 허용해서는 안된다.
참고 : 우리는 LS의 C를 사용하여olumn 대신 권장 LD 열 인해 재사용 성을 (단계 3.4를 참조하십시오.). - 자기 구슬 표시 한 후, 세포를 세척하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운 14 ml의 BSS / FBS를 추가합니다. 상층 액을 제거하고 1-3 ml의 RT BSS에서 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 정제 과정에서 유속을 감소시키기 위해 열 선단에 멸균 21 G 바늘을 부착. 평형화 컬럼에 세포 현탁액을 넣고 정제 된 표적 세포를 함유 통해 흐름을 수집한다.
주 : 열로드하는 동안에 거품을 도입하지 마십시오. - 1 ml의 BSS / FBS 한 번 컬럼을 세척하고 정제 된 표적 세포를 포함 통해 흐름을 수집합니다. 다시 한번를 통해 흐름에 열을 다시로드합니다. 동일한 15ml를 튜브에 제 2 로딩 돌파 흐름을 수집한다.
- 1 ml의 BSS / FBS와 열을 3 회 세척하고 정제 된 표적 세포를 포함 통해 흐름을 수집합니다. 그 후, 토륨 5 ml의 BSS / FBS를 추가플런저와 전자 칼럼은, 새로운 15 ML 튜브에 열을 밖으로 자기 표지 된 세포를 세척합니다.
- 정제 B 또는 T 세포의 항원 4,5- 표면에 결합하는 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 수집 된 세포의 순도를 확인한다.
- 세포의 마이크로 비드 라벨 동안 사용되지 않은 분리 컬럼을 준비한다 (단계 3.1.1. 또는 3.2.2.). RT에 (FBS)없이 사전 따뜻한 BSS 및 세척 및 무균 열 평형을 2 ml를 사용합니다. BSS와 평형 후, 세척 된 열은 건조하도록 허용해서는 안된다.
- 다시 사용하여 분리 컬럼을
주 : LS 열이 정화 효율에 영향을주지 않고 4 회 이상 재사용 할 수있다.- 5 ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)와, 플런저를 사용하여 상부로부터 증류수 5 mL로 3 회 컬럼을 3 회 세척 하였다.
- 5 ml의 70 % 에탄올로 컬럼을 세척하고 광범위 열에 녹의 축적을 방지하기 위해 공기 탭을 사용하여 열을 건조.
- 별도의 정화 실험을 위해 사용 된 LS 열을 준비하려면, 주사기 어댑터를 사용하여 5 ml의 70 % 에탄올로 아래에서 위로 열을 씻는다. 다음으로, 컬럼의 상단에서 한 번에 5 ml의 PBS 다음에 5 ml의 멸균 PBS로 두 번 아래에서 위로 열을 씻는다. 2 추가ml의 RT BSS는 열 평형을 다음 라벨 세포와 열을로드로 진행합니다.
4. CFSE 라벨 및 자극
주 : 정제 된 세포는 시험 관내의 다양한 생체 기능 분석에서 실시 될 수있다. 여기서는 장갑차 (5)의 T 세포 자극 기능을 결정하기 위해 정제 된 T 세포를 사용한다.
- 37 ° C 이전 CFSE에 로딩 사전 따뜻한 라벨 솔루션 (PBS에서 0.1 % FBS).
참고 : PBS에서 FBS의 낮은 비율을 사용하여이 CFSE 로딩 중 세포 사멸을 감소시키고 원심 분리하는 동안 세포 손실을 최소화 할 수 있습니다. 그러나, 너무 많은 FBS는 CFSE 로딩을 방해 할 수 있습니다. - 라벨 용액으로 두 번 정제하여 세포를 세척 한 다음 15 ㎖의 튜브 예열 라벨링 용액에 2 × 107 세포 / ㎖로 재현 탁.
- 10 μM CFSE의 용액을 제조 하였다 (1 : 500 희석 5mM의 CFSE 원액) 예열 라벨 솔루션이다. CFSE 솔루션해야갓 최적 라벨링을 달성하기마다 준비.
- CFSE로 세포를 로딩하기 위해, 37 ° C에서 10 분 동안 어두운 데에서 15 ㎖의 튜브에 1 부분 10 μM CFSE의 용액에 한 부분에 세포 현탁액을 추가 배양한다. 5 μM CFSE의 최종 농도는 1 × 10 7 세포 / mL의 라벨을 사용한다.
- CFSE 로딩 동안 세포 균질 한 혼합을 보장하기 위해 관마다 2 분 전환.
- 반응을 중지 얼음처럼 차가운 완전한 RPMI 매체의 여러 볼륨을 추가, 4 ° C에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운합니다. 성공적인 CFSE 로딩되면, 세포 펠렛은 황색 표시됩니다.
- 워시 CFSE는 얼음처럼 차가운 완전한 RPMI 배지로 세포를 한 번 더로드 및 체외 배양 또는 생체 자극에 사용하기 전에 4 ° C에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운.
5. 체외 자극
- 바로 사용하기 전에 자극의 2 배 원액 (2 배 자극 원액)를 준비 (10) 그래서배 자극 원액 0 μL를 96 웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕의 최종 부피로 세포 100 μl를 첨가 할 수있다.
- (B 세포 또는 T 세포 CD3 및 CD28 또는 CD40에 대한 IgM의) 자극 코팅 플레이트가 필요할 경우, 밤새 4 ℃에서 PBS에 자극 및 프리 코트 배양 접시를 희석. 대안으로, 배양 용기는 실험 하루에 1 시간 동안 37 ℃에서 코팅 할 수있다. PBS (접시 언제든지 건조하는 것을 허용하지 않는다)로 두 번 코팅 된 판을 씻으십시오.
| B 세포 | |
| 자극 | 최종 농도 |
| F (AB ') 2 염소 항 - 마우스 IgM의 | 0.6-2.4 μg의 / ㎖ |
| 반대로 마우스 CD40 단클론 항체 | 0.5 μg의 / ㎖ |
| 재조합마우스 IL-4 | 25 U / ㎖ |
| 리포 폴리 사카 라이드 | 0.1 μg의 / ㎖ |
| E.에서 (LPS) 대장균 혈청 형 055 : B5 | |
| T 세포 | |
| 자극 | 최종 농도 |
| 항 CD3 (플레이트 코팅) | 2-10 μg의 / ㎖ |
| (50 μL / 웰 코팅) | |
| 안티 CD28 (플레이트 코팅) | 2 μg의 / ㎖ |
| 재조합 IL-2 | 40 U / ㎖ |
| PDBu (포르 볼 에스테르) | 5-50 ng를 / ㎖ |
| A23187 (칼슘 이온 운반체) | ng를 250 / ㎖ |
표 1 : 체외 배양에서 림프구를 자극하는 데 사용되는 자극의 농도.
- CFSE 표지 된 B 세포의 경우, 3 × 105 세포 중으로의 완전한 RPMI 배지 및 배양 6 × 10 3 세포 / ml을 다시 중지 / 웰로 72 시간 동안 96- 웰 편평 바닥 플레이트.
- CFSE 표지 된 T 세포, 0.5~3 × 105 세포 중으로의 완전한 RPMI 배지 및 배양에 0.5~3 × 106 세포 / ㎖로 재 - 정지 / 웰에서 48 또는 72 시간 동안 96 웰 둥근 바닥 플레이트 .
6. 생체 자극
- 생체 자극, 적응 적 전송을위한 마우스 당 4 × 10 6 CFSE 표지 T 세포 (정맥 주사 (IV) 200 ㎕의 PBS에) 각 MHC-일치받는 사람 마우스로.
참고 :이 프로토콜에서, CFSE 표지 T 세포가 적응 적 집 같은 비장과 림프절 등 장기 림프하는 것입니다 이러한 세포로 꼬리 정맥 또는 역 궤도 주사를 이용하여 전송할 수 있습니다. - 일일 나중에 항원받는 사람 마우스에 도전.
노트:OVA 특이 적, T 세포 수용체 (TCR) -transgenic T 세포가 적응 적받는 마우스에 옮겼다 때문에이 예에서는 항원으로서 난 알부민 (OVA 단백질를 50㎍ / 마우스)를 사용한다. 각받는 사람 마우스 (5)로, 피하 주사 (SI)를 통해 멸균 PBS에서 OVA 단백질을 준비하고 OVA 단백질 / PBS 또는 PBS 제어의 100 μl를 주입. - 수확 3 일 OVA 단백질 또는 PBS와 예방 접종 후받는 사람 마우스의 단일 림프 기관에서 세포 현탁액 (림프절과 비장)을 생성합니다. 근위 림프절 장간막, 오금, 사타구니, 허리와 꼬리 림프절을 포함 겨드랑이, 상완 및 표면 경부 림프절) 및 말초 림프절 (DLN)를 포함한다 (PLN),에 별도의 림프절. FACS 적절한 항체를 사용하여 염색 된 세포는 T 세포의 증식을 확인한다.
주 :이 CFSE 셀 추적 실험에서 비 디위한 기준선 형광을 설정 PBS가 주입 된 대조군 마우스로부터 T 세포를 CFSE 표지세포를 이용하므로. 증식 세포 분열은 항원 자극, CFSE 표지 된 세포는 형광 피크 (12, 13)을 측정함으로써 가시화된다. PBS를 제어으로 증식 세포 분열의 수, CFSE 표지 된 T 세포 12,13 결정될 수있다. - 샘플 사이의 세포 분열이나 피크의 수를 비교하여 CFSE 표지 된 세포 증식 데이터를 분석 (도 1 및도 2).
참고 : 예를 들어, CFSE 표지 된, 적응 적 난자 항원을 수신받는 마우스에 전달 OVA 특이 적 T 세포는 PBS가 주입 된 대조군 마우스에 비해 5,12- 활성 증식을 받게 될 것이다. 또한, 호킨스 동료 (14)에 의해 입증 된 바와 같이 CFSE 세포 증식 데이터를 분석하는 다양한 방법이 있다는 것을 지적 주목할 만하다.
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Representative Results
림프구 세포 자기 정화 사용자가 상대적으로 짧은 시간 동안 표적 세포 집단을 정제 할 수있다. 우리 공핍 프로토콜을 사용하여, 정제 후 94.2 % (에 72.8 % (전 정제) 행 (재결합 활성화 유전자 1 (RAG-1) 결핍 생쥐 OT-I) CD8 T 세포의 비율을 증가 할 수 있었다; 도 1a) 4,5. 이러한 정제 림프구는 림프구 증식 및 신호 전달 4,5-을 결정하는 다운 스트림 기능 분석에 사용될 수있다. 예를 들어, 우리는 장갑차의 생체 내 T 세포 자극 능력을 연구 할 야생형 (WT) 및 적합한 항원 5 면역화 돌연변이 (MT) 마우스에 CFSE 표지 된, 항원 특이 적 T 세포를 옮겨서.
우리의 대표 실험에서, 우리는 정제, CFSE 표지, 난백 알부민 (OVA) 특정 OT-I CD8 T에 c 전송제어 (WT) 및 돌연변이 (MT) 마우스에 ELL 학생은과 OVA 단백질과 일일 나중에이 쥐를 면역화. 사흘 면역화 후에는 림프절 (기단 및 말단) 및 비장을 수확하고 유동 세포 계측법에 의해 T 세포를 분석 하였다. CD45 대립 유전자 형태는 더 비 표지받는 CD8 T 세포로부터 분할, CFSE 표지 된 도너 OT-I CD8 세포를 분리하는데 이용 될 수있다. 이 예에서, 기증자와받는 사람 세포 CD45.1와 CD45.2 쥐, 각각 (그림 1B)에서 있습니다. 이 시점에서 생존 CFSE 레벨 비자극 OT-I T 세포 비 증식 세포 (도 1c, 점선)에 피크를 정의하는데 사용된다. 자극시 OT-I T 세포의 수준 CFSE의 강도는 각 부문에 반으로 줄일 수있다. T 세포 증식시켜 CFSE가 6,12 봉우리의 개수를 카운트함으로써 결정될 수있다. 우리의 대표적인 결과에서, 우리는 WT와 MT 장갑차의 크로스 프리젠 테이션 능력의 차이를 (표시되지 않습니다도 1c에 실선)은 T 세포가 모두 마우스에서 비슷한 속도로 증식하기 때문이다.
별도의 실험에서는 작동 제어 및 MT T 세포의 세포 증식을 연구하는 [3 H] - 티미 딘 혼입 분석을 수행 하였다. 정제 된 WT 및 MT T 세포는 48 시간 동안 다양한 자극과 자극 최종 8 시간 동안 [3 H] 티미 딘와 펄스했다. 세포주기의 S 단계에서 세포 증식하는 방사성 표지 된 뉴클레오티드를 포함 할 것이다 [3 H]를 티미 딘, 새로 합성 된 데 옥시 리보 핵산 (DNA)에 따라서, 액체 섬광 계수를 이용하여 세포 증식에 의해 측정 될 수있다 [3 H] 티미 딘 흡수. 분 (CPM) 당 카운트의 수는 직접적으로 T 세포 증식에 [3 H] - 티미 딘 흡수의 양에 상관. 우리의 대표적인 결과, 자극에 MT T 세포로부터 얻은 CPM의 감소 된 수는 C에 비해WT T 세포에서 ounts는 MT T 세포 (그림 1D)의 손상 증식 능력을 나타냅니다.
B 세포의 증식 능력을 결정하기 위해 상술 한 플리 전략을 사용하여 비장 B 세포를 정제 하였다. 정제시에, 우리는 98.4 %로 (정제 이전) 63.9 %에서 B220의 B 세포 (WT 마우스)의 비율을 증가 할 수 있었다 (정제 한 후,도 2a) 4. T 세포를 정제하여 유사하게, 정제 된 비장 B 세포는 림프구 증식 및 신호 전달 (4) 평가하기 위해 다운 스트림 기능 분석에 사용될 수있다. 다음으로, 우리는 CFSE로 정제 WT 비장 B 세포를 표지 및 사이토 카인 IL-4를 보충 항 CD40으로 코팅 된 플레이트를 사용하여 시험관 내에서 이들 세포를 자극. 세 일간 자극 후에는 유동 세포 계측법에 의해 실행 가능한 활성화 된 B 세포를 분석 하였다. CFSE 생존의 수준은이 시점에서 자극되지 않은 B 세포를 사용비 증식 세포 (그림 2B, 점선)의 피크를 정의합니다. T 세포와 유사하게, B 세포의 수준 CFSE의 강도는 각 부문 6,12 절반으로 줄일 수있다.
도 1 면역화 후 적응 적 전송 정제 OT-I T 세포의 CFSE 프로필 OT-I 세포 분리 (A) CD4 및 CD8 염색]. RAG-1 결핍 마우스 전 (위 패널)과 (하판) 이외의 T 세포 고갈 후. (B), 비장 (SP)에서 T 세포의 대표적인 FACS 플롯 근위 림프절 (PLN) 및 말초 림프절 (DLN). 기증자 OT-I CD8 T 세포는 긍정적 인 CD45.1된다. 비장으로부터 전송, CFSE 표지 된 OT-I 공여체 T 세포 (C) 대표 CFSE 프로필 (SP), 근위 림프절 (PLN) 및 말초 림프절 WT의 (DLN) (곡선 음영) 및MT (실선)받는 사람 마우스 삼일 OVA 단백질과 LPS와 예방 접종 후. 점선 (PBS 주입) 면역없이 WT받는 마우스에서 OT-I T 세포를 나타낸다. [3 H] - 티미 딘 흡수 분석법에 의해 측정 된 활성화 된 제어 또는 MT T 세포 (D) 세포 증식. 결과는 분 (CPM) 당 카운트에 제시되어있다. 정제 된 제어 (오픈 바) 또는 MT (폐쇄 바) T 세포는 매체 만 (중)에서 48 시간 동안 배양 하였다거나 또는 재조합 IL-없이 플레이트 바인딩 항 CD3 또는 항 CD3 플러스 안티 CD28의 존재 2. 클론 세포 활성화는 PMA (포르 볼 에스테르)와 A23 (칼슘 이온 운반체)에 의해 발생했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : CFSE 프로필시험 관내 자극시에 B 세포. (A) 및 B220 (상판) 전 (하판) 비 B 세포 고갈 후 WT 쥐로부터 분리 된 비장 세포의 CD3 염색. (B) 항 CD40과 IL4로 코팅 된 플레이트 시험 관내 자극 3 일 후 CFSE 표지 WT (회색 곡선) 비장 B 세포의 대표 CFSE 프로필. 점선은 자극없이 CFSE 표지 WT B 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 림프 기관에서 림프구를 정제하는 과정을 보여줍니다. 자기 비드 정렬을 사용하여 셀 정화가 가능한 고도로 정제 된 표적 세포를 산출 빠르고 간단한 방법이다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
세포 생존 및 세포 수율
체외에서 조혈 계통 세포의 생존을 유지하는 것은 성공적인 및 재현 실험을 보장하는 데 중요합니다. 화학 및 생물학적 시약, 하위 최적의 실험 조건이나 절제 기관의 부적절한 보관 조건은 모든 세포 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 마우스의 적출 후, 림프 기관 얼음과 가능한 빨리 제조 된 단일 세포 현탁액에 저장 될 필요가있다. 세포 현탁액을 고속 원심 또한 피해야한다. 또한, 세포 펠릿 상층 액을 제거 후 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 느슨하게해야합니다. 그것은 아니다피펫으로 매체의 많은 양의 직접 다시 중단 펠렛에 좋습니다.
약 모든 주요 림프절 2-4 × 10 7 비장의 B 세포와 2 × 10 7 T 세포는 하나의 8-10주 된 WT 마우스에서 분리 할 수 있습니다. 앞서 언급 한 바와 같이 정제 및 B (예상 값 이하) T 세포의 감소 된 수는 서브 - 최적의 조건을 나타낸다.
세포 순도
이 프로토콜을 이용하여 분리 된 세포의 평균 순도는 시험 관내 또는 생체 내 실험 (도 1a)에 후속 충분히 순수 90 ~ 95 %의 범위이다. 이 때문에 열의 제한 바인딩 용량 이렇게하면 세포의 순도를 손상시킬 수 있기 때문에 분리하는 과정에서 세포의 과도한 숫자와 분리 컬럼에 과부하를하지 않는 것이 좋습니다.
FBS의 품질
그만큼FBS의 품질은 배지 림프구를 시험 관내 생존에 중요한 보완하기 위해 사용. 다른 소스와 배치에서 FBS는 체외 림프구의 반응에 지원하기 위해 자신의 능력에 따라 다를 수 있습니다. 따라서, 낮은 배경 높은 특정한 응답을 제공 하나를 찾기 위해 FBS의 종류를 시험하는 것이 중요하다. 병의 상당수는 재고로 확보되어야한다.
수정 및 문제 해결
CFSE 라벨 조건
CFSE 표지 플레인 RPMI 작동하더라도, 우리는 PBS의 FBS의 낮은 비율을 사용하여 라벨링의 효율을 손상시키지 않고,로드 과정 세포 사멸을 감소 시킨다는 것을 발견 하였다. 또한, FBS의 존재 원심 동안 세포 손실을 최소화한다.
CFSE 표지의 중요한 측면은 별개의 피크를 가시화하기 위해 셀에도 표시되도록하는 것이다의 세포 분열을 대표하는. CFSE의 오버로드는 시험 관내 또는 생체 내에서 표지 세포의 가난한 복구 증가 세포 사망을 초래할 수 있습니다. 한편, 표시하는 과정 표적 세포 현탁액 불충분 CFSE 표지 또는 얼룩이 CFSE 12 피크 잘못 해석 될 수 있습니다. 따라서, CFSE 표지 조건을 최적화하는 것이 중요하다. 라벨 사용 CFSE의 양은 과부하 잠재적 독성 효과를 감소시킬 수만큼 낮게, 여전히 실험 기간 내에 자극에 멋지게 해결 피크를 검출하기에 충분한 표시를 달성한다. 또한, 제대로 해결 피크를 피하기 위해, 세포 덩어리는 CFSE 로딩하기 전에 단일 세포 현탁액으로부터 제거한다.
세포 덩어리 및 세포 손실
영구적 remova 때문에 다음 단계로 진행하기 전에 세포가 완전히 재현 탁되도록 중요실험 중 세포 덩어리의 난 크게 세포 수를 감소시킨다. 세포 덩어리는 일반적으로 세포 생존율이 감소 또는 세포 펠렛 불충분 재 현탁액과 연관된다.
CFSE 및 발광 스펙트럼 오버랩
세포가 더 배양 한 일 후 형광 - 복합 항체로 정의 할 수 있습니다 CFSE 표지 그러나, 이러한 CFSE 표지 된 세포는 여전히 문화에서 하루 후 밝은 형광 남아있다. 이러한 피코 에리 트린 (PE) 및 피코 에리 트린 - 시아닌 7 (PeCy7) CFSE와 같은 발광 스펙트럼 오버랩 최소량으로 밝은 형광 접합 된 항체의 조합을 사용하여 최적의 염색 결과를 제공한다. 그러나 보상은 방출 스펙트럼의 중첩이 여전히 필요 줄일 수 있습니다. 또한, 수신 거부를 달성하기 위해 FL-2 값의 높은 비율을 차감하여 보상 할 수있는 FL-2 채널로 유출 CFSE 신호 (FL-1 채널)의 높은 강도의 FL-2 채널이있다 인해imal CFSE 프로필. 하나는 Quah 등., 문제 해결 CFSE 라벨 및 결과 (12)의 분석을위한 솔루션을 제공에서 발표 한 논문을 참조 할 수 있습니다.
CFSE 대안
CFSE의 발광 스펙트럼은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 형광 염료 (FITC) 컨쥬 게이트 항체 형광 유도체 CFSE의 조합의 사용을 제한한다. , 노란색 (CTY, 580분의 555 ㎚), 지금까지 적색 (CTFR, 630 : 바이올렛 동일하게 높은 형광 강도 및 낮은 세포 독성 (450분의 405 nm의 CTV, 여기 / 방출) 다른 상업적으로 이용 가능한 세포 염료는, 그러나,있다 / 661 nm의 또는 CPD670, 670분의 647 ㎚)과 빨간색 (PKH26, 567분의 551 ㎚). 다양한 발광 스펙트럼과 세포 표지 염료를 사용하여 실험 설계에서 유연성을 제공한다. 한편, 상술 한 셀 라벨 염료 모든 별개의 세포 분열 피크를 생성 할 수있다. 비교 연구는 사용하여 수행다양한 세포 표지 염료 CTV 명확히 정의 세포 분열 피크 (13)의 더 많은 수의 검출이 가능하기 때문에 CTV는 CFSE에 대한 더 여분이라고 결론 지었다.
제한
자기 세포 정렬의 주요 제한은 간단 셀 정렬에만 적합하다는 것이다. 우리의 예제에서, 우리는 비장에서 모든 비 B 세포를 고갈 CD43을 사용할 수 있습니다; 그러나 변 연대 B 세포로부터 모낭 B 세포를 분리 할 수 없다. 이 하위 집단은 여러 표면 마커로 정의 할 수 있습니다. 이 양 자기 세포를 사용하여 세포를 여러 표면 마커에 기초하여 정렬이 선택 가능하지만, 제 2 마커를 진행하기 전에 정렬의 첫 번째 라운드 후에 표적 세포의 마이크로 비드의 분리가 가능하게 특별히 제조 된 시판되는 시약에 의존한다. 따라서, 사용자는, 시판 키트에 완전히 의존 할 것이다. 이러한 경우, FACS I훨씬 더 유리한 정제 된 세포 집단을 분리에서이야.
기술의 중요성
자기 세포 정렬 및 FACS 등의 항체 기반의 셀 정렬 방식은, 15 데이트 기술을 정렬 가장 신뢰할 수있는 세포이다. 세포 분리하는 다른 방법은 그러나, 임파구가 잘못 부착 세포는 밀도 계 순응도 기반 기술을 포함하여 존재 및 개체군 따라서 adherence- 밀도 계 적용하거나하지 기술이며, 밀도가 상대적으로 비슷하거나 매우 비효율적 15 .
도입, 신속, 간단, 높은 세포 생존에 언급, 어떤 정교한 장비와 독립적으로 FACS를 통해 정렬 자기 셀의 경력이 기능은 다음과 같습니다. 최소 modificatio와 표적 세포를 단리하는 동안 특히 네거티브 고갈, 자기 분리 컬럼을 사용하여 바람직하지 않은 세포를 라벨 정렬 자기 셀을 이용하여 고갈NS 세포 표면 및 나이브 상태를 유지.
미래의 응용 프로그램
이러한 자기 - 기반 정제 기술을 사용하여 정제 고도로 농축 가능한 한 나이브 림프구 림프구 행동의 다양한 기능 분석 및 시험 관내 및 생체 내에서 시그널링 메커니즘을 실시 할 수있다. 이 프로토콜에서 우리는 두 개의 서로 다른 세포 증식 분석을 사용하여 시연 - [3 H] 티미 딘 통합 분석 및 CFSE 세포 증식 분석 - 활성화 림프구의 세포 증식 능력을 조사하기.
사이의 선택 [3 H]를 티미 딘 혼입 분석 및 CFSE 세포 증식 분석은 주로 샘플 크기 및 실험 조건에 의존한다. 큰 샘플 크기의 실험에 [3 H] - 티미 딘 혼입 분석을 이용하여 높은 처리량 세포 증식 데이터를 생성한다. 위해 <[최적의 보장세포의 대다수가 적극적으로 분할 될 때 SUP> 3 H] - 티미 딘 흡수 및 결과의 재현성 [3 H] - 티미 딘을 배양 물에 첨가한다. 라벨 프로토콜의 최적화가 다른 세포 유형 및 자극을 위해 요구된다. 또한 의한 [3 H] - 티미 딘이 혼입 분석에만 수신자 마우스에 시험 관내 (도 2B)에서 활성화 또는 적응 적 전송 될 수있는 셀의 CFSE 표지 달리 시험 관내에서 수행 될 수있다 (도 1b의 방사능 자연 및 1C).
CFSE 세포 증식 분석, 다른 한편으로는, [3 H] - 티미 딘 혼입보다 세포 증식에 대한 정보를 제공한다. CFSE 표지 된 세포 CFSE의 강도는 각각의 세포 분열 절반으로 감소하기 때문에, 하나의 셀 분할 수와 피크의 수와 크기를 계산하여 각 부문의 세포의 비율을 결정할 수있다
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Acknowledgments
이 연구는 교육, 싱가포르 교육부 (AcRF Tier1-RG40 / 13 Tier2-MOE2013 - T2-2-038)에 의해 지원됩니다. 원고는 Obrizus 통신에서 에이미 설리번에 의해 편집되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
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