genotypning av Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54623

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Hans U. Graber¹

¹Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) är känd som den viktigaste patogenen i världen ansvariga för intramammär infektion (IMI) hos nötkreatur ^1. Studien av Fournier et al. ² visat i schweiziska kor och studier av Cosandey et al. ³ och et al. Boss ⁴ i kor av 12 europeiska länder som S. aureus isolerade från bovin IMI är en genetiskt heterogen grupp. Genom PCR-förstärkning av 16S-23S rRNA intergena spacerområdet (RS-PCR), var en totalt 17 genotyper som ursprungligen upptäcktes i 101 epidemiologiskt oberoende isolat ^2. Genotyp B och genotyp C (GTC) var vanligast (80%), medan de övriga 15 genotyper (GTS) inträffade sällan, var att göra 1-4% av alla isolat. På europeisk nivå ^3, GTB, GTC, GTF, GTI, och GTR var de viktigaste genotyperna omfattar 76% av alla analyserade stammar (n = 456). GTB var beläget i Centraleuropa whereas andra genotyper har spridits. De återstående 24% av stammarna ingår 41 genotyper, många av dem, dock observerades endast en gång.

Studierna av Fournier et al. ^2, et al. Cosandey ^3, och et al. Graber ⁵ visade vidare att genotyper starkt förknippades med deras virulens gen mönster, liksom vid den schweiziska som på europeisk nivå. Studierna visade ytterligare massiva skillnader i IMI prevalens bland S. aureus GTB, GTC och andra genotyper ^2,5: väger GTB, upp till 87% av korna i en hjord infekterades av denna genotyp. I fallet med GTC och av de andra genotyper emellertid IMI hittades endast i ett till två kor i en hjord.

IMI orsakad av S. aureus, resulterar normalt i inflammation i motsvarande mjölkkörtlar och en ökning av inflammatoriska celler i mjölk. Som en konsekvens, den somatiska cell coUNTS i mjölk (SCC), den viktigaste indikatorn för mjölkkvalitet i de flesta länder, ökar vilket leder till en minskad mjölkpris eller ens leverans stopp.

Förutom RS-PCR av Fournier et al. ^2, har andra typningsmetoder beskrivits för subtyp stammar av S. nötkreatur aureus ^11/8. Två vanligaste inkluderar spa-typning ¹² och Multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. Den förstnämnda en är baserad på DNA-sekvensering av den variabla spacerområdet av det stafylokock-spa-genen som kodar för protein A, medan den senare en kräver sekvensering av 7 hushållningsgener. Detta innebär att en ¹² och sju PCR ^13, respektive, behöver utföras, följt av amplikon rening, sekvenseringsreaktion och analys med hjälp av särskild utrustning. Jämfört med RS-PCR, kräver dessa metoder en avsevärd ytterligare insats i laboratoriet som resulterar i en låg provkapacitet och höga kostnader. Degenomströmningen är särskilt låg för PFGE. Med tanke på upplösningen av dessa metoder för stammar av S. nötkreatur aureus, RS-PCR är åtminstone lika bra som spa skriva ⁴ och bättre än MLST ⁴ eller PFGE ^15.

Alla dessa metoder, inklusive binära typning ¹³ visat sig vara effektiva i att få ytterligare insikt i patogenesen av bovin IMI orsakad av S. aureus, men på grund av de nämnda begränsningarna är de mindre lämpliga för stora kliniska undersökningar. Dessutom genotypning av RS-PCR såsom beskrivet av Fournier et al. ² medger tillförlitlig förutsägelse av den epidemiologiska och patogena potential S. aureus inblandad i bovin IMI, två nyckelvärden i klinisk veterinärmedicin.

Protocol

1. Staphylococcus aureus isolat

1. Sprid 10 pl S. aureus stamkultur eller en koloni odlas på ett selektivt medium på Columbia agar plattor innehållande 5% fårblod (BA).
2. Inkubera aerobt vid 37 ° C under 18 h till 24 h.

2. DNA-extraktion

1. Förbereda TEL buffert innehållande 10 mM Tris-HCl och 10 mM _Na2EDTA, pH 8,5. Förbereda alikvoter och autoklavera vid 121 ° C under 15 min.
2. Samla ett koloni från British Airways med hjälp av en steril plastögla eller en steril trä tandpetare och återsuspendera i 100 l TEL. Använd 1,5 ml rör med skruvlock.
3. Inkubera vid 95 ° C under 10 min. Efteråt placera proverna omedelbart på våt is.
4. Späd proverna 1: 100 i _H2O lämplig för PCR (= DNA-templat för PCR). De icke-utspädda och utspädda prover kan förvaras vid -20 ° C under en månad.

3. RS-PCR

H2O, 12,5 | il Taq Master Mix, 2 | il G1-primer 10 | iM, 2 pl L1-primer 10 | iM, och 7 | il mall-DNA som motsvarar ca 30 ng av rent DNA ^2.
1. Kör följande cykelprogrammet i en standard PCR-cycler: 15 min 95 ° C, följt av 27 cykler innefattande 94 ° C under 1 min, följt av en 2 min ramp och hybridisering vid 55 ° C under 7 min. Efter ytterligare 2 min ramp, sträcker sig i 72 ° C under 2 min. Terminate PCR av en slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 min följt av nedkylning till 4 ° C.
   OBS: PCR-produkterna kan lagras vid -20 ° C under 5 dagar.
2. För varje körning av RS-PCR inkluderar en positiv kontroll, det vill säga, ett prov med en känd genotyp (normalt GTB), och en negativ kontroll _(H2O).

4. Elektrofores

1. Använd en kommersiell miniatyriserad elektrofores kit för DNA (MED kit) tillsammansmed en Bioanalyzer ansluten till en dator och den installerade programvaran. Studera motsvarande handböcker tillverkarens noggrant.
2. Konfigurera chip priming stationen och justera sprutklämman enligt manualen från tillverkaren.
3. Förbered gel-dye mix enligt manualen från tillverkaren.
4. Fylla på gel-dye mix (enligt manualen från tillverkaren).
   1. Jämvikta gelén-dye mix till RT under 30 minuter före användning.
   2. Sätt ny DNA-chip på chipet priming stationen. Pipett 9 pl gel-dye i välmarkerade G.
   3. Se till att kolven är placerad på 1 ml och stäng sedan chip priming stationen. Tryck på kolven tills den hålls av sprut klippet. Vänta exakt 30 sekunder släpp sedan sprutan klippet.
   4. Vänta 5 sek. Dra sakta tillbaka kolven till 1 ml läge.
   5. Öppna chip priming station och pipett 9 pl gel-dye i båda brunnarna märkt "G".
5. Fylla på MArker
   1. Pipettera 5 pl markör i alla 12 provbrunnar och i stegen väl. Låt inte någon av dessa 13 brunnar tom.
6. Fylla på stege och prov.
   1. Pipett 1 pl DNA-stege till välmarkerade med stegen tecken.
   2. Pipett 1 l prov (används brunnar) eller 1 pl avjoniserat vatten (oanvända brunnar).
   3. Sätta chipet horisontellt i adaptern och vortex under 1 min vid 2400 rpm.
   4. Kör chip i Bioanalyzer inom 5 min.
7. Köra Analys
   1. Starta Bioanalyzer och den anslutna datorn. Öppna programmet.
   2. Öppna locket på Bioanalyzer och placera chip i chipshållaren (chipet passar bara ett sätt). Stäng locket noga.
   3. I instrumentet inom ramen för programmet för att välja "Electrophoresis"> "dsDNA"> "DNA 7500". Acceptera nuvarande filprefix av programvaran eller ändra det.
   4. Klicka på startknappen finns i programvaran. Ange provnamnen i programvaran. När chipet körningen är klar (efter ca 30 min) End of Run visas i Bioanalyzer programvara.
   5. Ta bort chip och rengöra elektroderna i Bioanalyzer enligt instruktionerna från tillverkaren.

5. Att utgå från den genotyp från elektroforesprofil

1. Ladda Mahal programvara (programvaran är fritt tillgänglig från författarna).
2. Import referensdata i den Mahal programmet: "Fil"> "Importera referensdata"
3. Öppna elektrofores körs i data ramen för Bioanalyzer programvara. Välj en elektroforesprofil ett prov.
4. Kontrollera om de relevanta toppar.
   1. Använd Mahal programvara för att kontrollera om de relevanta toppar: "Verktyg"> "Mean Fluorescence". Sätt in i "Fluorescence" boxfluorescensvärdena anges som fluorescensenheter (FU), eftersom de kan läsas ut från Bioanalyzer programvara. Sätt i 4 (3) toppar med högsta fluorescens i stigande ordning och åtskilda av kommatecken. Exempel: 126.130.132.137.
      OBS: Om inte alla dessa toppar FU anges med Bioanalyzer mjukvara, måste de uppskattas genom att läsa dem ut från observationsområdet.
5. Tryck på knappen "Beräkna". En topp är relevant om den observerade fluorescens överstiger det värde som anges i rutan "Minimal topphöjd".
6. Sluta sig till genotyp.
   1. Sätt in i Mahal TextBox "Ingångs Peaks (bp)" storlekarna i bp av alla relevanta toppar i stigande ordning och åtskilda med kommatecken. Exempel: 440.462.519.579.637.
      OBS: Om inte alla dessa topp storlekar indikeras av Bioanalyzer programvara, måste de uppskattas genom att läsa dem ut från tomten.
7. Tryck på knappen "Beräkna".
8. I listanbox, leta efter den minimala kvadrat mahalanobis avstånd "D2M". Om motsvarande P-värdet rätt till det är ≥0.05 då sannolikheten är ≥5% att nollhypotesen H ₀ förkastas (H _0: den observerade referensprofilen är identiska) vilket innebär att den observerade profil accepteras vara identisk med referensprofilen för den angivna genotyp.
9. Om D2M är minimal men området för motsvarande P-värdet är tom, förkasta H ₀ med en sannolikhet <5%.
   OBS: Detta innebär att profilerna är olika även om D2M är minimal. Ett sådant resultat kan bero på icke-genomsnittliga elektroforesförhållanden.
   1. För att korrigera för dessa avvikelser, infoga i textrutan ", konstaterade Peak (bp)" värdet 395 och tryck på "Beräkna" knappen. Kontrollera igen för minimal D2M och en motsvarande P-värde ≥0.05. Om detta inte lyckas, försök värdena 405, 415, och 425.
      OBS: Ibland mindre steg är ännuanges. Om det fortfarande inte lyckas, inte förekommer i referensdata den observerade profil, kan det vara en ny genotyp eller variant.
10. olika profiler
    1. Upprepa steg 5,6-5,9 för varje elektrofores profil separat.

Representative Results

Definition av en genotyp och dess varianter

En elektroforetisk profil som skiljer sig i mer än ett band från alla identifierade genotyper anses som en ny genotyp. Nya genotyper är namngivna och utökas enligt Fournier et al. ⁵ som leder till genotypema GTA till GTZ, följt av genotyperna GTAA till GTAZ och GTBA till GTBZ, och GTCA till GTCC för närvarande. Variation i bara ett band betraktas som en genotypisk variant. Det indikeras med romerska siffror upphöjd efter namnet på genotypen (t.ex. GTRI, GTRII). Totalt finns det för närvarande 141 genotyper och varianter i botten referensdata.

Under de betingelser som skisserats ovan, RS-PCR av Fournier et al. ⁵ är mycket reproducerbar för att genotypa stammar av S. aureus. Definitiv identifiering av enkänd genotyp eller variant är alltid möjligt om kan uteslutas tekniska problem. Ett typiskt resultat visas i Figur 1 demonstrerar elektrofores av 12 RS-PCR-produkter och presenteras i pseudo-gel-läge genom att den Bioanalyzer programvara. Varje bana kännetecknas av ett mönster av två eller flera PCR-band och ett markörband på framsidan och ett markörband vid slutet. Att dubbelklicka i ett körfält öppnas motsvarande faktiskt uppmätta elektro profil i ett separat fönster. Den Bioanalyzer programvara kan, bland andra möjligheter, de observerade topparna läses som storlek som fluorescerande enheter FU (Figur 2) eller i bp (Figur 3), varvid en topp motsvarar exakt ett band i pseudo-gel läge. Peak läsning i FU krävs för att utvärdera de relevanta topparna av en profil i Mahal mjukvara (Figur 4), läsning i bp för dra slutsatsen genotypen. Irrelevanta toppar definieras i Mahal programvara som liten ärtaks vars observerade fluorescens FU ligger under 40% av det geometriska medelvärdet av de 4 (3) toppar med högsta fluorescens. De är normalt observeras när det finns ett överskott av DNA i RS-PCR (> 30 ng rent DNA / analys) ^2.

Som ett exempel, är genotypen hos provet 211 som föreligger i fig 1 härledas. Visuell analys av den elektroforetiska profilen i figur 2 (Bioanalyzer programvara) och analys med Mahal programvaran med verktyg för att testa för irrelevanta toppar visade 6 relevanta toppar med topp storlekar av 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, och 622 bp (Figur 3). Dessa värden fylls i och separerade med kommatecken i textrutan "Input Peaks (bp)" av Mahal programvara (Figur 4). För att korrigera för run specifika avvikelser, var värdet 415 in i textrutan ", konstaterade Peak (bp)" (Figur 4). Efter att ha tryckt på "Calculate "knappen, en lista presenteras beställts av genotyp tillsammans med fyrkantig mahalanobis avstånd D2M mellan ifråga och indikerade genotypiska profil. Bläddra i listan efter minimal D2M. I förevarande fall är minimal D2M lika med 4,499 (Figur 4) med ett värde på P ≥0.05, vilket innebär att den efterfrågade profilen inte avsevärt skilja sig från den en av GTB.

Varianter av genotyper anges som _i att _XV i Mahal programvaran. I fallet med genotypen B, finns det tre varianter GBT ^I GBT ^II, och GBT ^III indikerade som B_I, B_II och B_III i programvaran (Figur 4).

En krets i MED kit kan analys av produkter av 12 RS-PCR åt gången. Om mindre produkter är tillgängliga, de återstående brunnarna behöver laddas med avjoniserat vatten. Resultaten kan endast tolkas om kontrollerna included i RS-PCR är lämpliga.

Figur 1. Pseudo-gel som representerar 12 RS-PCR-produkter och deras antagna genotyper. Tolv olika stammar av S. aureus analyserades med RS-PCR med användning av MED kit tillsammans med en Bioanalyzer och den medföljande programvaran. Den körfält på vänster sida visar markör eller "stege" för storlek kalibrering av systemet i bp. På toppen av grafiken, provnamnen och motsvarande genotyper är åtalade som erhållits genom Mahal programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Elektro profil sample 161 närvarande i Figur 1. På toppen av topparna den uppmätta fluorescens anges i FU. Visuellt urskiljbara toppar som inte upptäcktes av Bioanalyzer programvara behöver uppskattas genom att läsa dem ut från tomten som utförs för toppen med ett uppskattat fluorescensvärde av 113 FU (i blått). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3. Elektro profil prov 211 närvarande i Figur 1. På toppen av topparna deras storlek anges i bp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Skärmdump på Mahal programmet. I textrutan "Inmatnings Peaks (bp)" topp storlekar prov 211 från figur 3 fylls i. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det mest kritiska steget i hela förfarandet är när det finns ett överskott av DNA i RS-PCR (> 30 ng rent DNA / analys) ^2. I allmänhet, är upplösning av en profil optimalt om alla dess toppar starta och sluta vid baslinjen. Om två toppar är alltför nära varandra, är upplösning ofullständig. Under dessa förhållanden kan Bioanalyzer programvara leda till olämplig topp identifiering så att manuell identifiering krävs.

Alla synligt separerade och relevanta toppar uttryckta som bp eller FU ingår för ytterligare analyser. För mycket mall-DNA för RS-PCR resulterar i breda toppar och därför till topp överlappning och försämrad upplösning av topparna. Dessutom är migration långsammare vilket leder till topp storlekar som falskeligen höjs så att genotypen inte längre kan sluta. Slutligen är antalet irrelevanta toppar större. För profiler med mer än 3 toppar bör toppen med maximal fluorescens normalt inte överstiga 150 FU.

Genotypning av RS-PCR som beskrivits begränsas av det faktum att investeringar i maskiner är nödvändig och den fria Mahal programvara krävs. I själva verket behövs en standard PCR-maskin och Bioanalyzer. Den förstnämnda är ganska billigt nuförtiden, medan den senare är dyrare. Upplösningen av agaros-baserade elektrofores är inte tillräcklig även om hög upplösning agaros används. Under dessa förhållanden är det bara möjligt att skilja mellan GTB, GTC, och alla andra genotyper. Kostnaderna för elektrofores med användning av MED-kit eller agaroselektrofores, dock är likartade. The MED kit tillsammans med Bioanalyzer ytterligare träffar standard agaroselektrofores på ett sätt som den senare metoden är praktiskt, rakt fram, och erhållna data finns i elektronisk form som förenklar lagring och ytterligare analys avsevärt. Huvudsakligen alla kommersiellt tillgängliga bioanalyzers är lämpliga för denna typ av analys, förutsatt att electrophoretic upplösning är tillräcklig och den erhållna storleken av banden är korrekt och opartisk.

Upplösningen av RS-PCR för stammar av S. nötkreatur aureus är hög. Det är lika bra som spa-typning, och bättre än MLST och PFGE ^4,14. Dessutom, jämfört med alla andra typningsmetoder som vanligtvis används för subtypning S. aureus (spa-typning, MLST, PFGE), är dess provkapacitet hög: DNA-extraktion är enkel och snabb, 96 prover kan bearbetas i en RCR körning (normalt O / N) och elektrofores och genotyp dra slutsatsen är rakt framåt. Den fullständiga analysen av 96 prover kräver en natt för PCR och en dag för elektrofores och utvärdering. Andra fördelar med RS-PCR av Fournier et al. ² är de låga kostnaderna, i synnerhet i jämförelse med MLST som kräver sju gener som skall sekvenseras i båda riktningarna ^15. Dessutom är RS-PCR den enda metoden att förutsäga contagiosity och patogenicitet av stammar avS. aureus inblandad i bovin mastit ^2,5, nyckel prediktorer i klinisk veterinärmedicin. Slutligen, ensam är RS-PCR är tillräcklig för att undersöka epidemiologin av bovin S. aureus ^3,4,5,14. Tolkning av data är rakt fram även i ett internationellt sammanhang som endast ett fåtal stora genotyper observeras ^2,3. För epidemiologiska jämförelser mellan nötkreatur och mänskliga stammar, RS-PCR och spa-typning tillsammans är att föredra eftersom den senare metoden används ofta för subtyp mänskliga stammar, så att en hel del data finns tillgängliga. MLST, är emellertid lämplig för att bedöma klonalitet av stammarna ¹⁵ och för fylogenetisk analys ^4.

För felsökning om PCR cykler, MED kit och Bioanalyzer, motsvarande handböcker ska höras. I fallet med RS-PCR-metoden, är felsökning massivt förenklas om lämpliga positiva och negativa PCR-kontroller är inklluded i varje körning. Om den positiva kontrollen är negativ, var PCR-blandningen inte adekvat sammansatt och / eller kontroll-DNA var nedbruten. Om den negativa kontrollen _(H2O) genereras en eller flera band, PCR-blandningen var förorenad med en del DNA. I båda fallen måste profilerna inte tolkas och RS-PCR måste upprepas. Om tolkningen är omöjlig på grund av en elektro problem måste elektrofores som ska upprepas med ett nytt chip. Elektroforetiska problem kännetecknas normalt av otillräcklig migration och inriktning av en eller båda markeringsband till följd av olämplig lastning och manipulerings av chipet. Om den erhållna elektroforesprofilen inte kan tolkas av Mahal programvara, är profilfilen som genereras av Bioanalyzer programvara skickas till författaren för ytterligare utvärdering. Normalt var alltför mycket mall-DNA används för RS-PCR eller profilen representerar en ny genotyp eller genotypisk variant.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'