需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

基于流式细胞术的自然杀伤细胞功能检测方法

21.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54615

⸱

2016年10月30日

 ,  ,  , 
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单且可靠的分析方法，可用于检测不同NK细胞亚群的脱颗粒、细胞因子和趋化因子产生等多种NK细胞功能。

摘要

自然杀伤（NK）细胞是人体肿瘤免疫监视系统的重要组成部分。由于具有一组由种系编码的抑制性和活化性受体，NK细胞能够区分健康细胞与病毒感染细胞或恶性转化细胞。当识别到病毒或肿瘤细胞时，NK细胞会启动多种不同的功能，包括对靶细胞的细胞毒性作用，以及产生细胞因子和趋化因子，从而激活其他免疫细胞。已有研究表明，NK细胞功能的正常发挥对于多种病毒感染和恶性疾病的治疗效果至关重要。本文介绍一种基于流式细胞术的简单且可靠的分析NK细胞多种功能的方法。该方法不仅可用于评估整体NK细胞群体的功能，还可用于分析不同NK细胞亚群的功能。该技术使科研人员能够方便地研究健康供体或患者中NK细胞的功能，揭示其在不同恶性疾病中的作用，并进一步发现新的治疗策略。

引言

作为先天免疫系统的一部分，自然杀伤细胞（NK细胞）在抵御病毒感染或恶性转化细胞的第一道防线中发挥重要作用。与T细胞不同，NK细胞通过一套抑制性和激活性受体系统，无需预先接触抗原即可区分健康细胞与异常转化细胞。当识别到靶细胞时，NK细胞会释放其细胞毒性颗粒的内容物例如， 穿孔素、颗粒酶）到免疫突触中以杀伤其靶细胞。此外，NK细胞还能产生并分泌多种细胞因子（例如， 干扰素-γ: IFN-γ；肿瘤坏死因子-α：TNF-α）和趋化因子（例如， 巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β）在靶细胞相互作用或细胞因子刺激下产生1.

自然杀伤细胞（NK细胞）的功能是否充分，例如细胞毒性、趋化因子和细胞因子的产生，对多种疾病的转归具有重要影响。白血病患者若在诊断时表现出NK细胞功能缺陷，包括IFN-γ产生减少以及活化性NK细胞受体表达降低，则复发率升高2。在接受异基因造血干细胞移植的患者中，若NK细胞数量及功能（包括与靶细胞相互作用后细胞因子的产生）能够早期恢复，则与较低的复发率和更高的生存率相关3。此外，在丙型肝炎病毒感染患者启动干扰素治疗后，早期应答者的外周血NK细胞脱颗粒能力强于无应答者4。患有淋巴瘤或多发性骨髓瘤的患者在接受自体造血干细胞移植（autoSCT）后第15天，NK细胞数量（>80/µl）可预测更长的无进展生存期和总生存期5。在黑色素瘤患者中，NK细胞表面表达的T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子-3（TIM-3，一种免疫调节蛋白）的水平与疾病分期和预后相关6。

几十年来，科学家一直在监测自然杀伤细胞（NK细胞）的功能。最初通过51Cr释放实验评估NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，且无需预先致敏7。近年来，科学家开发出一种非放射性方法，用于评估扩增后NK细胞的细胞毒性8。细胞因子和趋化因子的产生通常采用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术进行检测9,10。在过去几十年中，这些方法已与基于流式细胞术的检测技术相结合。通过使用蛋白质转运抑制剂（例如，布雷菲德菌素A和莫能菌素）以及细胞通透化方法，并结合传统的表面染色方案，科学家得以在不同特定淋巴细胞亚群（例如，T细胞、B细胞或NK细胞）中研究趋化因子和细胞因子的产生情况11。此外，已开发出多种基于流式细胞术的检测方法，用于监测T细胞和NK细胞的细胞毒性。2004年，Alter 等报道了NK细胞在接触靶细胞后表面表达溶酶体相关蛋白CD107a（Lamp1），可作为细胞毒颗粒脱颗粒的标志物12。由于目前可获得多种不同的荧光染料和多通道流式细胞仪，现已能够同时在不同NK细胞亚群中检测多种NK细胞功能（如细胞毒性、细胞因子和趋化因子产生）。当样本量有限时，这一能力尤为重要，例如在活检组织或患有白细胞减少症患者的血液样本中。

为了检测自然杀伤（NK）细胞的整体功能，可有效结合多种基于流式细胞术的检测方法。Theorell 等 使用肿瘤细胞系 K562 刺激来自健康供体的 NK 细胞，并通过流式细胞术分析 NK 细胞的脱颗粒作用、由内向外信号传导以及趋化因子的产生13。近期，研究人员利用基于流式细胞术的检测方法，分析了自体造血干细胞移植（autoSCT）期间肿瘤患者体内 NK 细胞的亚群、表型及功能。研究证明，在 autoSCT 后的极早期阶段，NK 细胞即可在识别肿瘤细胞后发生脱颗粒并产生细胞因子/趋化因子11。

本文描述了一种基于流式细胞术的检测方法，用于评估自然杀伤细胞（NK细胞）与肿瘤细胞相互作用后的功能，包括脱颗粒能力、趋化因子和细胞因子的产生，该方法可同时监测不同NK细胞亚群的功能状态。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究遵循法兰克福大学当地伦理委员会的建议进行。

1. K562 细胞的培养

  1. 将K562细胞接种于R10培养基（含谷氨酰胺的RPMI1640培养基，1%青霉素/链霉素，10%胎牛血清）中，以每毫升0.5–1 × 106个细胞的密度置于细胞培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下培养。
  2. 在开始新实验前24小时收集K562细胞。
    1. 从培养箱中取出含有K562细胞的细胞培养瓶，通过轻柔吹打使K562细胞在培养基中重新悬浮。
    2. 将含有K562细胞的培养基转移至15 ml或50 ml离心管中，在400 × g条件下离心8分钟以收集细胞。弃去上清液，加入5 ml R10培养基重悬细胞，并充分混匀。
    3. 取20 µl细胞悬液加入96-U型孔板的一个孔中，加入20 µl台盼蓝溶液，通过反复吹打至少5次充分混匀。取10 µl混合液加入细胞计数板中，进行细胞计数。
    4. 在400 × g条件下离心8分钟收集细胞，用R10培养基重悬细胞，并将K562细胞浓度调整至每毫升0.5–1 × 106个细胞。
    5. 将K562细胞置于细胞培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下孵育，待用。

2. 自然杀伤细胞的分离

  1. 根据当地伦理委员会的批准和指导原则，在采集6-10 ml含EDTA或肝素的外周血之前，须获得健康供体或患者的书面知情同意。
  2. 将NK细胞分离所需的试剂在实验开始前保存于4 °C，实验时在无菌条件下于室温（RT）使用。根据制造商说明书，使用磁性微珠和细胞分离专用磁铁从外周血中分离NK细胞。
    1. 将一管冻干的NK细胞阴性分离抗体混合物用移液管加入7.5 ml随NK细胞分离试剂盒提供的缓冲液A进行重悬。轻轻吹打3–4次混匀。
      注意：每次使用前需确保悬液均匀。
    2. 通过混合步骤 2.2.1 中重悬的沉淀物适量体积与缓冲液 B（NK 细胞分离试剂盒中提供）来配制最终混合液。确定体积时，将全血样本的体积（ml）定义为 1.0。每处理 1 个体积的全血，使用 0.25 个体积的重悬沉淀物（来自步骤 2.2.1）和 0.25 个体积的缓冲液 B。
    3. 将混合物转移至含有全血样本的合适试管中。不要反复吹打，以免血液残留在移液器内造成损失。应关闭管盖，轻轻上下颠倒试管，直至悬浮液均匀。禁止涡旋振荡。
    4. 使用管式旋转仪在室温下进一步均质化样品，持续5分钟。
    5. 在无菌条件下，取下管帽，并按照制造商建议将试管放入磁力分离器中静置15分钟。确保试管标签朝向磁铁背面，以便清晰观察分离界面。分离过程中请勿移动磁铁，以免干扰分离过程。
    6. 小心将上清液转移至新的15 ml离心管中，并用完全培养基（CM；造血细胞培养基，1% 青霉素/链霉素，5% 人血清）补足体积。在400 × g下离心8分钟，沉淀细胞。
      1. 可选：如果沉淀呈红色，将细胞重悬于1 ml红细胞裂解缓冲液中（例如，1 ml 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液：155 mM NH₄Cl4Cl；0.1 mM EDTA；10 mM KHCO₃3 在1 L蒸馏水（DW）中，室温孵育8分钟。或者，使用红细胞去除试剂盒。
        注意：请谨记，使用ACK缓冲液可能对自然杀伤细胞（NK细胞）功能产生负面影响14.
      2. 迅速加入至少1 ml CM以稀释ACK缓冲液，终止裂解反应，然后在400 × g离心8分钟以沉淀细胞。
    7. 将细胞沉淀重悬于1 ml CM中，混匀后进行细胞计数。取20 µl NK细胞悬液加入96-U型孔板中，每孔加入20 µl亚甲蓝溶液，通过上下吹打至少5次充分混匀。吸取10 µl混合液加入细胞计数板中，进行细胞计数。或者，也可使用30 µl未稀释的细胞悬液，采用 commercially available cell counter（商用细胞计数仪）进行计数。
    8. 将细胞调整至浓度至少为 2 x 104 每100 µl CM中的NK细胞数
    9. 对分离的NK细胞群体进行表面抗体染色，利用流式细胞仪检测其纯度。
      1. 根据指定抗体的体积配制主混合溶液 表1.
      2. 将细胞重悬于88.5 µl洗涤缓冲液（WB；0.5%牛血清白蛋白（BSA）、0.1% NaN3 在PBS中加入11.5 µl主混合溶液，于4 °C避光孵育20分钟。
        注意：NaN3 具有毒性且为致突变物。请根据相应的材料安全数据表（MSDS）进行操作。
      3. 加入1 ml WB，于400 × g离心4分钟以收集细胞。
      4. 将细胞重悬于 300 µl 染色缓冲液中，并加入 DAPI。使用流式细胞仪采集细胞数据。
        注意：只有当NK细胞纯度达到所有活淋巴细胞的80%及以上时，方可继续进行后续实验。

3. 收集 K562 细胞用于 NK 细胞刺激

  1. 从培养箱中取出含有 K562 细胞的细胞培养瓶（来自步骤 1.2）。通过轻轻吹打使 K562 细胞在培养基中重新悬浮。
  2. 将全部培养基转移至 15 或 50 ml 离心管中，在 400 × g 条件下离心 8 分钟以收集细胞。弃去上清液，用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，并充分混匀。
  3. 取 20 µl 细胞悬液加入 96-U 型孔板的一个孔中。加入 20 µl 台盼蓝溶液，通过反复吹打至少 5 次充分混匀。吸取 10 µl 混合液加入细胞计数板中进行细胞计数。或者，可使用 30 µl 未稀释的细胞悬液，采用市售的细胞计数仪进行计数。
  4. 在 400 × g 条件下离心 8 分钟收集细胞。将细胞重悬于 CM 培养基中，浓度至少为每 100 µl 培养基含 2 × 104 个 K562 细胞。
    注意：为确保后续效应细胞与靶细胞（E:T）比例为 1:1，需使用相同浓度的 K562 细胞和 NK 细胞。

4. 使用肿瘤细胞系 K562 和细胞因子刺激 NK 细胞

  1. 用移液器将细胞上下吹打至少5次，轻柔混匀。将100 µl的NK细胞悬液加入96孔V型底培养板所需的孔中。
    1. 每个供体至少使用两个孔，一个加刺激物，一个不加刺激物（例如，K562 肿瘤细胞和细胞因子）。实验应尽可能设置至少两个重复，并加入阳性对照（例如， 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）和离子霉素；终浓度：每孔50 nM PMA，1 µM 离子霉素。根据实验当日情况制备最新的流式细胞术补偿设置。
      注意：使用前需对抗体进行滴定（参见讨论部分）。
  2. 关闭光源，向96孔V型板中含NK细胞的每孔加入抗CD107a抗体（2 µl，终浓度：1:100）。
  3. 用移液器将K562细胞上下吹打至少5次，轻柔混匀。
    1. 从含有NK细胞/抗CD107a抗体溶液的孔中，确定计划用K562细胞进行刺激的孔。向这些孔中每孔加入100 µl K562细胞溶液。用移液器轻轻吹打至少5次，充分混匀。
    2. 向含有K562细胞以及NK细胞/抗CD107a抗体溶液的孔中加入白细胞介素-2（IL-2；终浓度100 U/ml）和白细胞介素-15（IL-15；终浓度10 ng/ml）。
      1. 可选：分别测试 K562 细胞或细胞因子对分布的 NK 细胞的影响，以解析肿瘤诱导与细胞因子诱导的 NK 细胞功能。
    3. 确定96孔V型板中未加刺激物的阴性对照孔。向仅含有NK细胞/抗CD107a抗体溶液的这些孔中每孔加入100 µl完全培养基。用移液器轻轻吹打至少5次，充分混匀。
      1. 可选：作为阳性对照，向 NK 细胞/抗-CD107a 抗体溶液孔中加入 100 µl 含 PMA 和离子霉素的 CM（终浓度：每孔 50 nM PMA、1 µM 离子霉素）。
  4. 在37 °C、5% CO₂条件下避光孵育细胞3小时2.
  5. 制备蛋白质转运抑制剂溶液（例如， 在完全培养基（CM）中加入布雷菲德菌素A（brefeldin A）和/或莫能菌素（monensin）。避光条件下孵育1小时后，将该溶液加入96孔V型底板的各孔中（终浓度：0.5–1 µM 布雷菲德菌素A 和 2–3 µM 莫能菌素）。用移液器轻轻吹打至少5次以混匀。继续孵育剩余的2小时。

5. 表面与胞内染色

  1. 3小时孵育后，用移液器轻柔地将96孔V型板各孔中的细胞上下吹打至少5次，混匀，然后转移至流式管中。每管加入1 ml WB缓冲液，于400 × g离心4分钟，沉淀细胞。
    1. 可选：为优化细胞回收率，在将细胞转移至相应的 FACS 管之前，先用 100 µl/孔 PBS 对孔进行清洗，并用移液器反复吹打至少 5 次。
  2. 弃去上清液，继续进行表面染色。
  3. 加入一种对活细胞不透膜、发射波长最大值为423 nm的胺反应性荧光染料，作为可固定的死细胞标记物（DCM）。根据所用DCM的类型，可在抗体表面染色之前（见下文）或同时进行该染色步骤。
    1. 将细胞在 99 µl/管 PBS 中重悬，并加入 1 µl/管可固定的 DCM（终浓度：1:100）。使用涡旋振荡器充分混匀细胞，于室温避光孵育 15 分钟。
    2. 通过混合以下成分制备主混合液： "表面" 所列抗体 表 2 （参见以蓝色高亮显示的染色步骤栏）。使用指定的每管体积，并将其乘以待染色的流式细胞术管数。
    3. 孵育后，取出含有细胞的流式细胞术管，每管加入1 ml WB。在400 × g离心4分钟，使细胞沉淀。
    4. 弃去上清液，将细胞重悬于 84 µl/管的 WB 中，每管加入 16 µl 主混合液。使用涡旋振荡器充分混匀细胞。在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
    5. 20 分钟后，每管加入 1 ml WB，400 × g 离心 4 分钟以沉淀细胞。
  4. 弃去上清液，将细胞重悬于 100 µl/管的冷固定液中（例如， 2%（终浓度）多聚甲醛或甲醛）。使用涡旋振荡器充分混匀细胞。4 °C 避光孵育 10 分钟。
    1. 在此步骤后对细胞进行细胞内细胞因子/趋化因子染色，或在WB中于4 °C下保存过夜。
      注意：过夜孵育后，细胞回收率可能会降低。
      注意：多聚甲醛和甲醛是潜在致癌物。应根据相应的材料安全数据表（MSDS）进行操作。
  5. 在 400 × g 条件下，用 1 ml/管 WB 缓冲液于 4 分钟内洗涤细胞，随后进行透化步骤。
  6. 配制透化缓冲液（PB）（例如， PBS 中含 0.2% 皂苷和 1% BSA 的溶液
  7. 用 1 ml/管 PB 缓冲液在 400 × g 条件下离心 4 分钟，洗涤细胞两次。随后进行细胞内染色。
    注意：皂苷可能具有刺激性。请根据相应的材料安全数据表（MSDS）进行操作。
  8. 使用指定试剂配制预混液 "细胞内" 抗体体积在 表 2 （以绿色标出）。将这些体积乘以待染色的试管数量。
    1. 将细胞重悬于 90 µl/管 PB 中，每管加入 10 µl 抗体混合液。充分涡旋混匀，置于 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  9. 以每管1 ml PB缓冲液，在400 × g条件下离心4 min，洗涤细胞两次。
  10. 弃去上清液，将细胞重悬于400 µl/管的PB中。使用涡旋振荡器充分混匀细胞。将细胞置于冰上避光保存，直至检测。

6. 流式细胞术补偿与数据采集

  1. 在流式细胞术采集软件的参数设置文件夹中，为不同的荧光染料选择相应的通道（参见表2）。此外，选择FSC-A和-H以及SSC-A和-H的通道。
  2. 将为所选参数创建的补偿矩阵载入采集文件。
    1. 使用步骤2.2.8中分离的NK细胞，对每种使用的荧光染料进行单色染色（参见表2），以创建补偿矩阵。采用步骤5.1–5.4中描述的表面染色方案。包括未染色对照（不加任何抗体）、同型对照和/或荧光减一对照（FMO）。
      注意：作为基于细胞补偿的替代方法，可使用IgG结合微球作为补偿对照。
    2. 将每管单染样本及未加抗体的样本放入样本进样口（SIP）。在流式细胞术采集软件中点击"record"按钮，每样本至少采集5 × 103个NK细胞。
    3. 使用流式细胞术采集软件中的补偿计算功能创建补偿矩阵。
  3. 创建点图以鉴定NK细胞群体。
    1. 使用FSC-A/FSC-H和SSC-A/SSC-H点图鉴定单细胞。点击"polygon gate"按钮。在两个点图中均呈线性分布模式的细胞周围绘制门控。双击门控以打开新的点图。
    2. 选择FSC-A/SSC-A点图以鉴定淋巴细胞/NK细胞群体（参见图1）。在其周围绘制多边形门控，并双击该门控。
  4. 将NK细胞刺激实验的每管样本放入SIP。点击"record"按钮，每样本至少采集5 × 103个NK细胞。

7. 分析与统计

  1. 打开流式细胞术分析软件程序。点击加载样本按钮，打开未刺激的对照样本。
  2. 为不同NK细胞亚群创建设门策略（见图1）。
    1. 点击点图按钮，创建FSC-A/SSC-A图。点击矩形门控按钮，在所有FSC-A值>5 × 104的事件上绘制矩形门控，以排除碎片。通过双击该门控打开其内容。
    2. 在新的点图中再次选择FSC-A/SSC-A参数，点击多边形门控按钮。围绕淋巴细胞群绘制一个多边形门控（见图1）。打开该门控。
    3. 为新点图选择SSC-A/SSC-H参数，并围绕所有单细胞绘制一个多边形门控。单细胞在FSC-A/FSC-H和SSC-A/SSC-H参数上呈现线性分布（见图1）。通过双击该门控打开其内容。
    4. 此次使用FSC-A/FSC-H参数，重复步骤7.2.3。
    5. 使用CD45和Dump通道（CD3; CD14; CD19; DCM）排除死细胞。围绕所有CD45阳性且Dump通道阴性的细胞绘制矩形门控。通过双击该门控打开其内容。
    6. 利用CD56和Dump通道参数识别全部NK细胞群体。围绕CD56阳性且Dump通道阴性的细胞创建一个矩形门控。通过双击该门控打开其内容。
    7. 在CD56/CD16点图中，围绕三个NK细胞亚群分别绘制矩形门控。将不同亚群识别为CD56++CD16-、CD56++CD16+和CD56+CD16++ NK细胞亚群。
  3. 分析每个独立NK细胞亚群的功能。
    1. 点击三个NK细胞亚群门控中的任意一个以打开它。创建三个不同的点图：CD56/CD107a、CD56/IFN-γ和CD56/MIP-1β。
    2. 针对CD56阳性细胞，分别绘制矩形门控以圈选同时为CD107a、IFN-γ或MIP-1β阳性的细胞（见图1）。
    3. 对剩余的每个NK细胞亚群重复步骤7.3.1–7.3.2。
  4. 对所有刺激样本重复步骤7.2和7.3。通过点击分析软件中的统计导出按钮，保存每个样本的所有统计值。
  5. 打开包含各样本统计值的文件，以分析NK细胞功能。通过将各NK细胞亚群（例如，CD56++CD16- NK细胞）的数值复制到另一个文件中进行选择。
    1. 从经刺激处理后CD107a阳性NK细胞的百分比中减去未经刺激处理的CD107a阳性NK细胞的百分比。
      注：使用该结果展示该特定NK细胞亚群对刺激的脱颗粒能力。
    2. 对IFN-γ和MIP-1β阳性NK细胞重复步骤7.5.1，以展示其对刺激的细胞因子和趋化因子产生能力。
    3. 对每个剩余的NK细胞亚群重复步骤7.5.1–7.5.2，以评估其在刺激下的脱颗粒能力及细胞因子/趋化因子产生水平。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

用于分析整个NK细胞群体及三种不同NK细胞亚群的脱颗粒、细胞因子和趋化因子产生的设门策略如图1所示。

一名健康供体的代表性结果如图2所示。未受任何刺激的NK细胞既不产生IFN-γ也不产生MIP-1β，且其表面不表达CD107a（图2A）。相反，经肿瘤细胞和细胞因子刺激后，NK细胞产生了大量胞内IFN-γ和MIP-1β，且超过20%的细胞在与肿瘤细胞相互作用后发生脱颗粒，表现为表面表达CD107a（图2C）。PMA和离子霉素刺激作为对照（图2B）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方法是一种简便、快速且可靠的检测健康供体或患者全血样本中自然杀伤（NK）细胞功能的方法。该方法具有显著优势，可直接从全血中纯化NK细胞，避免了其他多种纯化方法所必需的耗时的密度梯度离心步骤15。此外，与"经典"的NK细胞分离/富集方法相比，该方法所需样本量更小，因此特别适用于儿科和/或免疫缺陷患者的样本。本实验方案可用于获取NK细胞功能的基线值（ex-vivo），同时也支持进一步的NK细胞培养与扩增，因而可与其他已有报道的方法相互补充8。然而，实验过程中需注意若干关键步骤。由于该检测依赖于细胞外和细胞内抗体染色，因此首先确定每种抗体的最佳工作浓度至关重要。尤其是细胞内染色，强烈建议对所用抗体进行仔细评估。一种有效的方法是在经PMA/离子霉素刺激或未刺激的细胞悬液中，测试所用抗体的一系列稀释梯度（例如，1:100 至 1:12.5）。随后计算并绘制刺激组与未刺激组之间阳性事件比率的变化。应选择具有最高阳性倍数变化比率（即最佳信号-背景比）的抗体稀释度用于后续实验16。此外，使用同型对照和荧光减一对照（FMO）等对照组，对...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者的研究得到了德国癌症援助基金会（Max Eder青年研究组，Deutsche Krebshilfe；EU）、由德国黑森州高等教育部、研究与艺术部资助的法兰克福细胞与基因治疗LOEWE研究中心（EU, ST）（项目编号：III L 4- 518/17.004）以及德国法兰克福“Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”基金会（EU）的支持。BJ获得了米尔德雷德·舍尔癌症研究基金会（Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research）提供的米尔德雷德·舍尔博士后奖学金资助。ST获得了GO-IN博士后奖学金（PCOFUND-GA-2011-291776）的资助。作者感谢BD公司（Becton Dickinson）为本研究提供了FACSCanto II和Canto10c流式细胞仪分析仪。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640 + 谷氨酰胺Invitrogen6187-044
青霉素/链霉素Invitrogen15140-122
BD Falcon 圆底管BD352008
胎牛血清Invitrogen10270-106使用前需热灭活
T形培养瓶Greiner Bio-One690195
K562 肿瘤细胞系DSMZ GmbHACC 10
氯化铵-氯化钾 (ACK) 裂解缓冲液自行配制/组分在正文中列出
蒸馏水：Ampuwa Spüllösung 1,000 ml PlastipurFresenius Kabi1088813
Megafuge 40R 离心机Heraeus/
EDTA 血液采集管Sarstedt386453S-Monovette 7.5 ml，K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Life Technologies15575-020
造血培养基 (XVIVO)Lonza Group LtdBE04-743Q
人血清DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M /AB血型的健康供体；使用前需热灭活
改进型Neubauer计数板，亮线Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.0640030/ 1110000
台盼蓝溶液 (0.4%)Invitrogen15250-061
含亚甲蓝的3%乙酸溶液Stemcell Technologies 07060
Corning 96孔透明V型底TC处理微孔板Corning 3894
Falcon 96孔圆底未处理微孔板Corning 351177
DPBS（无Ca2+和Mg2+）Gibco Invitrogen14190-169
BSASigma AldrichA2153-100G
NaN3Sigma Aldrich08591-1ML-F
佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯 (PMA) Merck524400-1MG
离子霉素 PromoKinePK-CA577-1566-5
白细胞介素15 (IL-15)PeproTech200-15
Proleukin S (IL-2) Novartis Pharma730523
Golgi Stop，蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）BD Biosciences554724该产品可与Golgi Plug联合使用或替代使用，最佳组合需根据实验条件进行测试。
Golgi Plug，蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素A）BD Biosciences555029
多聚甲醛AppliChemUN2209
皂苷Sigma Aldrich47036
流式细胞仪：Canto10CBD Biosciences/
FlowJoTreeStar Inc./
Graph PadGraph Pad Inc./
MACSxpress 分离器Miltenyi Biotec 130-098-308
MACSxpress NK细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec 130-098-185
MACSxpress 红细胞去除试剂盒，人源Miltenyi Biotec 130-098-196
MACSmix 试管旋转混合仪 Miltenyi Biotec 130-090-753
抗人CD3 APCBiolegend300412
抗人CD3 V450BD Biosciences560366
抗人CD14 PerCPMiltenyi Biotec 130-094-969
抗人CD14 V450BD Biosciences560349
抗人CD16 PEBiolegend302008
抗人CD16 PerCPBiolegend302029
抗人CD19 PE-Cy7Biolegend302216
抗人CD19 V450BD Biosciences560353
抗人CD45 BV510BD Biosciences563204
抗人CD56 FITCBiolegend345811
抗人CD107a PEBiolegend328608
抗人IFN-γ AF-647BD Biosciences557729
抗人MIP-1β APC-H7BD Biosciences561280
DAPIBiolegend422801
Zombie Violet 可固定活力检测试剂盒Biolegend423113可固定的死细胞标记物

参考文献

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583(2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326(2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21(2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448(2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

流式细胞术检测NK细胞分离细胞毒性分析细胞因子产生细胞表面染色细胞内染色效应细胞与靶细胞比例设门策略K562肿瘤细胞
基于流式细胞术的自然杀伤细胞功能检测方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。