Protocol
Todos os ratos são criados e mantidos sob condições específicas livres de patógenos e todos os protocolos do mouse são conduzidos de acordo com as diretrizes da Comissão Cuidado e Uso Institucional Animal.
1. Preparação de Tampões e reagentes
- Prepare completa do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio (10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 UI / mL) / estreptomicina (100 ug / ml), 55 uM de 2-mercaptoetanol ).
- Prepare 20x solução salina equilibrada (BSS) Stock 1 e da 2, separadamente.
- Prepare 20x BSS Estoque 1 (111 mM dextrose, fosfato de potássio 8,8 mM, 26,7 mM fosfato de sódio dibásico em 1 L de água esterilizada) e adicionar 40 ml de 0,5% Fenol Vermelho 20x estoque BSS 1 antes do ajuste de volume final. Filtrar em condições estéreis através de filtro de 0,2 um antes de armazenar a 4 ° C.
- Prepare 20x BSS stock 2 (25,8 mM de cloreto de cálcio di-hidratado, cloreto de potássio 107 mM, ch de sódio 2,73 Mloride, 19,6 mM de cloreto de magnésio hexa-hidratado, sulfato de magnésio 16,6 mM em 1 L de água estéril). Filtrar em condições estéreis através de filtro de 0,2 um antes de armazenar a 4 ° C.
- Para preparar 1x BSS para uso experimental, diluir 50 ml BSS Estoque 1 e 50 ml da BSS 2, separadamente, em 400 ml de água estéril cada. Combinar as duas soluções diluídas, ajustar até pH 7, e adicionar 20 ml de FBS (2%). Topo até 1 L com água estéril e filtro estéril usando 0,2 m de filtro.
NOTA: soluções de BSS devem ser preparados separadamente, pois a mistura de stocks BSS concentradas diretamente pode resultar em precipitação.
- Glóbulo Vermelho (RBC) Tampão de Lise
- Para preparar tampão de lise dos glóbulos vermelhos, mistura 9 partes de cloreto de estoque de amónio (cloreto de amónio 155 mM em água esterilizada) para uma parte da base Tris (130 mM de Tris (hidroximetil) -aminometano em água estéril, pH 7,65) antes do uso.
NOTA: Loja soluções de estéreis de cloreto de amônio e Tris-base a 4 ° C. Prepare lise bpode ser prejudicado fresco para assegurar a lise eficiente de hemácias.
- Para preparar tampão de lise dos glóbulos vermelhos, mistura 9 partes de cloreto de estoque de amónio (cloreto de amónio 155 mM em água esterilizada) para uma parte da base Tris (130 mM de Tris (hidroximetil) -aminometano em água estéril, pH 7,65) antes do uso.
2. Geração de Linfócitos suspensão de baço ou gânglios linfáticos
NOTA: É importante para preparar todos os reagentes e equipamentos necessários para a experiência antes da eutanásia do rato e para gerar suspensões de células únicas de linfócitos tão rapidamente quanto possível para manter as viabilidades celulares elevadas.
- Euthanize rato experimental por deslocamento cervical ou CO 2 asfixia.
NOTA: A partir desta etapa em diante, todos os procedimentos experimentais devem ser realizados de forma asséptica. - Mergulhe o rato inteiro em 70% de etanol antes de fazer qualquer incisões. Remover os gânglios linfáticos e do baço assepticamente 8, e colocá-los em separadas tubos de 15 ml contendo 5 ml de gelo-frio RPMI / FBS (meio RPMI com SFB a 2%) ou BSS / FBS (a partir do passo 1.2.3).
NOTA: Uma vez que BSS impede eficiente lise RBC, use RPMI para a preparação da suspensão de células do baço e mudar para BSS aftelise r RBC. - Para gerar uma suspensão de células isoladas a partir do baço ou nodos linfáticos, colocar o órgão (s) entre duas peças de estéril de malha 100 uM coador de células numa placa de Petri contendo 2 ml de gelo-frio RPMI / FBS ou BSS / FBS. Usando o êmbolo de uma seringa de 1 ml, triturar o órgão (s) até que tenha sido rasgada em partes muito finas.
- Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e lava-se o filtro de células de malha com gelada RPMI / FBS ou BSS / FBS. Recolhe-se o restante suspensão de células, adicioná-lo para o mesmo tubo de 15 ml, e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.
NOTA: Re-suspender as células peletizadas sacudindo o tubo com os dedos antes de adicionar tampão de lise RBC ou médio nas etapas subsequentes. - Preparar tampão de lise temperatura ambiente (RT) RBC durante a centrifugação da suspensão de células (ver passo 1.3.). Após a peletização das células e remoção do sobrenadante, re-suspender as células com 1 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos para cada 10 8 células. incuBATE a reacção de lise à TA durante 3-4 min.
- Pare a lise de RBC com 14 ml de gelo-BSS frio / FBS e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C.
3. Purificação de células B e T
- A purificação de células B
- Contar as células usando um hemocitômetro. Re-suspender até 10 8 células esplênicas em 300 ul BSS / FBS e adicionar 50 ul anti-CD43 microesferas magnéticas 9,10. Para remover as células mortas, adicionar 30 ul anexina V esferas magnéticas. Incubar a suspensão de células num frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
- Purificação de células T
- Contar as células usando um hemocitômetro. Re-suspender-se a 10 8 células em não-T cocktail de anticorpos de depleção de células (anticorpos biotinilados contra CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 e CD4 ou CD8, dependendo da população de células alvo para ser purificado), diluído 1: 200 em 200 ul BSS / FBS a 4,5. Incubar a suspensão de células numa4 ° C frigorífico durante 15 min.
- Após incubação, adicionam-se 10 ml de BSS / FBS para lavar as células e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 165 ul de BSS / FBS a 30 com micro-esferas de estreptavidina ul e 15 ul anexina V esferas magnéticas. Incubar a suspensão de células num frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
NOTA: Para assegurar mesmo marcação com as microesferas magnéticas, incubar as células com microesferas durante 15 minutos, em seguida, misturar a suspensão de células suavemente batendo no tubo de 15 ml e incubar mais 15 minutos durante o passo 3.1.1. ou 3.2.2.
- Preparação da coluna de separação para a purificação celular
- Prepara-se uma coluna de separação não utilizada, durante a etiquetagem micropérola das células (passo 3.1.1. Ou 3.2.2.). Pré-aquecido BSS (sem FBS) à temperatura ambiente e utilizar 2 ml de lavar e equilibrar a coluna em condições assépticas. Após o equilíbrio com BSS, a coluna lavada não devem ser deixadas a secar fora.
NOTA: Nós usamos os LS column em vez da coluna LD recomendada, devido à sua possibilidade de reutilização (ver passo 3.4.). - Após marcação com as esferas magnéticas, adicionar 14 ml de BSS / FBS para lavar as células e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e re-suspender as células em 1-3 ml RT BSS.
- Anexar uma agulha estéril 21 L para a ponta da coluna de reduzir a taxa de fluxo durante o processo de purificação. Carregar a suspensão de células na coluna equilibrada e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados.
Nota: Evite a introdução de bolhas na coluna durante o carregamento. - Lava-se a coluna uma vez com 1 ml de BSS / FBS e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Recarregar a coluna com o fluxo através de uma vez. Recolhe-se o fluxo através após a segunda carga no mesmo tubo de 15 ml.
- Lavar a coluna 3 vezes com 1 ml de BSS / FBS e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Depois disso, adicionar 5 ml de BSS / FBS a the coluna e, com um êmbolo, lave as células magneticamente marcadas para fora da coluna para um novo tubo de 15 ml.
- Verifique a pureza das células recolhidas por citometria de fluxo utilizando anticorpos que se ligam a antigénios purificados de células T 4,5 B ou superfície.
- Prepara-se uma coluna de separação não utilizada, durante a etiquetagem micropérola das células (passo 3.1.1. Ou 3.2.2.). Pré-aquecido BSS (sem FBS) à temperatura ambiente e utilizar 2 ml de lavar e equilibrar a coluna em condições assépticas. Após o equilíbrio com BSS, a coluna lavada não devem ser deixadas a secar fora.
- Re-usando a coluna de separação
NOTA: A coluna LS pode ser reutilizado até 4 vezes sem afectar a eficiência da purificação.- Lavar a coluna 3 vezes com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 3 vezes com 5 ml de água destilada a partir do topo usando o êmbolo.
- Lavar a coluna com 5 ml de etanol a 70% e seca-se a coluna extensivamente usando uma torneira de ar para evitar a formação de ferrugem na coluna.
- Para preparar uma coluna LS usado para uma experiência de purificação separada, lavar a coluna de baixo para cima com 5 ml de etanol a 70% utilizando o adaptador de seringa. Em seguida, lava-se a coluna a partir de baixo para cima duas vezes com 5 ml de PBS estéril, seguido de 5 ml de PBS, uma vez a partir do topo da coluna. Adicionar 2ml RT BSS para equilibrar a coluna e depois prosseguir para carregar a coluna com células marcadas.
4. CFSE Labeling e Estimulação
NOTA: Purificado células podem ser submetidas a uma variedade de ensaios in vitro e em ensaios funcionais in vivo. Aqui, utilizamos células T purificadas para determinar a capacidade de estimulação de célula T de APCs 5.
- solução pré-aquecido rotulagem (0,1% de FBS em PBS) a 37 ° C antes do carregamento CFSE.
NOTA: Usando uma baixa percentagem de FBS em PBS reduz a morte celular durante CFSE carga e minimiza a perda de células durante a centrifugação. No entanto, muito FBS pode interferir com carga CFSE. - Lavar as células purificadas duas vezes com solução de rotulagem, em seguida, re-suspensas a 2 x 10 7 células / ml na solução de marcação pré-aquecido em um tubo de 15 ml.
- Preparar solução de 10 uM CFSE (diluição 1: 500 de CFSE 5 mM de solução de reserva) em solução de etiquetagem pré-aquecido. solução CFSE deveser preparada a cada vez para alcançar rotulagem ideal.
- Para carregar as células com CFSE, adicionar uma suspensão de células parte para 1 parte de solução de 10 uM CFSE em um tubo de 15 ml e incuba-se no escuro durante 10 min a 37 ° C. Uma concentração final de 5 uM CFSE é utilizado para marcar 1 x 10 7 células / ml.
- Inverter o tubo a cada dois minutos para assegurar uma mistura homogénea de células durante o carregamento CFSE.
- Para parar a reacção, adicionar vários volumes de meio RPMI completo gelada e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Após o bem sucedido CFSE carregamento, o sedimento celular aparece amarelado.
- Lavar as células CFSE carregado mais uma vez com meio RPMI completo gelada e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C antes de utilizar para a cultura in vitro ou in vivo estimulação.
5. estimulação in vitro Em
- Preparar uma solução 2x estoque de estímulos (2x estímulos solução estoque) imediatamente antes da utilização de modo a que 100 ul de solução de estoque 2x estímulos pode ser adicionada a 100 ul de células até um volume final de 200 ul por poço numa placa de 96 poços.
- Se é necessária uma placa revestida com estímulos (IgM ou CD40 para células B ou CD3 e CD28 para as células T), dilui-se os estímulos em PBS e pré-revestimento da placa de cultura a 4 ° C durante a noite. Em alternativa, a placa de cultura podem ser revestidos a 37 ° C durante 1 hora no dia da experiência. Lave a placa revestida duas vezes com PBS (Não permita que o prato para secar a qualquer momento).
| Para as células B | |
| estímulos | A concentração final |
| F (ab ') 2 de cabra anti-IgM de ratinho | 0,6-2,4 ug / ml |
| Anti-ratinho CD40 mAb | 0,5-2 ug / ml |
| recombinanterato IL-4 | 25 U / ml |
| lipopolissacarídeo | 0,1-10 ug / ml |
| (LPS) de E. coli serotipo 055: B5 | |
| Para as células T | |
| estímulos | A concentração final |
| Anti-CD3 (placa revestida) | 2-10 ug / ml |
| (50 ul / poço para o revestimento) | |
| Anti-CD28 (placa revestida) | 2 ug / mL |
| IL-2 recombinante | 40 U / ml |
| PDBu (éster de forbol) | 5-50 ng / ml |
| A23187 (ionóforo de cálcio) | 250 ng / mL |
Quadro 1: Concentrações de estímulos utilizados para estimular os linfócitos em cultura in vitro.
- Para as células B CFSE-rotulados, re-suspender a 3 X 10 6 células / ml em meio RPMI completo e a cultura em triplicado com 3 x 10 5 células / poço em placas de 96 poços de fundo plano, durante 72 h.
- No caso de células T marcadas com CFSE-, re-suspender a 0,5-3 x 10 6 células / ml em meio RPMI completo e a cultura em triplicado com 0,5-3 x 10 5 células / poço em placas de 96 poços de fundo redondo de 48 ou 72 hr .
6. Promoção Vivo Em
- Para a estimulação in vivo, transferência adoptiva 4 x 10 6 células T CFSE marcados por ratinho (por via intravenosa (IV) em 200 ul de PBS) em cada rato receptor semelhantes em MHC.
NOTA: Neste protocolo, as células T CFSE rotulados podem ser adoptively transferidos usando veia da cauda ou injeção retro-orbital como essas células vão para casa para linfóides órgãos como o baço e os linfonodos. - Desafiar os ratos receptores um dia mais tarde com o antigénio.
NOTA:Neste exemplo, usamos a ovalbumina (OVA proteína, 50 ug / ratinho) como antigénio específico porque OVA-, receptor de células T (TCR), as células T foram -transgenic adoptivamente transferidos para ratinhos receptores. Prepare proteína OVA em PBS estéril e injectar 100 ul de proteína OVA / PBS ou PBS de controlo, por meio de injecção subcutânea (Si), em cada rato receptor 5. - Colheita e gerar suspensões individuais de células de órgãos linfóides (nódulos linfáticos e baços de ratinhos receptores) 3 dias após a imunização com a proteína OVA ou PBS. linfonodos separar em nodos linfáticos proximais (PLN), que inclui axilar, braquial e nódulos linfáticos cervical superficial) e nódulos linfáticos distais (DLN), que inclui mesentérica, popliteal, inguinal, lombar, e nódulos linfáticos caudal. células mancha usando os anticorpos FACS apropriados para verificar se há a proliferação de células T.
NOTA: Nesta célula experimento de rastreamento CFSE, CFSE marcado com células T de ratinhos de controlo injectados com PBS estabelecer uma linha de base para a fluorescência não-dinecer células. Divisões celulares de proliferação, as células, marcadas com CFSE-estimulado com antigénio são visualizados através da medição de fluorescência picos 12,13. Com o controlo de PBS, o número de divisões celulares de proliferação, as células T CFSE-marcados podem ser determinadas 12,13. - Analisar os dados de proliferação de células marcadas com CFSE, comparando o número de divisões celulares ou picos entre amostras (Figuras 1 e 2).
NOTA: Por exemplo, CFSE marcado, as células T específicas de OVA adoptivamente transferidos para ratinhos receptores que recebem o antigénio OVA vai sofrer proliferação activa em comparação com os ratinhos de controlo injectados com PBS 5,12. Além disso, é de salientar salientar que há muitas maneiras para analisar dados de proliferação de células CFSE, como demonstrado por Hawkins e seus colegas 14.
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Representative Results
purificação magnética de células de linfócitos permite que os utilizadores para purificar uma população de células alvo num período relativamente curto de tempo. Utilizando o nosso protocolo de esgotamento, que foram capazes de aumentar a percentagem de células T CD8 (OT-I em recombinação-activação do gene-1 (RAG-1) -deficient ratinhos) a partir de 72,8% (antes da purificação) a 94,2% (após purificação; Figura 1A) 4,5. Estes linfócitos purificadas podem então ser utilizadas para ensaios funcionais a jusante para determinar a proliferação de linfócitos e de transdução de sinal de 4,5. Por exemplo, podemos estudar a in vivo T capacidade de estimulação das células de APCs por transferência de células T CFSE marcados, específicos para o antigénio de tipo selvagem em (WT) e murganhos mutantes (MT) imunizados com o antigénio adequado 5.
Em nossa experiência representativa, transferimos purificada, CFSE marcado, ovalbumina (OVA) específicos OT-I T CD8 cells em controlo (WT) e ratinhos mutantes (MT) e imunizados estes ratos um dia mais tarde com a proteína OVA. Três dias após a imunização, eu colhi gânglios linfáticos (proximal e distal) e os baços e as células T analisadas por citometria de fluxo. formas alélicas de CD45 pode ser utilizada para melhor separar a divisória, CFSE-rotulado, doadores células CD8 OT-I a partir de receptores de células não marcadas, T CD8. Neste exemplo, as células dadoras e receptoras são de ratinhos CD45.1 e CD45.2, respectivamente (Figura 1B). Os níveis CFSE de sobrevivência, as células AT-I T não estimuladas neste ponto de tempo são utilizadas para definir o pico de células não-proliferativas (Figura 1C, linha pontilhada). Por estimulação, a intensidade dos níveis em células CFSE OT I-T irá reduzir para metade a cada divisão. Proliferação de células T pode ser, assim, determinada por contagem do número de picos CFSE 6,12. Em nossos resultados representativos, não vemos diferenças nas capacidades de apresentação cruzada de WT e MT APCs (Figura 1C, linhas a cheio), uma vez que as células T proliferam a taxas semelhantes em ambos os ratos.
Numa experiência separada, foi realizada a [3 H] -timidina ensaio para estudar a proliferação das células de controlo e células activado MT T. As células purificadas WT e MT T foram estimuladas com vários estímulos durante 48 horas e pulsadas com timidina [3H] para o final de 8 h. Proliferação de células na fase S do ciclo celular irão incorporar as sequências de nucleótidos marcado radioactivamente, de [3H] -timidina, no ácido desoxirribonucleico recentemente sintetizado (ADN), por conseguinte, utilizando contagem de cintilação líquida, a proliferação celular pode ser medida por [3H] -timidina. O número de contagens por minuto (cpm) correlaciona-se directamente com a quantidade de [3H] -timidina na proliferação de células T. Em nossos resultados representativos, o reduzido número de cpm obtidas a partir de células MT T após estimulação em comparação com counts de células T WT indica uma capacidade proliferativa das células comprometidas MT T (Figura 1D).
Para determinar a capacidade proliferativa de células B, células B esplénicas purificadas utilizando a estratégia descrita depleção. Após a purificação, fomos capazes de aumentar a percentagem de células B220 B (ratos WT) de 63,9% (antes da purificação) para 98,4% (após purificação; Figura 2A) 4. Semelhante ao purificado células T, células B esplénicas purificadas também pode ser usado para ensaios funcionais a jusante para avaliar a proliferação de linfócitos e de transdução de sinal de quatro. Subsequentemente, as células esplénicas que marcado WT B purificadas com CFSE e estas células estimuladas in vitro, utilizando placas revestidas com anti-CD40 suplementado com a citocina IL-4. Três dias depois da estimulação, as células foram analisadas, B activadas viáveis por citometria de fluxo. Os níveis CFSE de sobreviver, as células B não estimuladas neste ponto de tempo são usados paradefinir o pico de células não-proliferativas (Figura 2B, linha pontilhada). Semelhante a células T, a intensidade dos níveis de células B em CFSE irá reduzir para metade a cada divisão 6,12.
Figura 1: Perfis de CFSE adoptivamente células AT-I T purificadas transferidos após a imunização (A) CD4 e CD8 coloração de células isoladas a partir de AT-I;. ratinhos RAG-1-deficiente antes (painel superior) e depois de (painel inferior) a depleção de células não-T. (B) parcelas de FACS representativos de células T do baço (SP), gânglios linfáticos proximais (PLN) e nódulos linfáticos distais (DLN). Doadores células AT-I T CD8 são CD45.1 positivas. Perfis (C) Representante CFSE de células transferidas, CFSE marcado OT-I T do doador de baço (SP), gânglios linfáticos proximais (PLN) e gânglios linfáticos distais (DLN) de WT (curvas sombreada) eMT (linhas sólidas) ratinhos receptores 3 dias após a imunização com a proteína OVA e LPS. A linha pontilhada indica células OT-I T dos ratinhos receptores WT sem vacinação (PBS injetado). (D) A proliferação de células de controlo activado ou células MT T conforme medido pelo ensaio de incorporação de [3H] -timidina. Os resultados são apresentados em contagens por minuto (cpm). Purificada controlo (barra aberta) ou MT (barra a cheio), as células T foram incubadas durante 48 h em apenas meio (meio) ou na presença de ligado a placa de anti-CD3 ou anti-CD3 mais anti-CD28, com ou sem IL recombinante 2. Activação de células policlonal foi desencadeada pela PMA (éster de forbol) e A23 (ionóforo de cálcio). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Perfil de CFSEAs células B após estimulação in vitro. (A) B220 e CD3 de coloração de células esplénicas de ratinhos WT isolados antes (painel superior) e depois de (painel inferior) a depleção de células não-B. (B) perfil representativo CFSE CFSE de WT-marcada (curva sombreada) células B esplénicas após 3 dias de estimulação in vitro com placas revestidas com anti-CD40 e IL4. A linha pontilhada indica células WT B CFSE rotulados sem estimulação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, demonstramos um procedimento para a purificação de linfócitos de órgãos linfóides. purificação celular utilizando esférulas magnéticas triagem é um método rápido e simples que produz células alvo viáveis, altamente purificados.
Passos críticos dentro do Protocolo
A viabilidade celular e rendimento celular
Mantendo a viabilidade das células de linhagem hematopoiéticas in vitro é fundamental para garantir experiências bem sucedidas e reprodutíveis. Químicos e reagentes biológicos, condições experimentais sub-óptima ou condições impróprias de armazenamento de órgãos extirpados podem afetar a viabilidade celular. Após a excisão a partir de ratinhos, órgãos linfóides precisam ser armazenadas em gelo e suspensões de células únicas preparadas o mais rapidamente possível. centrifugação de alta velocidade de suspensões de células também deve ser evitada. Além disso, os sedimentos celulares deve ser solto por um movimento súbito tubos com os dedos após a remoção de sobrenadante. Não érecomendado para re-suspender as pelotas directamente com grandes quantidades de meio por pipetagem.
Aproximadamente 2-4 x 10 7 células do baço B e 2 x 10 7 células T a partir de todos os nódulos linfáticos grandes pode ser isolado a partir de um ratinho WT 8-10 semanas de idade. redução do número de purificado B e células T (abaixo do valor esperado) indica condições sub-ótimas, como mencionado anteriormente.
pureza celular
A pureza média de células isoladas usando este protocolo está dentro da gama de 90 a 95%, que é suficientemente puro para posterior in vitro ou in vivo (Figura 1A). É aconselhável não sobrecarregar a coluna de separação com um número excessivo de células durante o processo de separação, pois isso pode comprometer a pureza celular devido à capacidade de ligação limitada da coluna.
Qualidade de FBS
oqualidade de FBS usadas para suplementar o meio de cultura é crítico para a sobrevivência in vitro de linfócitos. FBS a partir de diferentes fontes e os lotes podem variar na sua capacidade de suportar em respostas de linfócitos in vitro. Portanto, é importante para testar diferentes tipos de FBS a encontrar um que dá resposta específica de alta com baixo fundo. Um número substancial de garrafas devem, então, ser reservada como um estoque.
Modificações e resolução de problemas
Condições de rotulagem CFSE
Embora a rotulagem CFSE funciona em RPMI simples, verificou-se que utilizando uma baixa percentagem de FBS em PBS reduz a morte celular durante o processo de carregamento, sem comprometer a eficiência de rotulagem. Além disso, a presença de FBS minimiza a perda de células durante a centrifugação.
Um aspecto importante da rotulagem CFSE consiste em assegurar mesmo rotulagem das células, a fim de visualizar o pico distintos que representam a divisão celular. A sobrecarga de CFSE poderia resultar num aumento da morte celular in vitro ou fraca recuperação das células marcadas in vivo. Por outro lado, insuficiente rotulagem CFSE ou heterogeneidade na suspensão de células alvo durante o processo de rotulagem podem resultar em mal resolvido CFSE picos 12. Portanto, é importante optimizar as condições de rotulagem CFSE. A quantidade de CFSE utilizado para a rotulagem deve ser mantido o mais baixo possível para reduzir potenciais efeitos tóxicos da sobrecarga, mas ainda alcançar rotulagem suficiente para detectar picos bem resolvidos com a estimulação dentro do prazo experimental. Além disso, para evitar picos mal resolvido, aglomerados de células deve ser removido a partir de suspensões de células individuais antes de CFSE carregamento.
Aglomerados de células e perda de células
É crucial assegurar que as células são totalmente re-suspenso antes de prosseguir para a próxima etapa porque o remova perpétual de aglomerados de células durante a experiência reduz drasticamente o número de células. aglomerados de células são normalmente associados com a viabilidade celular reduzida ou inadequada re-suspensão da pelota celular.
CFSE e espectros de emissão sobreposição
células CFSE-marcado pode ser ainda definida com anticorpos fluoróforos ao fim de um dia em cultura, no entanto, estas células marcadas com CFSE ainda permanecem brilhantemente fluorescentes, depois de um dia em cultura. Utilizando combinações de anticorpos conjugados com fluoróforos brilhantes com quantidades mínimas de sobreposição espectros de emissão com CFSE, como ficoeritrina (PE) e ficoeritrina-cianina 7 (PeCy7), proporciona os melhores resultados de coloração. No entanto, a compensação para reduzir o espectro de emissão de sobreposição ainda é necessária. Além disso, devido à elevada intensidade de sinal de CFSE (FL-1 canal) que passa para o canal FL-2, o canal FL-2 tem que ser compensado subtraindo a elevada percentagem de valor FL-2 para conseguir um optperfil imal CFSE. Pode-se referir ao artigo publicado por Quah et al., Que fornece soluções para etiquetagem solução de problemas CFSE e análise dos resultados 12.
Alternativas a CFSE
O espectro de emissão de CFSE restringe a utilização de combinações de CFSE com derivados de fluoresceína, tais como a proteína fluorescente verde (GFP) e anticorpos -conjugated isotiocianato de fluoresceína (FITC). Existem, no entanto, outros corantes de células disponíveis comercialmente com igualmente elevada intensidade de fluorescência e baixa toxicidade em células violeta (CTV, excitação / emissão: 405/450 nm), amarelo (CTY, 555/580 nm), vermelho longínquo (CTFR, 630 / 661 nm ou CPD670, 647/670 nm) e vermelho (PKH26, 551/567 nm). Utilizando corantes rotulagem célula com diferentes espectros de emissão fornece flexibilidade no desenho experimental. Por outro lado, nem todos os corantes de marcação celular acima descritos podem gerar picos de divisão de células distintas. Um estudo comparativo realizado usandovários corantes de rotulagem de células concluiu que CTV é uma melhor substituição para CFSE CTV porque permite a detecção de um número maior de picos de divisão celular claramente definidos 13.
limitações
A principal limitação do separação de células magnéticas é que ele só é adequado para separação de células simples. No nosso exemplo, poderíamos usar CD43 para esgotar todas as células não-B do baço; No entanto, não seria capaz de separar as células B foliculares a partir de células B da zona marginal. Estas sub-populações só pode ser definido com vários marcadores de superfície. Embora seja possível para seleccionar positivamente as células usando células magnética triagem baseada em vários marcadores de superfície, que é dependente de reagentes especialmente preparados, comercialmente disponíveis, que permitem a libertação de microesferas a partir de células alvo após a primeira ronda de triagem antes de prosseguir para o segundo marcador. Assim, o utilizador seria completamente dependente dos kits disponíveis comercialmente. Em tal caso, FACS ié muito mais vantajoso na separação de populações de células refinados.
Significado da Técnica
Abordagens de separação de células baseados em anticorpos, tais como separação de células magnético e de FACS, a célula são mais fiáveis triagem técnicas até à data 15. Outros métodos de separação de células existem, incluindo técnicas baseadas em densidade e aderência à base, no entanto, os linfócitos são as células fracamente aderentes e suas subpopulações são relativamente semelhantes em densidade, assim adherence- e técnicas são ou não aplicável à base de densidade ou são muito ineficientes 15 .
Como mencionado na introdução, viabilidade rápida, simples, alta de células, e independente de qualquer equipamento sofisticado são as características vencedoras de célula magnética triagem mais de FACS. Em particular esgotamento, negativo utilizando células magnética triagem rótulos e esgota as células indesejáveis, utilizando uma coluna de separação magnética, enquanto isola as células-alvo com modificatio mínimans a superfície da célula e manter o estado ingénuo.
Aplicações futuras
Os linfócitos altamente enriquecido, viáveis, e naive purificadas utilizando esta técnica de purificação com base magnética pode ser submetido a vários ensaios funcionais de comportamento de linfócitos e os mecanismos de sinalização, in vitro e in vivo. Neste protocolo, foi demonstrado utilizando dois ensaios de proliferação de células diferentes - [3 H] -timidina e ensaio de incorporação de ensaio de proliferação de células CFSE - para investigar as capacidades proliferativas celulares de linfócitos activados.
A escolha entre [3 H] -timidina e ensaio de incorporação de ensaio de proliferação de células CFSE depende em grande parte do tamanho da amostra e das condições experimentais. Utilizando a [3 H] -timidina ensaio em experimentos com grandes tamanhos de amostra gera dados de proliferação celular de alto rendimento. A fim de assegurar a óptima [<sup> 3 H] -timidina e reprodutibilidade dos resultados, [3H] -timidina deve ser adicionado à cultura, quando a maioria das células estão em divisão activa. Optimização do protocolo de marcação é necessário para os diferentes tipos de células e de estímulos. Além disso, devido à natureza radioactiva de [3H] -timidina, este ensaio de incorporação só podem ser realizados in vitro, ao contrário de rotulagem CFSE de células, que podem ser activadas in vitro (Figura 2B) ou adoptivamente transferidos para ratinhos receptores (Figura 1B e 1C).
O ensaio de proliferação celular CFSE, por outro lado, oferece mais informações sobre a proliferação celular de [3 H] -timidina. Uma vez que a intensidade de CFSE em células marcadas com CFSE reduz para metade a cada divisão celular, pode-se determinar o número de divisões de células e a percentagem de células em cada divisão por contagem do número e tamanho dos picos
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Acknowledgments
O estudo é apoiado pelo Ministério da Educação, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 e Tier2-MOE2013-T2-2-038). O manuscrito foi editado por Amy Sullivan de Obrizus Communications.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
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