Protocol
Alla möss föds och hålls under specifika patogenfria förhållanden och alla mus-protokoll genomförs i enlighet med riktlinjerna i Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Framställning av buffertar och reagens
- Förbereda komplett Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (100 lU / ml) / streptomycin (100 | ig / ml), 55 ^ M 2-merkaptoetanol ).
- Förbered 20x balanserade saltlösning (BSS) Lager 1 och Lager 2 separat.
- Förbered 20x BSS lager 1 (111 mM dextros, 8,8 mM kaliumfosfat, 26,7 mM natriumfosfat dibasisk i en L sterilt vatten) och tillsätt 40 ml 0,5% fenolrött till 20x BSS lager 1 före den slutliga volymjustering. Sterilt filter med 0,2 pm filter före lagring vid 4 ° C.
- Förbereda 20x BSS lager 2 (25,8 mM kalciumklorid-dihydrat, 107 mM kaliumklorid, 2,73 M natrium chloride, 19,6 mM magnesiumklorid-hexahydrat, 16,6 mM magnesiumsulfat i en L sterilt vatten). Sterilt filter med 0,2 pm filter före lagring vid 4 ° C.
- För att förbereda 1x BSS för experimentell användning, späd 50 ml BSS lager 1 och 50 ml BSS lager 2, separat i 400 ml sterilt vatten vardera. Kombinera båda utspädda lösningar, anpassa sig till pH 7, och tillsätt 20 ml FBS (2%). Fylla på till 1 L med användning av sterilt vatten och sterilfilter med användning av 0,2 | j, m filter.
OBS: BSS stamlösningar bör beredas separat eftersom blandning av koncentrerade BSS lager direkt kan leda till fällning.
- Röda blodkroppar (RBC) Lysis Buffer
- För att framställa RBC lyseringsbuffert, blanda 9 delar lager ammoniumklorid (155 mM ammoniumklorid i sterilt vatten) till en del lager Tris-bas (130 mM Tris (hydroximetyl) aminometan i sterilt vatten, pH 7,65) före användning.
OBS: Förvara sterila stamlösningar av ammoniumklorid och Tris-bas vid 4 ° C. Förbereda lys bUffer färska att säkerställa en effektiv lys av de röda blodkropparna.
- För att framställa RBC lyseringsbuffert, blanda 9 delar lager ammoniumklorid (155 mM ammoniumklorid i sterilt vatten) till en del lager Tris-bas (130 mM Tris (hydroximetyl) aminometan i sterilt vatten, pH 7,65) före användning.
2. Framställning av lymfocytsuspensionen från mjälte eller lymfkörtlar
OBS: Det är viktigt att förbereda alla reagenser och utrustning som krävs för experimentet innan musen dödshjälp och generera enstaka cellsuspensioner av lymfocyter så snart som möjligt att upprätthålla en hög celllivsduglighet.
- Avliva experimentella musen genom halsdislokation eller CO 2 kvävning.
OBS: Från detta steg framåt, bör alla experimentella procedurer utföras aseptiskt. - Doppa hela musen till 70% etanol innan du gör några snitt. Ta bort mjälte och lymfkörtlar aseptiskt 8, och placera dem i separata 15 ml rör innehållande 5 ml iskall RPMI / FBS (RPMI med 2% FBS) eller BSS / FBS (från steg 1.2.3).
OBS: Eftersom BSS förhindrar effektivt RBC lys, använd RPMI för framställning av mjälten cellsuspensionen och byta till BSS after RBC lys. - För att generera en enda cell avstängning från mjälte eller lymfkörtlar, placera organ (s) i mellan två bitar av steril 100 ìm cell sil mesh i en petriskål med 2 ml iskall RPMI / FBS eller BSS / FBS. Använda kolven i en 1 ml spruta, mosa organet (s) tills den har rivits i mycket fina delar.
- Överför cellsuspension till ett 15 ml rör och tvätta cell sil mesh med iskall RPMI / FBS eller BSS / FBS. Samla återstående cellsuspensionen, lägga till den i samma 15-ml rör och spinn ner vid 453 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten.
OBS: Åter suspendera pelleterade cellerna genom att ställa röret med fingrarna innan du lägger RBC lyseringsbuffert eller medium i de efterföljande stegen. - Förbereda rumstemperatur (RT) RBC lysbuffert under centrifugering av cellsuspensionen (se steg 1.3.). Efter pelletering av cellerna och avlägsnande av supernatanten, återsuspendera cellerna med 1 ml RBC lyseringsbuffert för varje 10 8 celler. Incubate lys reaktionen vid RT i 3-4 min.
- Stoppa RBC lys med 14 ml iskall BSS / FBS och spinn ner vid 453 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
3. Rening av B- och T-celler
- Rening av B-celler
- Räkna cellerna med användning av en hemocytometer. Återsuspendera upp till 10 8 mjältceller i 300 pl BSS / FBS och tillsätt 50 pl anti-CD43 magnetiska mikropärlor 9,10. För att ta bort döda celler, tillsätt 30 pl Annexin V magnetiska pärlor. Inkubera cellsuspensionen i en 4 ° C kylskåp i 30 min.
- Rening av T-celler
- Räkna cellerna med användning av en hemocytometer. Återsuspendera upp till 10 8 celler i icke-T-cell utarmning antikropp cocktail (biotinylerade antikroppar mot CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 och CD4 eller CD8 beroende på målcellen befolkningen renas), utspädd 1: 200 i 200 pl BSS / FBS 4,5. Inkubera cellsuspensionen i en4 ° C kylskåp i 15 min.
- Efter inkubation, tillsätt 10 ml BSS / FBS för att tvätta cellerna och spinn ner vid 453 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 165 pl BSS / FBS med 30 ul streptavidin mikrokulor och 15 pl Annexin V magnetiska pärlor. Inkubera cellsuspensionen i en 4 ° C kylskåp i 30 min.
OBS: För att säkerställa en jämn märkning med de magnetiska mikrokulor, inkubera cellerna med mikrokulor under 15 minuter, sedan blanda cellsuspensionen försiktigt genom att knacka på 15 ml rör och inkubera ytterligare 15 min under steg 3.1.1. eller 3.2.2.
- Beredning av separationskolonnen för Cell Rening
- Förbered en oanvänd separationskolonn under mikrokorn märkning av cellerna (steg 3.1.1. Eller 3.2.2.). Pre-varm BSS (utan FBS) till RT och använda 2 ml för att tvätta och jämvikt kolumnen aseptiskt. Efter jämviktning med BSS, bör den tvättade kolonnen inte tillåtas att torka ut.
OBS: Vi använder LS column i stället för den rekommenderade LD kolumnen på grund av återanvändning (se steg 3,4).. - Efter märkning med de magnetiska pärlorna, tillsätt 14 ml BSS / FBS för att tvätta cellerna och spinn ner vid 453 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 1-3 ml RT BSS.
- Bifoga en steril 21 G nål till spetsen av kolonnen för att reducera flödeshastigheten under processen för rening. Ladda cellsuspension på den ekvilibrerade kolonnen och samla flödet genom innehållande de renade målceller.
OBS: Undvik att införa bubblor i kolonnen under lastning. - Tvätta kolonnen gång med 1 ml BSS / FBS och samla flödet genom innehåller de renade målceller. Ladda kolonnen med flödet genom ännu en gång. Samla flödet genom efter den andra belastnings i samma 15 ml rör.
- Tvätta kolonnen 3 ggr med 1 ml BSS / FBS och samla flödet genom innehåller de renade målceller. Därefter, tillsätt 5 ml BSS / FBS the kolonn och, med en kolv, spola magnetiskt märkta cellerna ut ur kolonnen in i ett nytt 15 ml rör.
- Kontrollera renheten hos cellerna insamlats genom flödescytometri med användning av antikroppar som binder till ytantigener av renad B eller T-celler 4,5.
- Förbered en oanvänd separationskolonn under mikrokorn märkning av cellerna (steg 3.1.1. Eller 3.2.2.). Pre-varm BSS (utan FBS) till RT och använda 2 ml för att tvätta och jämvikt kolumnen aseptiskt. Efter jämviktning med BSS, bör den tvättade kolonnen inte tillåtas att torka ut.
- Återanvända Separation Column
OBS: LS-kolonn kan återanvändas upp till 4 gånger utan att påverka effektiviteten rening.- Tvätta kolonnen 3 gånger med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 3 gånger med 5 ml destillerat vatten från toppen med hjälp av kolven.
- Tvätta kolonnen med 5 ml 70% etanol och torka kolonnen i stor omfattning med hjälp av en luftTryck för att förhindra uppbyggnad av rost i kolonnen.
- För att förbereda en begagnad LS kolumn en separat reningsexperiment, tvätta kolonnen från botten upp med 5 ml 70% etanol med hjälp av sprutadaptern. Nästa, tvätta kolonnen nedifrån och upp två gånger med 5 ml steril PBS, följt av 5 ml PBS en gång från toppen av kolonnen. Tillsätt 2ml RT BSS att balansera kolonnen och sedan vidare till lastning kolonnen med märkta celler.
4. CFSE märkning och stimulering
OBS: Renat celler kan utsättas för en mängd olika in vitro och in vivo-funktionella analyser. Här använder vi renade T-celler för att bestämma cellstimulering förmågan T från APC 5.
- Pre-varm lösning märkning (0,1% FBS i PBS) till 37 ° C före CFSE lastning.
OBS: Med hjälp av en låg andel av FBS i PBS minskar celldöd under CFSE lastning och minimerar cellförlust under centrifugering. Emellertid kan för mycket FBS störa CFSE lastning. - Tvätta renade cellerna två gånger med märkning lösning, sedan åter suspenderades vid 2 x 10 7 celler / ml i förvärmda märkning lösning i en 15 ml tub.
- Förbered 10 iM CFSE lösning (1: 500 utspädning av 5 mM CFSE stamlösning) i förvärmda märkning lösning. CFSE lösning börberedas varje gång för att uppnå optimal märkning.
- För att ladda celler med CFSE, tillsätt en del cellsuspension till en del 10 iM CFSE lösning i en 15-ml rör och inkubera i mörker i 10 minuter vid 37 ° C. En slutlig koncentration av 5 pM CFSE används för att märka 1 x 10 7 celler / ml.
- Invertera röret varje 2 min för att säkerställa en homogen blandning av celler under CFSE lastning.
- För att stoppa reaktionen, lägga till flera volymer iskall komplett RPMI-medium och spinn ner vid 453 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Vid lyckad CFSE lastningen kommer cellpelleten verkar gulaktig.
- Tvätta CFSE laddade celler en gång med iskallt komplett RPMI-medium och spinn ner vid 453 xg under 5 minuter vid 4 ° C före användning för in vitro-odling eller in vivo stimulering.
5. In vitro-stimulering
- Förbered en 2x stamlösning av stimuli (2x stimuli stamlösning) omedelbart före användning så att 100 | il av 2x stimuli stamlösning kan tillsättas till 100 | il av celler till en slutlig volym av 200 | il per brunn i en 96-brunnsplatta.
- Om en platta belagd med stimuli (IgM eller CD40 för B-celler eller CD3 och CD28 för T-celler) krävs, späd stimuli i PBS och förbeläggning odlingsplattan vid 4 ° C över natten. Alternativt kan odlingsplattan beläggas vid 37 ° C under en timme på dagen för experimentet. Tvätta den belagda plattan två gånger med PBS (Låt inte plattan torka ut när som helst).
| För B-celler | |
| stimuli | slutkoncentration |
| F (ab ') 2-get-anti-mus-IgM | 0,6-2,4 | j, g / ml |
| Anti-mus CD40 mAb | 0,5-2 | ig / ml |
| rekombinantmus IL-4 | 25 U / ml |
| lipopolysackarid | 0,1-10 ^ ig / ml |
| (LPS) från E. coli serotyp 055: B5 | |
| För T-celler | |
| stimuli | slutkoncentration |
| Anti-CD3 (platta belagd) | 2-10 ^ g / ml |
| (50 | j, l / brunn för beläggning) | |
| Anti-CD28 (platta belagd) | 2 | ig / ml |
| Rekombinant IL-2 | 40 U / ml |
| PDBu (forbolester) | 5-50 ng / ml |
| A23187 (Kalcium jonofor) | 250 ng / ml |
Tabell 1: Koncentrationer av stimuli som används för att stimulera lymfocyter i odling in vitro.
- För CFSE-märkta B-celler, återsuspendera till 3 x 10 6 celler / ml i komplett RPMI-medium och kultur i tre exemplar med 3 x 10 5 celler / brunn i 96-brunnars flatbottnade plattor för 72 timmar.
- För CFSE-märkta T-celler, återsuspendera till 0,5-3 x 10 6 celler / ml i komplett RPMI-medium och kulturen i triplikat med 0,5-3 x 10 5 celler / brunn i 96-brunnars rundbottnade plattor för 48 eller 72 h .
6. In vivo-stimulering
- För in vivo-stimulering, adoptivt överföra 4 x 10 6 CFSE-märkta T-celler per mus (intravenöst (iv) i 200 pl PBS) i varje MHC-matchade mottagare mus.
OBS: I detta protokoll, kan CFSE-märkta T-celler adoptivt överföras med hjälp av svansvenen eller retroorbital injektion som dessa celler kommer hem till lymfoida organ såsom mjälte och lymfkörtlar. - Utmana de mottagande mössen en dag senare med antigenet.
NOTERA:I detta exempel använder vi ovalbumin (OVA-protein, 50 | j, g / mus) som antigenet, därför att OVA-specifika, var T-cellreceptor (TCR) -transgenic T-celler adoptivt överförd in i mottagarmöss. Förbered OVA-protein i steril PBS och injicera 100 pl OVA protein / PBS eller PBS-kontroll, via subkutan injektion (si), i varje mottagare mus 5. - Harvest och generera enstaka cellsuspensioner från lymfoida organ (lymfkörtlar och mjälte) av mottagande möss 3 dagar efter immunisering med OVA-protein eller PBS. Separata lymfkörtlar i proximala lymfkörtlar (PLN), vilket inkluderar armhålan, brachialis och ytliga cervikala lymfkörtlar) och distala lymfkörtlar (DLN), vilket inkluderar mesenteriska, Poplietallymfknutor, inguinal, ländryggen, och stjärt lymfkörtlar. Fläcken celler med användning av lämpliga FACS-antikroppar för att leta efter T-cellsproliferation.
OBS: I detta CFSE cell tracking experiment CFSE-märkta T-celler från PBS-injicerade kontrollmöss etablera en baslinje fluorescens för icke-diViding celler. Celldelningar av prolifererande är antigen-stimulerade, CFSE-märkta celler visualiseras genom mätning av fluorescenstoppar 12,13. Med PBS-kontrollen, antalet celldelningar av prolifererande, CFSE-märkta T-celler kan bestämmas 12,13. - Analysera CFSE-märkta cellproliferationsdata genom att jämföra antalet celldelningar eller toppar mellan prover (figur 1 och 2).
OBS: Till exempel, CFSE-märkt, kommer OVA-specifika T-celler adoptivt överförda in i mottagarmöss som fick OVA antigen genomgår aktiv proliferation jämfört med de PBS-injicerade kontrollmöss 5,12. Vidare är det anmärkningsvärt att påpeka att det finns många sätt att analysera CFSE cellproliferationsuppgifter, vilket framgår av Hawkins och kollegor 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magnetisk cell rening av lymfocyter tillåter användare att rena en målcellpopulation i en relativt kort tid. Med vår utarmning protokoll, kunde vi öka andelen CD8 T-celler (OT-I i rekombination aktiverande gen-1 (RAG-1) med brist på möss) från 72,8% (före rening) till 94,2% (efter rening; Figur 1A) 4,5. Dessa renade lymfocyter kan sedan användas för efterföljande funktionella analyser för att bestämma lymfocytproliferation och signaltransduktion 4,5. Till exempel kan vi studera in vivo T-cellstimulering kapacitet APC i genom att överföra CFSE-märkta, antigen-specifika T-celler in i vildtyp (WT) och mutant (MT) möss immuniserade med lämpligt antigen 5.
I vår representativt experiment, överförs vi renade, CFSE-märkt ovalbumin (OVA) specifika OT-I CD8 T ^alnar till kontroll (WT) och mutant (MT) möss och immuniserade dessa möss en dag senare med OVA-protein. Tre dagar efter immunisering, skördade vi lymfkörtlar (proximala och distala) och mjältar och analyserades de T-celler genom flödescytometri. CD45 alleliska former kan utnyttjas för att bättre separera delande, CFSE-märkt, donator OT-I CD8-celler från icke-märkta, mottagande CD8 T-celler. I detta exempel, donator- och mottagarceller är från CD45.1 och CD45.2 möss, respektive (Figur 1B). De CFSE nivåer av överlevande, ostimulerade OT-I T-celler vid denna tidpunkt används för att definiera toppen för icke-prolifererande celler (Figur 1C, prickad linje). Vid stimulering, kommer intensiteten i CFSE-nivåer i OT-I T-celler minskar med hälften med varje division. T-cellsproliferation kan därvid bestämmas genom att räkna antalet CFSE toppar 6,12. I våra representativa resultat, ser vi inte skillnader i tvärpresentations kapacitet WT och MT APC (Figur 1C, heldragna linjer), eftersom T-celler förökar vid liknande hastigheter i både möss.
I ett separat experiment, utförde vi en [3H] -tymidin inkorporering analys för att studera cellproliferation av aktiverad kontroll och MT-T-celler. Renad WT och MT-T-celler stimulerades med olika stimuli för 48 h och pulserades med [3H] -tymidin under den slutliga 8 tim. Prolifererande celler i S-fasen av cellcykeln kommer att införliva radiomärkt nukleotid, [3 H] -tymidin, in nysyntetiserade deoxiribonukleinsyra (DNA), därför, med hjälp av vätske-scintillationsräkning, cellproliferation kan mätas genom [3H] -tymidin upptag. Antalet impulser per minut (cpm) korrelerar direkt med mängden [3 H] -tymidin-upptag i prolifererande T-celler. I våra representativa resultat, det minskade antalet cpm som erhölls från MT T-celler vid stimulering jämfört med counts från WT T-celler indikerar en komprometterad fortplantningsförmågan hos MT-T-celler (Figur 1D).
För att bestämma B-cell fortplantningsförmågan, renade vi mjält-B-celler genom att använda den beskrivna utarmning strategi. Vid rening, kunde vi öka andelen B220 B-celler (WT möss) från 63,9% (före rening) till 98,4% (efter rening, figur 2A) 4. Liknande till renat T-celler, kan renade mjält-B-celler också användas för nedströms funktionella analyser för att bedöma lymfocytproliferation och signaltransduktion 4. Därefter märkta vi renade WT mjält-B-celler med CFSE och stimulerade dessa celler in vitro med användning av plattor belagda med anti-CD40 som kompletterats med cytokinet IL-4. Tre dagar efter stimulering, analyserade vi livskraftiga, aktiverade B-celler genom flödescytometri. De CFSE nivåer av överlevande, är ostimulerade B-celler vid denna tidpunkt används för attdefiniera toppen för icke-prolifererande celler (Figur 2B, prickad linje). I likhet med T-celler, kommer intensiteten i CFSE nivåer i B-celler minskar med hälften med varje division 6,12.
Figur 1: CFSE profiler adoptivt överförd renade OT-I T-celler efter immunisering (A) CD4 och CD8 färgning av celler som isolerats från OT-I;. RAG-1-brist möss före (övre panelen) och efter (undre panelen) icke-T-cell-utarmning. (B) Representativa FACS tomter av T-celler från mjälte (Sp), proximala lymfkörtlar (PLN) och distala lymfkörtlar (DLN). Donator OT-I CD8 T-celler CD45.1 positiva. (C) representant CFSE profiler förts, CFSE-märkt OT-I donator T-celler från mjälte (Sp), proximala lymfkörtlar (PLN) och distala lymfkörtlar (DLN) av WT (skuggade kurvor) ochMT (heldragna linjer) mottagarmöss 3 dagar efter immunisering med OVA-protein och LPS. Streckade linjen anger OT-I T-celler från WT mottagande möss utan immunisering (PBS injiceras). (D) Cell proliferation av aktiverade kontroll eller MT-T-celler, mätt med [3H] -tymidin upptagningsanalys. Resultaten presenteras i impulser per minut (cpm). Renat kontroll (öppna staplar) eller MT (sluten bar) T-celler inkuberades under 48 h i medium enbart (medium) eller i närvaro av plattbundet anti-CD3 eller anti-CD3 plus anti-CD28 med eller utan rekombinant IL- 2. Polyklonal cellsaktivering utlöstes av PMA (forbolester) och A23 (kalciumjonofor). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CFSE profilB-celler vid stimulering in vitro. (A) B220 och CD3 färgning av mjältceller isolerade från WT möss före (övre panelen) och efter (undre panelen) icke-B-cell utarmning. (B) representant CFSE profilen CFSE-märkt WT (skuggad kurva) mjälten B-celler efter 3 dagars stimulering in vitro med plattor belagda med anti-CD40 och IL4. Streckade linjen visar CFSE-märkta WT B-celler utan stimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll visar vi ett förfarande för rening av lymfocyter från lymfoida organ. Cell rening med hjälp av magnetisk pärla sortering är en snabb och enkel metod som ger livskraftiga, mycket renade målceller.
Kritiska steg i protokollet
Cellviabilitet och cellutbyte
Bibehålla lönsamheten av hematopoietiska härstamningsceller in vitro är avgörande för att säkerställa framgångsrika och reproducerbara experiment. Kemiska och biologiska reagens, suboptimala experimentella förhållanden eller olämpliga förhållanden av exciderade organ lagring kan alla påverka cellernas livskraft. Vid excision från möss, lymfoida organ måste lagras på is och enkelcellsuspensioner beredda så snart som möjligt. Höghastighetscentrifugering av cellsuspensioner bör också undvikas. Dessutom bör cellpelletar lossas genom att ställa rör med fingrarna efter avlägsnande av supernatant. Det är det interekommenderas för att återsuspendera pellets direkt med stora mängder medium genom pipettering.
Ungefär 2-4 x 10 7 mjält B-celler och 2 x 10 7 T-celler från alla stora lymfkörtlar kan isoleras från en 8-10 veckor gammal WT mus. Minskat antal av renad B- och T-celler (nedan det förväntade värdet) anger suboptimala betingelser, som tidigare nämnts.
cell renhet
Den genomsnittliga renheten hos isolerade celler med användning av detta protokoll är inom intervallet 90 till 95%, vilket är tillräckligt ren för efterföljande in vitro eller in vivo-experiment (figur 1A). Det är tillrådligt att inte överbelasta separationskolonnen med stora antal celler under processen för separation eftersom detta kan äventyra cell renhet på grund av kolonnen begränsade bindningsförmåga.
Kvaliteten på FBS
Dekvaliteten på FBS används för att komplettera odlingsmediet är kritisk för överlevnaden av lymfocyter in vitro. FBS från olika källor och partier kan variera i sin förmåga att stödja in vitro lymfocytsvar. Därför är det viktigt att testa olika typer av FBS att hitta en som ger hög specifikt svar med låg bakgrund. Ett betydande antal flaskor bör sedan reserveras som en lager.
Ändringar och felsökning
CFSE märkningsvillkor
Även om CFSE märkning fungerar i vanlig RPMI, har vi funnit att användning av en låg andel av FBS i PBS minskar celldöd under laddningsprocessen, utan att äventyra effektiviteten i märkningen. Vidare minimerar närvaron av FBS cellförlust under centrifugering.
En viktig aspekt av CFSE märkningen är att säkerställa jämn märkning av cellerna i syfte att visualisera distinkt topps som representerar celldelning. Överbelastning av CFSE kan resultera i ökad celldöd in vitro eller dålig återhämtning av märkta celler in vivo. Å andra sidan, kan otillräcklig CFSE märkning eller heterogenitet i målet cellsuspensionen under processen märkning resultera i dåligt upplöst CFSE toppar 12. Därför är det viktigt att optimera betingelserna CFSE märkning. Mängden CFSE användas för märkning bör hållas så låg som möjligt för att minska risken för toxiska effekter från överbelastning, men ändå uppnå tillräcklig märkning för att upptäcka fint upplösta toppar vid stimulering inom den experimentella tidsramen. Dessutom, för att undvika dåligt upplösta toppar, bör cellklumpar avlägsnas från enkelcellsuspensioner före CFSE lastning.
Cellklumpar och cellförlust
Det är viktigt att se till att cellerna är helt resuspenderas innan man går vidare till nästa steg, eftersom det eviga flytl av cellklumpar under försöket minskar drastiskt antalet celler. Cellklumpar är vanligtvis förknippas med minskad cellviabilitet eller otillräcklig resuspension av cellpelleten.
CFSE och emissionsspektra överlappar varandra
CFSE-märkta celler kan definieras ytterligare med fluoroforen-konjugerade antikroppar efter en dag i odling, men dessa CFSE-märkta celler fortfarande starkt fluorescerande efter en dag i kultur. Användning av kombinationer av antikroppar konjugerade till ljusa fluoroforer med minimala mängder av emissionsspektra överlappar varandra med CFSE, såsom fykoerytrin (PE) och fykoerytrin-cyanin 7 (PeCy7), ger optimala färgningsresultat. Men till ersättning minska emissionsspektra överlappar varandra krävs fortfarande. Dessutom, på grund av den höga intensiteten av CFSE signal (FL-1 kanal) som spiller i FL-2-kana har FL-2 kanal som ska kompenseras genom att dra den höga andelen av värde FL-2 för att uppnå en optimal CFSE profilen. Man kan hänvisa till artikel publicerad av Quah et al., Som erbjuder lösningar för felsökning CFSE märkning och analys av resultat 12.
Alternativ till CFSE
Emissionsspektrum för CFSE begränsar användningen av kombinationer av CFSE med fluoresceinderivat såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och fluoresceinisotiocyanat (FITC) konjugerad antikroppar. Det finns dock andra kommersiellt tillgängliga cell färgämnen med lika hög fluorescensintensitet och toxicitet låg cell i violett (CTV, excitation / emission: 405/450 nm), gul (CTY, 555/580 nm), långt rött (CTFR, 630 / 661 nm eller CPD670, 647/670 nm) och röd (PKH26, 551/567 nm). Med användning av cellmärkningsfärgämnen med olika emissionsspektra ger flexibilitet i experimentell design. Å andra sidan kan inte alla av de ovan beskrivna cellmärkning färgämnen generera olika celldelnings toppar. En jämförande studie utfördes med hjälp avolika cellmärkning färgämnen slutsatsen att CTV är en bättre ersättning för CFSE eftersom CTV möjliggör detektion av ett större antal tydliga celldelnings toppar 13.
begränsningar
Den huvudsakliga begränsningen av magnetisk cellsortering är att det är endast lämplig för enkel cellsortering. I vårt exempel, kan vi använda CD43 att tömma alla icke-B-celler från mjälte; Men skulle vi inte kunna skilja follikulära B-celler från marginell zon B-celler. Dessa delpopulationer kan endast definieras med flera ytmarkörer. Även om det är möjligt att positivt selektera celler med hjälp av magnetisk cellsortering baserad på flera ytmarkörer, är det beroende av speciellt förberedda, kommersiellt tillgängliga reagens som möjliggör frigörande av mikrokulor från målceller efter den första omgången av sortering innan du går vidare till andra markör. Således, skulle användaren vara helt beroende av de kommersiellt tillgängliga kit. I ett sådant fall, FACS iär mycket mer fördelaktigt att separera raffinerade cellpopulationer.
Betydelsen av teknik
Antikroppsbaserade cellsortering metoder, såsom magnetisk cellsortering och FACS, är den mest tillförlitliga cellsortering tekniker hittills 15. Andra metoder för cellseparation finns, inklusive densitetsbaserade och vidhäftningsbaserade tekniker är emellertid lymfocyter är dåligt vidhäftande celler och deras subpopulationer är relativt lika i densitet, vilket sålunda adherence- och densitet-baserade tekniker är antingen inte tillämpliga eller är väldigt ineffektiva 15 .
Som nämnts i inledningen, en snabb, enkel, hög cellviabilitet, och oberoende av någon sofistikerad utrustning är de vinnande funktioner av magnetisk cellsortering över FACS. Särskilt negativ utarmning med hjälp av magnetisk cellsortering etiketter och utarmar oönskade celler med hjälp av en magnetisk separationskolonn, medan isolera målceller med minimal modifications till cellytan och som upprätthåller den naiva tillståndet.
framtida tillämpningar
De höganrikat, livskraftiga, och naiva lymfocyter renas med hjälp av denna magnetiska baserade reningsteknik kan utsättas för olika funktionella analyser av lymfocyter beteende och signalmekanismer in vitro och in vivo. I detta protokoll vi visas med användning av två olika cellproliferationsanalyser - [3 H] -tymidin inkorporering analysen och CFSE cellprolifereringsanalys - att undersöka cellproliferativa kapacitet aktiverade lymfocyter.
Valet mellan [3 H] -tymidin inkorporering analysen och CFSE cellproliferationsanalys beror till stor del på provstorleken och experimentella förhållanden. Utnyttja [3 H] -tymidin inkorporering analysen i experiment med stora provstorlekar ger hög genomströmning cellproliferationsdata. För att säkerställa optimal [<sup> 3 H] -tymidin upptag och reproducerbarhet av resultat, [3 H] -tymidin bör tillsättas till kulturen när en majoritet av cellerna är aktivt delande. Optimering av märkningsprotokoll krävs för olika celltyper och stimuli. Vidare, beroende på den radioaktiva naturen av [3H] -tymidin, kan detta införlivningsanalysen endast utföras in vitro, till skillnad CFSE märkning av celler, som kan aktiveras in vitro (figur 2B) eller adoptivt överförd in i mottagarmöss (Figur 1B och 1C).
Den CFSE cellprolifereringsanalys, å andra sidan, erbjuder mer information om celltillväxt än [3 H] -tymidin inkorporering. Eftersom intensiteten av CFSE i CFSE-märkta celler minskar med hälften med varje celldelning, kan man bestämma antalet celldelningar och andelen celler vid varje division genom att räkna antalet och storleken på topparna
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Studien stöds av undervisningsministeriet, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 och Tier2-MOE2013-T2-2-038). Manuskriptet redigerades av Amy Sullivan från Obrizus Communications.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
- Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765 (2013).
- Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
- Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
- Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
- Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).
